不同體色草金魚鱗片墨蝶呤還原酶mRNA 表達水平研究

李俊茹， 胡 菊， 馮 彩， 崔長海， 王良炎

（河南師范大學水產(chǎn)學院，河南新鄉(xiāng)453007）

草金魚（Carassius auratus），又稱金鯽魚或正彩鯽，是金魚的原始類型，體形近似鯽魚，是鯽魚的一個變種，屬鯉形目、鯉科、鯽屬，具有觀賞、食用等作用。另外，還可作為金龍魚、銀龍魚等高檔觀賞魚的餌料魚，市場需求量較大[1]。

四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）是墨蝶呤經(jīng)墨蝶呤還原酶（sepiapterin reductase，SPR）及二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）催化后生成，然后生成黃色或紅色的蝶啶色素顆粒[2]。研究發(fā)現(xiàn)，spr的多態(tài)性與爬行動物壁虎的橙色體色有著重要關聯(lián)[2]，另外，在青鳉鱗片不同種類色素細胞中，spr基因的定位也具有顯著差異[3]，spr表達量在斑馬魚發(fā)育過程中隨著黃色素細胞的增多而升高[4]。目前spr在草金魚等其他觀賞魚類中的研究未見報道。本研究以草金魚為實驗對象，通過半定量方法探究spr與體色形成的關系，從而為研究草金魚體色形成的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗對象所用草金魚取自河南師范大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。丁香酚麻醉后，分別對純紅、純白、純黃和純黑草金魚背部鱗片即紅鱗、白鱗、黃鱗和黑鱗進行取材，鱗片浸入加有RNAlaterRTissue Collection（Thermo Fisher公司，美國）的1.5 mL滅菌EP管中，4 ℃過夜后放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取、定量及完整性檢測

按照RNAiso Plus試劑（TaKaRa公司，大連）說明書步驟提取不同顏色草金魚鱗片總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳及紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測提取的RNA完整性。每個樣品取1 μL RNA，ND-2000核酸蛋白儀檢測RNA濃度和OD值，判斷其純度。

1.3 cDNA第一鏈合成

參照PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，大連）進行樣品cDNA反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存，用于半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應。

1.4 spr及內(nèi)參基因β-actin的PCR擴增

根據(jù)定量PCR引物設計原則以及鯉科魚類spr基因CDS區(qū)，通過Primer Plus 3.0（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi）在線網(wǎng)站，設計spr特異性定量引物，β-actin為內(nèi)參基因，引物送上海生工合成，引物信息見表1。

經(jīng)過對引物核苷酸序列及不同退火溫度下PCR產(chǎn)物電泳結果分析，spr基因片斷擴增的最佳退火溫度為58 ℃；β-actin基因片斷擴增的最佳退火溫度為60 ℃。

spr和β-actin基因的PCR反應采用20 μL體系，分別加入4 μL不同顏色草金魚鱗片cDNA，10 μL Premix Taq（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye），上下游引物各0.6 μL（濃度為1μmol/L），加ddH2O至20 μL。反應在Perkin-Elmer 9600熱循環(huán)儀上進行，PCR擴增程序為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，經(jīng)紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。所有樣品分別取3次，進行3次半定量RT-PCR分析，相同結果達到2次以上，以保證實驗的可靠性。

表1 spr PCR引物序列Tab.1 spr PCR primer sequence

1.5 電泳圖片的獲得與定量分析

PCR產(chǎn)物采用EB染色，1%瓊脂糖凝膠電泳結束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照，并用Immage Master VDS Software分析軟件對電泳結果進行定量分析。spr基因相對表達量以spr電泳條帶的IOD（Integrated Optical Density）值與β-actin電泳條帶的IOD值的比值表示。

2 結果

2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

提取的不同顏色草金魚鱗片總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），觀測到清晰的28s、18s rRNA條帶以及模糊的5s rRNA條帶，28s條帶為18s rRNA條帶亮度的2倍，表明RNA完整性較好。ND-2000核酸蛋白儀檢測RNA濃度和OD值，一般以1.8＜OD260/OD280（Ratio，R）＜2.0為標準，以保證RNA質(zhì)量，合格RNA-80 ℃保存用于后續(xù)實驗。

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，通過內(nèi)參基因β-actin驗證（圖2-A），觀測到單一的條帶并放于-80 ℃?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄體系中RNA量均為1 μg，保證了反轉(zhuǎn)錄合成不同的cDNA樣品之間可以達到良好的平行性，以確保半定量RT-PCR實驗的一致性，提高半定量結果的可靠性。

2.2 spr基因在不同顏色草金魚鱗片中的表達

不同顏色草金魚鱗片中spr基因表達情況（圖2）。本試驗對spr和β-actin分別進行了不同顏色鱗片cDNA模板擴增的PCR反應，檢測結果（圖2-A）顯示，spr基因在紅色、白色、黃色、黑色鱗片中均有表達，spr基因的PCR產(chǎn)物電泳條帶亮度在黑色鱗片、黃色鱗片、紅色鱗片中逐級減弱，以在白色鱗片中最弱，用軟件Immage Master VDS Software對電泳條帶進行分析也得到了相同的結果，見圖2-B。

3 討論

草金魚是一種具有經(jīng)濟價值、觀賞價值的魚類，但目前草金魚體色的研究多集中在外部因素上，比如飼料成分、著色劑和飼料添加劑等對體色的影響，另外在草金魚體色保存方面也有研究，但關于遺傳因素對草金魚體色影響的研究較少。蝶啶代謝通路是魚類調(diào)控體色變化的一條重要代謝通路，SPR是其中的一種醛酮還原酶，以NADPH為輔酶催化蝶呤衍生物代謝。在催化BH4合成途徑中，SPR是最后一步反應的必需酶[5]。同時，在補救途徑中，SPR在催化SP分解及BH4合成中也扮演著重要的角色[2]。

關于青鳉的研究顯示，SPR存在于黃色、黑色鱗片上的色素細胞中[4]，在金魚的研究中發(fā)現(xiàn)，金魚黑色素細胞中蝶啶的含量高于紅色素細胞[6]，而spr基因表達水平可間接反映細胞內(nèi)蝶啶含量。純黑草金魚鱗片具有黑色素細胞，純紅、純黃草金魚鱗片具有紅/黃色素細胞和虹彩細胞，純白草金魚鱗片以虹彩細胞為主。研究結果顯示，spr基因在黑色、紅色、黃色鱗片中有較高表達，可能與這三種體色草金魚鱗片包含的色素細胞種類有關即黑色素細胞、黃色素細胞和紅色素細胞，這三種色素細胞均含有蝶啶，而spr的高表達保證了蝶啶的合成[7]。而spr基因在黑色鱗片中表達量最高，可能是黑色素細胞中蝶啶的含量相對于其他色素細胞較多有關，這與在金魚[6]中的研究結果相似。spr在白色鱗片中表達較少，可能由于白色鱗片中虹彩細胞主要合成嘌呤，也可合成一部分蝶啶顆粒（主要是無色的顆粒）的緣故[8]。本研究初步揭示了spr基因在不同體色魚類鱗片中mRNA水平表達情況，為深入探究spr在魚類體色形成中的作用提供了基礎數(shù)據(jù)。