新生大鼠缺氧缺血性腦病中NLRP3的變化①

李 蕊，王顯鶴，張曉波，聶 影

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；佳木斯大學(xué)病理解剖教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

全世界每年約1.4億兒童出生，我國新生兒缺氧缺血性腦病(Hypoxic-ischemic Encephalopathy，HIE)發(fā)病率為：足月活產(chǎn)兒的3‰～6‰，其腦損傷可造成死亡或癲癇、腦癱、認(rèn)知/行為的障礙或智力低下等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1]。其發(fā)病原因復(fù)雜，其中炎癥是其瀑布式級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因素，是能夠激活固有免疫的，這種不適當(dāng)?shù)拈L期神經(jīng)炎癥會導(dǎo)致繼發(fā)性新生兒腦損傷[2]。近年來研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，炎癥小體與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的早期發(fā)生及其發(fā)展密切的相關(guān)[3]。炎癥小體被認(rèn)為是調(diào)節(jié)固有免疫的中心信號樞紐，NOD樣受體(NLRs)存在于胞漿內(nèi)，同時(shí)可以感知細(xì)胞內(nèi)信號，其家族成員包括典型的NLRP1、NLRP3及NLRC4等，非典型即微生物DNA可觸發(fā)的PYRIN 和 AIM2。上述成員與銜接蛋白ASC(即凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白)形成復(fù)合物后，可募集并激活caspase-1。不同的NLR組合具有特異性，特定的組合能夠在機(jī)體受到外界信號刺激或感染時(shí)識別病原體相關(guān)分子模式，或內(nèi)源性危險(xiǎn)信號損傷相關(guān)分子模式。NLPR3炎癥小體激活caspase-1，可促使炎性因子白介素-1β和白介素-18等的分泌，繼發(fā)炎癥反應(yīng)，可造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷。NLRP3激活可以介導(dǎo)各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如阿爾茲海默癥[4]、腦膜炎[5]、腦外傷[6]及腦卒中[7]。但目前對新生大鼠HI腦損傷方面研究較少。因此，本研究基于NLRP3炎癥小體信號通路，觀察其與新生大鼠腦缺氧缺血后神經(jīng)炎癥及腦組織損傷的關(guān)系，探索缺氧缺血性腦組織損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為其免疫調(diào)節(jié)治療提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物： SPF級7d齡Sprague-Dawley(SD)實(shí)驗(yàn)新生大鼠60只，無性別差異，體重在(13±2)g范圍內(nèi)，購置于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。許可證號SCXK(吉)-2018-0007。實(shí)驗(yàn)動物于溫度(23±3℃)、相對濕度保持(60±5)%、12h明暗光交替，自由地進(jìn)行飲水、攝食。

1.1.2 主要試劑和儀器：兔抗NLRP3抗體(Abcam公司)；SABC、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:本實(shí)驗(yàn)將60只SD大鼠，隨機(jī)分為；缺氧缺血性腦損傷組(HIE組)、假手術(shù)組(Sham組)及空白對照組(Control組)，每組20只；每組再分為2個(gè)小組，于實(shí)驗(yàn)開始6h和7d時(shí)間段檢測，每小組10只。

1.2.2 HIE模型建立:HIE組采用改良Rice-Vannuncci法建立：無性別差異的7d齡SD大鼠在加熱墊37℃上，使用乙醚進(jìn)行吸入麻醉，頸部正中偏右縱行5mm切口后，玻璃針對皮下組織、迷走神經(jīng)等逐層分離開，暴露右側(cè)頸總動脈(RCCA)，應(yīng)用5-0號絲線將RCCA近心端、遠(yuǎn)心端永久結(jié)扎間斷。在開始缺氧前將其放回母鼠身邊30min，然后放置于37℃恒溫缺氧箱中給予92%:8%N2：O2(3L/min)缺氧2.5h[8]。Sham組接受相同手術(shù)程序，不給予RCCA結(jié)扎缺血，不做缺氧處理。Control組不做任何處置。研究過程中手術(shù)過程低于10min，為避免體溫過低，環(huán)境處于26～28℃。

1.2.3 小鼠腦組織的獲取:新生SD大鼠分別于6h和7d時(shí)間段取材。開胸后充分暴露心臟，從心尖部插入灌注針頭至左心室，剪開右心耳，快速灌注0.9%NaCl的同時(shí)觀察肝、肺組織，顏色變白、右心耳流出處液體為透明無血色后，灌注4%多聚甲醛，待其四肢抽動及全身組織變硬后取材，打開乳鼠顱腔，仔細(xì)摘取其腦組織，固定于4%多聚甲醛中。

1.2.4 HE染色:進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組神經(jīng)元的形態(tài)改變并拍攝組織圖片。

1.2.5 尼氏染色:尼氏染液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察存活神經(jīng)元數(shù)量和腦細(xì)胞胞漿出現(xiàn)的尼氏小體并拍攝組織圖片。

1.2.6 免疫組化:石蠟切片脫蠟，SABC法進(jìn)行IHC。在高倍顯微鏡鏡下檢查，每指標(biāo)選4張切片，隨機(jī)采集視野5個(gè)檢測，應(yīng)用Image pro plus 6.0分析軟件進(jìn)行平均光密度值(IOD)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腦組織HE染色

Sham組及Control組其新生SD大鼠的大腦皮質(zhì)區(qū)域的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、層次清晰、形態(tài)及數(shù)量正常。胞膜完整，核居中且圓，核仁深，異染色質(zhì)少，未見隨時(shí)間變化出現(xiàn)特殊病理改變。HIE組隨時(shí)間段演變腦組織發(fā)生病理學(xué)變化，即HI后6h，可見大腦皮層區(qū)域的神經(jīng)元數(shù)量減少，周圍腔隙有所擴(kuò)大，毛細(xì)血管管腔可見擴(kuò)張，周圍有紅細(xì)胞聚集。HI后7d，光鏡下明顯可見神經(jīng)元細(xì)胞體腫脹，局部病灶出現(xiàn)壞死神經(jīng)元胞核固縮及碎屑，膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯(圖1)。

A B C

D E F

A為HIE組6h；B為Sham組6h；C為Control組6h;D為HIE組7d；E為Sham組7d；F為Control組7d

圖1 新生SD大鼠HE染色(×400)

2.2 腦組織Nissle染色

Sham組及Control組神經(jīng)元細(xì)胞胞體呈圓形，核仁清晰，胞漿深染，存在密集且深染的尼氏小體。HIE組可見明顯神經(jīng)元受損，部分胞核偏位或溶解，空泡樣表現(xiàn)，尼氏小體染色稀疏且色淺，部分存在中央型尼氏小體消失，嗜堿性顆粒數(shù)量減少，呈現(xiàn)細(xì)塵狀顆粒大小或僅邊緣少量殘留(圖2)。

A B C

D E F

A為HIE組6h；B為Sham組6h；C為Control組6h;D為HIE組7d；E為Sham組7d；F為Control組7d

圖2 新生SD大鼠Nissle染色(×400)

2.3 腦組織中NLRP3蛋白表達(dá)

與Sham組及Control組比較，HIE組新生SD大鼠大腦皮質(zhì)中NLRP3表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，隨時(shí)間變化表達(dá)逐漸增加(P<0.05)。見表1。

表1 3組SD新生大鼠腦組織不同時(shí)間點(diǎn)NLRP3的表達(dá)

3 討論

高發(fā)病率、高致殘率及高致死率是HIE的主要特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅新生兒健康?，F(xiàn)有手段亞低溫治療因其治療時(shí)間窗口窄、最初冷卻最佳時(shí)間、治療深度及持續(xù)時(shí)間仍存在不確定性[9]。因此迫切探尋有效治療方法。炎癥是新生兒缺氧缺血性腦病瀑布式級聯(lián)反應(yīng)的重要因素。缺血缺氧導(dǎo)致腦內(nèi)急性能量衰竭，使腦內(nèi)免疫細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞及微膠質(zhì)細(xì)胞激活，小膠質(zhì)細(xì)胞成為吞噬物的同時(shí)釋放炎癥介質(zhì)，星形膠質(zhì)細(xì)胞造成谷氨酸堆積、離子失衡及分泌各種炎癥趨化因子，最終造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷[10]。腦缺氧缺血過程中存在的能量持續(xù)衰竭，引起腦組織出現(xiàn)代謝改變，即鈣離子內(nèi)流、超載；鈉-鉀泵、鈣泵不良。此為激活NLRP3炎癥小體的重要途徑。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用改良Rice法建立新生大鼠缺氧缺血模型，通過HE及尼氏染色觀察模型組神經(jīng)元減少，核濃縮及碎裂，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生及中央型尼氏小體消失證明模型制造成功。應(yīng)用免疫組化染色方法檢測NLRP3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示與假手術(shù)及正常對照組比較腦組織缺氧缺血后NLRP3炎癥小體于神經(jīng)元胞膜及胞漿NLRP3蛋白表達(dá)水平升高，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺氧缺血可引起炎癥小體NLRP3活化，繼而導(dǎo)致一系列炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)從缺氧缺血急性期6h及進(jìn)展期7d進(jìn)行對照，結(jié)果顯示缺氧缺血組大腦皮質(zhì)中NLRP3進(jìn)展期較急性期表達(dá)增加，考慮與腦組織缺血再灌注有關(guān)。這些結(jié)果提示調(diào)控NLRP3炎癥小體的活化可能是未來干預(yù)新生兒缺氧缺血性腦病發(fā)生及發(fā)展的重要靶點(diǎn)。

與同類研究比較 目前關(guān)于炎癥小體NLRP3信號通路對新生大鼠缺氧缺血性腦病影響的研究尚缺乏，但在其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如神經(jīng)退行性變及腦外傷等有關(guān)于NLRP3炎癥小體對其影響的研究報(bào)道。

研究存在的問題及展望 本研究通過動物實(shí)驗(yàn)觀察缺氧缺血后腦組織病理變化， NLRP3蛋白定位、半定量及定性分析，檢測到NLRP3炎癥小體信號通路在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷過程中存在影響。但缺少更多證據(jù)證明炎癥小體在該疾病的調(diào)控作用，需要未來研究者在分子水平進(jìn)一步拓展研究。本項(xiàng)目的研究為新生兒缺氧缺血性腦病的診斷和治療提供了新的研究方向。