貝母多糖大孔吸附樹脂純化損失率研究

陳品 顧欣 陳珍瑤 閻怡平 廖蕓 張華

摘要?以甘孜川貝母為研究對象，考察單因素（流速、洗脫液體積、上樣體積）和正交試驗中AB-8 型大孔吸附樹脂對純化甘孜川貝母多糖損失率的影響，采用硫酸蒽酮法測定多糖含量。結(jié)果表明，流速、洗脫液體積、上樣體積對甘孜川貝母多糖提取率均有影響，影響效果的因素從大到小依次為流速、上樣體積、洗脫液體積。甘孜川貝母多糖純化損失率最低的最優(yōu)條件為流速1?mL/min、上樣體積4 BV、洗脫液體積為4 BV。可見該優(yōu)化條件下，甘孜川貝母多糖純化損失率降低，提取率明顯提高。

關鍵詞?甘孜川貝母多糖;大孔吸附樹脂;純化;損失率

中圖分類號?R284?文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）14-0173-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.048

Abstract?Ganzi?Fritillaria?was the research object.The single factors （flow rate，elution volume and sample volume） and the orthogonal experiment of polysaccharide purified by the AB-8 macroporous absorption resin were researched.The polysaccharide content was determined by anthrone-sulfate method.The results showed that flow rate，eluent volume and sample volume all had an effect on the extraction rate of Ganzi?Fritillaria?polysaccharides.The influencing order from high to low was the flow rate，sample volume and elution volume.The optimal purification condition with the lowest loss ratio of polysaccharide was 1 mL/min flow rate，4 BV elution volume and 4 BVsample volume.Therefore，under this optimal purification condition，the purification loss ratio of Ganzi?Fritillaria?is reduced，and the extraction rate is significantly improved.

Key words?Ganzi?Fritillaria?polysaccharide;Macroporous absorption resin;Purification;Loss ratio

貝母為百合科（Liliaceae）貝母屬?（Fritillaria）?植物的干燥鱗莖，具有止咳化痰、清熱潤肺之功效[1]。多糖是貝母中的有效活性成分之一，研究表明多糖具有多種生物活性，而且因其在使用過程中沒有任何毒副作用，所以多糖已經(jīng)成為綠色食品添加劑、功能保健品及新藥研發(fā)等新的研究對象[2-3]。大孔吸附樹脂由于受到自身的范德華力或氫鍵的作用，從而產(chǎn)生吸附性，是一種不含交換基團的大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑[4]，其對多糖的純化具有顯著的效果。但是大孔吸附樹脂對多糖的提取純化方法多種多樣，對多糖的提取率也存在差異，導致對多糖的提取率不能得到保證。張華等[5]在貝母粗多糖的4種類型樹脂純化試驗中，顯示貝母多糖提取率較低。為此該試驗以甘孜川貝母為研究材料，用水提醇沉的方法提取粗多糖并用大孔吸附樹脂純化多糖，研究單因素和正交優(yōu)化設計試驗中大孔吸附樹脂純化甘孜川貝母多糖時對其損失率的影響，旨在提高貝母純化多糖的提取率，為貝母多糖相關功能產(chǎn)品的開發(fā)與利用提供理論參考。

1?材料與方法

1.1?試材?甘孜川貝母，購買于四川省南充市嘉陵區(qū)四川農(nóng)貨特產(chǎn)直銷店;乙醇、鹽酸、硫酸、氯仿，重慶川東化工集團有限公司;氫氧化鈉，四川西隴化工有限公司;正丁醇，成都市科龍化工試劑廠;蒽酮，中國試劑網(wǎng)-上海市寧波路54號;無水葡萄糖對照品，成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū);AB-8型大孔吸附樹脂，東鴻化工有限公司。

1.2?儀器?FW80型高速試樣粉碎機，河北省黃市新興電器廠;zxfd-5250十段編程鼓風干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司;722型可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司;FA1004型號電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司;HH.S 精密恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠;往復式水浴恒溫搖床，上海智城分析儀器有限公司。

1.3?試驗方法

1.3.1?甘孜川貝母粗多糖提取。參考姜峻等[6]的方法，將甘孜川貝母干燥樣品用粉碎機將其打成粉末，過60目篩;稱取25 g甘孜川貝母粉末，加入石油醚125 mL回流提取2 h脫脂，取出后過濾取濾渣，放置于烘箱中24 h。稱取20.0 g甘孜川貝母樣品加入蒸餾水，定容至200 mL，放于80 ℃水浴鍋中1 h，用離心機在3 800 r/min離心10 min，過濾取上清液。過濾后的濾渣按照同樣步驟再提取3次。將3次的濾液合并，在80 ℃水浴鍋中濃縮，直到達到其原體積1/3，立即加入無水乙醇，直到達到濃縮液體積的3～4倍，放入4 ℃冰箱進行醇沉24 h。醇沉后取其沉淀，加入蒸餾水溶解沉淀，加入1/3倍體積Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1，?V/V?）振蕩2 min，之后以3 000 r/min 離心10?min，取粗多糖水溶液， 定容至100?mL，得甘孜川貝母粗多糖提取液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2?單因素對甘孜川貝母粗多糖大孔吸附樹脂純化損失率的影響。

1.3.2.1?大孔吸附樹脂的預處理。使用蒸餾水反復沖洗AB-8大孔吸附樹脂以去除表面雜質(zhì)，直到大孔吸附樹脂無法沖洗出泡沫為止;再將大孔吸附樹脂放入無水乙醇中浸泡24 h，接著將大孔吸附樹脂用無水乙醇沖洗，直到溶液不再呈現(xiàn)白色渾濁狀態(tài)為止，再用蒸餾水沖洗大孔吸附樹脂直到溶液無乙醇味;用5% HCl溶液沖洗大孔吸附樹脂直到流出的溶液呈酸性后停止，再放置于5%的HCl溶液中浸泡4 h，接著用蒸餾水沖洗至中性，最后用2%NaOH溶液沖洗大孔吸附樹脂直到流出溶液呈堿性后停止，再放置于5%的HCl溶液中浸泡4 h，接著用蒸餾水沖洗至中性，最后將大孔吸附樹脂浸泡于蒸餾水中，于4 ℃保存?zhèn)溆肹7]。

1.3.2.2?流速對甘孜川貝母多糖純化損失率的影響。直接取“1.3.1”方法制得的粗多糖溶液3 BV上柱，用3 BV乙醇洗脫，按照1、2、3、4、5?mL/min 的流速洗脫，收集洗脫液;之后在洗脫液中加80%乙醇醇沉24 h，3 000 r/min 離心10 min得沉淀，復溶測定多糖含量[8]。

1.3.2.3?上樣體積對甘孜川貝母多糖純化損失率的影響。分別取不同柱體積粗多糖溶液（1、2、3、4、5 BV）上柱，用3 BV乙醇洗脫，按照3.0?mL/min 的流速洗脫，收集洗脫液;之后在洗脫液中加80%乙醇醇沉24 h，3 000 r/min離心10 min得沉淀，復溶測定多糖含量[9]。

1.3.2.4?洗脫液體積對甘孜川貝母多糖純化損失率的影響。直接取“1.3.1”方法制得的粗多糖溶液3 BV上柱，用不同柱體積的乙醇（1、2、3、4、5 BV）洗脫，按照3.0?mL/min 的流速洗脫，收集洗脫液;之后在洗脫液中加80%乙醇醇沉24 h，3 000 r/min離心10 min得沉淀，復溶測定多糖含量[10]。

1.3.3?甘孜川貝母多糖純化正交試驗。在單因素試驗的基礎上，根據(jù)選出的3個合適水平進行正交試驗?？疾炝魉伲ˋ）、上樣液體積（B）、洗脫液體積（C）對多糖損失率的影響。正交試驗的設計方案見表1。

1.3.4?多糖損失率計算。

1.3.4.1?葡萄糖標準曲線的繪制。取0.10 mg/mL的葡萄糖標準溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60?mL分別置于10?mL 具塞試管中，分別加入蒸餾水至2 mL，試管在冰水中冷卻，同時沿試管壁加入蒽酮溶液（0.2 g蒽酮加入100?mL濃硫酸）5?mL后進行搖勻，將搖勻后試管放入100 ℃的水浴鍋中加熱10 min，取出后立刻將試管放在冰水中冷卻5?min，取出試管并在室溫中平衡10 min。在620 nm波長處測定溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.4.2?多糖損失率計算。將純化前和純化后甘孜川貝母多糖溶液均稀釋10倍，分別取稀釋后的多糖樣品溶液2 mL，試管在冰水中冷卻，后續(xù)步驟同“1.3.4.1”[11]。將測定的該多糖溶液吸光度帶入葡萄糖溶液標準曲線建立的方程中，計算多糖含量。多糖損失率的公式如下：多糖損失率=?（M1-M2）/M1×100%，式中，M1?為純化前多糖的質(zhì)量（mg）;?M2?為純化后多糖的質(zhì)量（mg）。

2?結(jié)果與分析

2.1?葡萄糖標準曲線

由圖1可見，通過測定蒽酮硫酸法不同濃度葡萄糖溶液吸光度，得葡萄糖標準曲線?y=0.782x+0.002（R2=0.992）?。

2.2?單因素試驗

2.2.1?上樣體積對甘孜川貝母多糖純化損失率的影響。

從圖2可以得出，在上樣體積為1～3 BV時，隨著上樣體積的增加多糖損失率顯著降低，并且在上樣體積為3 BV時，甘孜川貝母多糖純化的損失率達到最低，為23.73%±2.08%。但在上樣體積3～5 BV時，隨著上樣體積的增加，多糖損失率呈上升趨勢。故上樣體積對甘孜川貝母多糖純化損失率影響的最優(yōu)值應在2～4 BV，因此以上樣體積2～4 BV作為正交試驗水平。

2.2.2?洗脫液體積對甘孜川貝母多糖純化損失率的影響。

從圖3可以得出，在洗脫液體積為1～2 BV時，由于洗脫液的體積較小，對于大孔吸附樹脂中多糖的洗脫能力較差，故損失率會出現(xiàn)較為緩慢的上升;在洗脫液體積為2～4 BV時，隨著洗脫液體積的增加，損失率呈下降趨勢，并在洗脫液體積為4 BV時損失率最小，達33.48%±1.89%。隨著洗脫液體積的增加，在4～5 BV時損失率出現(xiàn)上升趨勢，此上升趨勢較1～2 BV時較為明顯。故洗脫液體積對甘孜川貝母多糖純化損失率影響的最優(yōu)值應在3～5 BV，因此選擇洗脫液體積為3～5 BV作為正交試驗水平。

2.2.3?流速對甘孜川貝母多糖純化損失率的影響。

從圖4可以得出，在流速為1～2 mL/min時隨著流速的增加多糖損失率顯著降低，并在流速為2 mL/min時甘孜川貝母多糖純化的損失率最低，達29.07%±3.88%。在2～4 mL/min時，隨著流速的增加，損失率呈上升趨勢，但在4～5 mL/min 時多糖損失率呈下降趨勢，與1～2 mL/min的趨勢相比，此時的趨勢較緩。故流速對甘孜川貝母多糖純化損失率影響的最優(yōu)值應在1～3 mL/min，因此選擇流速為1～3 mL/min作為正交試驗水平。

2.3?正交試驗

從表2可以看出，影響甘孜川貝母多糖損失率因素從大到小依次為A（流速）、B（上樣體積）、C（洗脫液體積），由此得到各因素的最佳搭配為A1B3C2，即流速為1 mL/min、上樣體積為4 BV、洗脫液體積為4 BV。

2.4?驗證試驗

在正交試驗得出的最佳條件組合基礎上進行驗證試驗，即流速為1 mL/min、上液體積為4 BV、洗脫液體積為4 BV平行試驗3次，得出甘孜川貝母多糖純化損失率為13.63%±0.05%，比正交試驗中最低損失率（17.65%±1.72%）還低。由此說明該正交分析試驗條件對甘孜川貝母多糖純化損失率優(yōu)化是可行的。

3?討論與結(jié)論

該試驗以甘孜川貝母為材料，用水提醇沉的方法提取粗多糖并用AB-8型大孔吸附樹脂純化多糖，通過單因素試驗和正交優(yōu)化設計考察了大孔吸附樹脂對純化甘孜川貝母多糖時損失率的影響?？疾煜疵摿魉賳我蛩貢r，在4～5 mL/min時多糖損失率呈現(xiàn)下降趨勢，但是與1～2 mL/min的趨勢相比，此時的趨勢較緩，可能是由于此時流速較快，雖然有利于增大吸附的速度，但同時也使大孔吸附樹脂柱的吸附量有所降低[12]。正交試驗結(jié)果表明，在流速1 mL/min、上液體積4 BV、洗脫液體積4 BV的條件下，損失率為13.63%，與張華等[5]研究的大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附處理多糖時的損失率（44.41%）相比，僅是其0.30倍，結(jié)果較為理想。該研究可以降低大孔吸附樹脂純化多糖損失率，對于后續(xù)貝母多糖的開發(fā)利用具有重要的理論指導意義。

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