植物去甲基化酶ROS1的研究進(jìn)展

王杰 解莉楠

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

表觀遺傳學(xué)是指基于非基因序列改變導(dǎo)致的基因表達(dá)水平的變化，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑和非編碼RNA調(diào)控等。在高等真核生物中，DNA甲基化發(fā)生于胞嘧啶第五位碳原子上，是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，可以調(diào)節(jié)基因組轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分化、基因印跡、轉(zhuǎn)座因子沉默等生物學(xué)過程［1-5］。DNA甲基化水平由DNA甲基化和DNA去甲基化動(dòng)態(tài)調(diào)控，甲基化維持失敗和去甲基化酶主動(dòng)去甲基化都可以影響甲基化水平［6］。

在植物中，DNA甲基化的建立和維持已經(jīng)得到充分了解，而對(duì)于DNA主動(dòng)去甲基化機(jī)制還知之甚少。DNA主動(dòng)去甲基化不僅對(duì)于全基因組表觀遺傳重編程至關(guān)重要，在植物發(fā)育過程中還介導(dǎo)基因座特異性基因激活［7］。DNA去甲基化包括DNA主動(dòng)去甲基化和被動(dòng)去甲基化2種類型。DNA主動(dòng)去甲基化不依賴于復(fù)制，但是需要一定的酶活性。擬南芥編碼4種DNA去甲基化酶，DEMETER（DME）、REPRESSOR OF SILENCING1（ROS1）、DEMETER-LIKE 2（DML2）和 DEMETER-LIKE 2（DML3）［8］。而DNA被動(dòng)去甲基化依賴于DNA復(fù)制，是指復(fù)制后缺乏DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性或缺乏甲基供體導(dǎo)致甲基化無法維持。ROS1是首先報(bào)道的植物中去甲基化酶［9］，它不僅具有糖基化酶活性，還具有AP裂解酶活性，能切開DNA骨架。研究植物體內(nèi)ROS1對(duì)進(jìn)一步探究去甲基化具有重要意義。有關(guān)研究表明去甲基化酶在細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)座子沉默中發(fā)揮關(guān)鍵作用，影響基因表達(dá)和果實(shí)成熟［10］，但潛在的酶促機(jī)制仍不清楚。本文重點(diǎn)關(guān)注去甲基化酶ROS1在植物中的研究進(jìn)展，總結(jié)近幾年去甲基化酶ROS1的發(fā)現(xiàn)和探究、在主動(dòng)去甲基化機(jī)制方面的研究進(jìn)展和其在植物發(fā)育過程中的功能。

1 植物體中去甲基化酶ROS1的發(fā)現(xiàn)和探究

1.1 ROS1具有DNA糖基化酶活性

2002年，鞏志忠課題組使用RD29A-LUC（luciferase）系統(tǒng)篩到了參與DNA去甲基化過程的突變體ROS1，且體外證實(shí)ROS1具有DNA糖基化酶的活性［9，11］。2006 年，Agius等［12］報(bào)道了 ROS1的生化特性及其過表達(dá)對(duì)靶基因DNA甲基化的影響，表明ROS1是5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶/裂解酶，參與擬南芥中的DNA主動(dòng)去甲基化，為以后植物中DNA主動(dòng)去甲基化的研究奠定了基礎(chǔ)。后經(jīng)多項(xiàng)研究，從紫花苜蓿（Medicago truncatula）、菜 豆（Phaseolus vulgaris）、 車 軸 草（Trifolium pratense）、 擬 南 芥（Arabidopsis thalianaColumbia）、鼠 耳 芥（Arabidopsis halleri）、 白 菜（Brassica rapaFPsc）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）、 玉 米（Zea mays）、 水 稻（Oryza sativa）、地錢（Marchantia polymorpha）11個(gè)物種中克隆獲得ROS1的同源基因（圖1），進(jìn)化分析顯示ROS1在多個(gè)物種中都很保守，表明ROS1在不同物種中都具有去甲基化的功能。

1.2 ROS1主動(dòng)去甲基化途徑

DNA主動(dòng)去甲基化過程在塑造甲基化模式中起著關(guān)鍵作用，但其中機(jī)制仍然不清晰。植物和動(dòng)物共有5 mC，但DNA去甲基化系統(tǒng)獨(dú)立進(jìn)化，具有不同的機(jī)制［13］。在植物發(fā)育過程中，DNA主動(dòng)去甲基化是由5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶ROS1家族起始的，其通過堿基切除修復(fù)途徑啟動(dòng)DNA主動(dòng)去甲基化［14］，調(diào)節(jié)真核生物中的DNA甲基化水平。DNA去甲基化酶ROS1在CG、CHH、CHG三種維持型甲基化類型中都具有切除5mC的活性。當(dāng)其執(zhí)行去甲基化功能時(shí)，先通過水解DNA脫氧核糖核苷酸和堿基之間的糖苷鍵將甲基化的胞嘧啶去除，然后通過它們具有的裂解酶活性在DNA鏈上的無堿基位點(diǎn)切開一個(gè)缺口（圖2）［15］。研究表明ROS1去除甲基化的胞嘧啶堿基后，在無堿基位點(diǎn)通過連續(xù)的 β-和 β，δ-切除反應(yīng)切割其底物 DNA［16-17］。β-切除在DNA鏈缺口的3'端產(chǎn)生一個(gè)3'-PUA（磷酸-α，β結(jié)構(gòu)不飽和醛），β，δ-切除在DNA鏈缺口的3'端產(chǎn)生一個(gè) 3'-磷酸基團(tuán)［17］（圖 2）。3'-PUA 和 3'-磷酸基團(tuán)分別在相關(guān)蛋白DNA磷酸酶ZDP、脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶APE1L的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榭杀幌掠蜠NA聚合酶識(shí)別的3'-羥基（圖2）以便DNA聚合酶和連接酶活性可以填補(bǔ)間隙，再通過DNA連接酶完成去甲基化整個(gè)過程，最后在3'末端添加一個(gè)未甲基化的胞嘧啶［17-18］。

1.3 ZDP、APE1L與ROS1共同作用DNA主動(dòng)去甲基化途徑

通過使用ZDP特異的抗體在擬南芥葉核中對(duì)ZDP進(jìn)行免疫熒光定位試驗(yàn)，結(jié)果表明，核質(zhì)ZDP信號(hào)與ROS1共定位［19］。通過免疫熒光共定位［20］試驗(yàn)，也已證明APE1L與細(xì)胞亞群中不同亞核結(jié)構(gòu)中的DNA去甲基酶ROS1在體內(nèi)共定位。將ROS1與51-mer雙鏈DNA底物（51-mer duplex DNA substrate，在5'-末端標(biāo)記鏈的第29位含有5-meC殘基）一起孵育并將產(chǎn)物進(jìn)行純化分析，顯示ZDP催化β，δ-消除產(chǎn)生的3'-磷酸末端轉(zhuǎn)化為3'-羥基；β-消除產(chǎn)生3'-PUA與APE1L蛋白組合產(chǎn)生3'-OH末端。研究發(fā)現(xiàn)來自zdp突變體植物的提取物不能在體外完成DNA去甲基化，這些突變使DNA甲基化水平升高，從而導(dǎo)致基因沉默［19］。APE1L具有有效的3'-磷酸二酯酶活性，可有效加工ROS1產(chǎn)生的3'-PUA阻斷末端，APE1L功能障礙導(dǎo)致DNA甲基化的全基因組改變，APE1L和ZDP的雙突變導(dǎo)致胚乳中DNA高甲基化和印跡基因的下調(diào)［18］。在擬南芥中，X射線交叉互補(bǔ)組蛋白1（x-ray crosscomplementing group protein 1，XRCC1） 在 DNA 主動(dòng)去甲基化過程中起作用，其在體外與ROS1和ZDP相互作用并刺激它們的酶活性［21］，研究發(fā)現(xiàn)xrcc1突變體植物的提取物中，去甲基化酶ROS1的去甲基化能力降低。

圖1 植物ROS1同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化

1.4 主動(dòng)去甲基化過程中DNA連接酶LIG1的發(fā)現(xiàn)

ROS1介導(dǎo)的DNA主動(dòng)去甲基化過程中產(chǎn)生3'羥基后，下游的聚合酶和連接酶可以在這個(gè)缺口填充未甲基化的胞嘧啶。迄今為止，在擬南芥DNA主動(dòng)去甲基化的最后一步中起作用、產(chǎn)生磷酸二酯鍵并連接DNA鏈兩端的DNA連接酶是AtLIG1（圖2），而這個(gè)途徑中的DNA聚合酶作用尚不清楚。LIG1對(duì)于母體印跡基因的去甲基化和活化是必不可少的［22-23］。通過共免疫定位測定，發(fā)現(xiàn)AtLIG1與核質(zhì)灶中的ROS1共定位，與細(xì)胞核和核質(zhì)中的APE1L共定位，與核質(zhì)中ZDP共定位，表明AtLIG1與ROS1、APE1L、ZDP在DNA主動(dòng)去甲基化途徑中一起發(fā)揮作用［23］。雜合突變體atlig1-1（Col背景）和atlig1-3（C24背景）植株的生長發(fā)育均出現(xiàn)異常，LIG1的RNAi系也表現(xiàn)出嚴(yán)重的矮化表型，通過亞硫酸氫鹽測序證實(shí)AtLIG1 RNAi系在CG背景下顯示該基因座處的DNA高甲基化，進(jìn)一步證明AtLIG1是去甲基化過程中的重要組成部分［23］。

圖2 堿基切除修復(fù)（BER）途徑介導(dǎo)植物中DNA主動(dòng)去甲基化［18］

2 植物體中去甲基化酶ROS1的調(diào)節(jié)機(jī)制

2.1 ROS1靶向DNA主動(dòng)去甲基化的機(jī)制

已有研究表明組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶增加DNA甲基化 1（Histone acetyltransferase increased DNA methylation1，IDM1）是一種his-tone H3乙酰轉(zhuǎn)移酶（Histone H3 acetyltransferase），是擬南芥中DNA去甲基化的調(diào)節(jié)因子［24］，在遺傳學(xué)上與ROS1處于同一途徑，在ROS1靶向途徑中起作用。

抗沉默蛋白復(fù)合物包括IDM1（ROS4）、IDM2（ROS5）、IDM3（Increased DNA methylation2-like1，IDL1）、甲基- CpG結(jié)合蛋白7（Methyl-CpG-binding protein 7，MBD7）、先驅(qū)轉(zhuǎn)座子衍生蛋白1（Harbinger transposon-derived protein1，HDP1）、 先 驅(qū) 轉(zhuǎn) 座 子衍 生 蛋 白 2（Harbinger transposon-derived protein1，HDP2），它們能夠分別形成復(fù)合物，并在ROS1靶向機(jī)制中起作用［25-29］（圖2）。MBD7和 HDP2能結(jié)合DNA，共同確保IDM1靶向于CG高甲基化區(qū)域；IDM2和IDM3在連接IDM1和MBD7中發(fā)揮作用；HDP1介導(dǎo)IDM1和HDP2之間的交互；IDM2和IDM3可以作為調(diào)節(jié)IDM1酶活性的分子伴侶。

染色質(zhì)重塑復(fù)合體（SWR1）的組分包括PIE1、ARP6和SWC6（圖2），SWR1復(fù)合物可以與2個(gè)含溴結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)NPX1和AtMBD9結(jié)合［30］。最新研究結(jié)果表明含有溴結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)NPX1和AtMBD9識(shí)別由IDM1建立的乙?；M蛋白標(biāo)記，并有助于將SWR1復(fù)合物吸引到染色質(zhì)上，SWR1復(fù)合物中的ARP6和PIE1能將H2A.Z沉積到染色質(zhì)中，最后H2A.Z與ROS1直接相互作用從而招募ROS1執(zhí)行主動(dòng)去甲基化，確定了IDM1復(fù)合物起始的植物中DNA主動(dòng)去甲基化的完整調(diào)控途徑［30］（圖2）。

2.2 ROS1去甲基化水平的調(diào)控機(jī)制

ROS1的甲基化敏感性表達(dá)是保守的，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)甲基化水平的改變，從而影響表觀基因組穩(wěn)定性［31］。目前，在ROS1基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了可以感知DNA甲基化和去甲基化活性的39 bp的DNA甲基化監(jiān)測序列（MEMS），其通過調(diào)節(jié)ROS1表達(dá)動(dòng)態(tài)調(diào)控基因組DNA甲基化水平［32］（圖3）。MEMS區(qū)域的DNA甲基化水平受到ROS1介導(dǎo)的主動(dòng)去甲基化和RdDM（RNA-directed DNA methylation）途徑介導(dǎo)的從頭合成甲基化動(dòng)態(tài)調(diào)控的嚴(yán)格控制，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)RdDM轉(zhuǎn)錄水平高或者去甲基化水平低時(shí)，MEMS的甲基化水平增加從而促進(jìn)ROS1的活性；當(dāng)RdDm轉(zhuǎn)錄水平低或者去甲基化水平高時(shí)，MEMS的甲基化水平降低從而抑制ROS1的活性［32］。SUVHs可以與MEMS區(qū)域結(jié)合，結(jié)合程度與MEMS的甲基化水平有關(guān)，已有研究證明幾個(gè)Su（var）3-9同源體（SUVHs）可以檢測MEMS區(qū)域的DNA甲基化水平，并冗余地促進(jìn)ROS1的表達(dá)［33］。

SUVH家族蛋白和DnaJ結(jié)構(gòu)域蛋白對(duì)于調(diào)控ROS1啟動(dòng)子中的DNA甲基化水平和激活ROS1轉(zhuǎn)錄也很重要［34-35］。通過分析擬南芥全基因組DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)許多啟動(dòng)子甲基化的基因并沒有被沉默，說明除了DNA主動(dòng)去甲基化，還有另外一種機(jī)制可以在不改變DNA甲基化的條件下抵消DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄沉默，SUVH1（Su（var）3-9同源體）就是這樣一種抗沉默因子，在全基因組水平上與高甲基化位點(diǎn)結(jié)合，從而直接促進(jìn)啟動(dòng)子甲基化基因的表達(dá)［36］。SUVH1與同源物SUVH3具有冗余功能，有3個(gè)與SUVH1或SUVH3相互作用的DNAJ結(jié)構(gòu)域蛋白（SDJ1、SDJ2和SDJ3），這些蛋白形成緊密蛋白質(zhì)復(fù)合物（SUVH-SDJ）共定位在大量的甲基化的啟動(dòng)子中，具有轉(zhuǎn)錄激活活性，從而抑制基因沉默，對(duì)于植物的生長和發(fā)育至關(guān)重要［34］。

細(xì)胞溶質(zhì)鐵-硫簇聚集途徑（Cytosolic ironsulfur cluster assembly，CIA）靶向復(fù)合物將Fe-S簇組裝成其結(jié)合蛋白，CIA1、AE7和MET18是組成細(xì)胞溶質(zhì)Fe-S簇的裝配因子，在該復(fù)合物中，NAR1與Fe-S簇結(jié)合，CIA1是一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用的支架，圖譜克隆將抗沉默（ASI）因子ASI3鑒定為MET18（圖3）。在細(xì)胞質(zhì)中，CIA途徑組分MET18直接與ROS1相互作用將Fe-S簇轉(zhuǎn)移至ROS1，從而使ROS1進(jìn)入核內(nèi)，通過MEMS檢測甲基化水平動(dòng)態(tài)執(zhí)行去甲基化功能［37-38］（圖3）。研究發(fā)現(xiàn)MET18突變導(dǎo)致數(shù)千個(gè)基因組位點(diǎn)超甲基化，其中大多數(shù)與ros1和ros1dml2dml3突變體中鑒定的高甲基化位點(diǎn)重疊，說明MET18可能在去甲基化途徑中與ROS1一起發(fā)揮作用。

圖3 通過胞質(zhì)鐵硫團(tuán)簇組裝（CIA）途徑和DNA甲基化調(diào)控ROS1［39］

DNA甲基化和DNA去甲基化動(dòng)態(tài)調(diào)控ROS1的表達(dá)。有研究顯示DNA修復(fù)因子——DNA損傷結(jié)合蛋白 2（DNA damage-binding protein 2，DDB2）通過與RdDM途徑的調(diào)控因子AGO4相互作用來控制從頭合成的DNA甲基化［40］，它刺激甲基化和抑制去甲基化，且能作為ROS1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制因子，從而調(diào)節(jié)其DNA甲基化水平。據(jù)報(bào)道，DNA甲基化變化引起的ROS1上調(diào)可以導(dǎo)致DDB2功能障礙［41］。DDB2還直接與2個(gè)下游DNA去甲基化因子ZDP和APE1L相互作用，并刺激它們的活性［42］。總之，DDB2通過對(duì)堿基切除修復(fù)途徑中上游ROS1和下游ZDP和APE1L的影響在一定程度上調(diào)控去甲基化酶ROS1的去甲基化水平。

3 植物體中ROS1主動(dòng)去甲基化的生物學(xué)功能

ROS1生物學(xué)功能的探究可以進(jìn)一步全面了解其生物學(xué)功能，對(duì)于深入探索去甲基化酶ROS1主動(dòng)去甲基化具有重要意義。許多研究證明，去甲基化酶ROS1調(diào)節(jié)多種植物的各類生物學(xué)過程（表1）。本文討論了去甲基化酶ROS1在植物中對(duì)印記基因表達(dá)及調(diào)節(jié)種子休眠、調(diào)控水稻籽粒品質(zhì)、氣孔發(fā)育、病原體防御、鹽協(xié)迫耐受等方面的作用。

3.1 ROS1負(fù)調(diào)控印記基因表達(dá)和種子休眠

基因組印記是一種表觀遺傳調(diào)控形式，導(dǎo)致母系或父系遺傳等位基因的親本差異表達(dá)，胚乳是基因印記的主要場所［43］。已經(jīng)鑒定出一些植物母系印記基因，如 FWA［44］、MEA［45］、NUWA［46］等。在去甲基化過程中，ZDP、APE1L雙突變和AtLIGI突變可導(dǎo)致MEA和FWA被沉默，進(jìn)而引起早期種子敗育，母系致死［17，26］。在水稻4種ROS1同源物之一ROS1a中，母體ROS1a的突變會(huì)導(dǎo)致胚乳發(fā)育停滯和植物發(fā)育不足［47］。

DOGL4是調(diào)控種子休眠基因DOG1的同源基因［48］，它是一個(gè)胚乳中父本不完全印記基因［49］。在ros1突變體中，DOGL4父本等位基因的表達(dá)被完全抑制，而母本等位基因的啟動(dòng)子區(qū)域仍保持較低的甲基化水平，從而最終使DOGL4在ros1突變體中變成一個(gè)完全的父本印記基因［50］。與母本等位基因相比，DOGL4的父本等位基因由RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RdDM）導(dǎo)致其啟動(dòng)子的-1.0 kb區(qū)域甲基化更高從而使父本等位基因表達(dá)受到了部分抑制，即ROS1通過對(duì)父本等位基因啟動(dòng)子進(jìn)行去甲基化來負(fù)調(diào)控DOGL4基因的印記。DOGL4參與負(fù)調(diào)控種子休眠，并且它在胚乳中的印記表達(dá)也對(duì)種子休眠和ABA響應(yīng)的調(diào)控起一定的貢獻(xiàn)作用，ROS1通過調(diào)節(jié)DOGL4啟動(dòng)子區(qū)域的去甲基化水平正調(diào)控DOGL4的表達(dá)，且與野生型相比，ros1突變體種子休眠和ABA敏感性增加［50］。

脫落酸（ABA）是一種植物激素，在擬南芥中，ros1突變體在幼苗發(fā)育早期和根生長過程中對(duì)ABA高度敏感，在該突變體中發(fā)現(xiàn)一些ABA誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平降低，超過60%的近端區(qū)域高度甲基化，說明ROS1介導(dǎo)的DNA主動(dòng)去甲基化可以調(diào)控ABA誘導(dǎo)基因［51］。煙酰胺酶 3（NIC3）在 NAD+補(bǔ)救合成途徑中編碼一種將煙酰胺轉(zhuǎn)化為煙酸的酶，對(duì)ABA反應(yīng)敏感，在NIC3突變體中需要ROS1介導(dǎo)的DNA主動(dòng)去甲基化在啟動(dòng)子上作為轉(zhuǎn)錄激活［51］。

3.2 ROS1同源基因OsROS1調(diào)控水稻籽粒品質(zhì)

淀粉質(zhì)胚乳主要儲(chǔ)存淀粉和糊粉，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)［52-53］。三倍體谷物胚乳由外糊粉質(zhì)胚乳和內(nèi)淀粉質(zhì)胚乳組成，是人類不可或缺的主食種類［54］。近期，通過創(chuàng)建并利用半粒種子篩選體系篩檢了近3萬粒水稻種子，獲得一個(gè)糊粉層增厚的水稻品系ta2，通過基因克隆發(fā)現(xiàn)DNA去甲基化酶基因OsROS1顯性負(fù)突變導(dǎo)致糊粉層增厚，從野生型水稻的一層細(xì)胞增加到4-10層，對(duì)于拓廣禾本科作物營養(yǎng)品質(zhì)育種具有重要意義［55］。為了提高水稻的營養(yǎng)價(jià)值，用正向遺傳方法篩選了糊粉蛋白增厚的突變體，除淀粉外，所有測定的營養(yǎng)因子（包括脂類、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維）的含量在突變體中均有所增加，該突變體具有豐富的營養(yǎng)因子含量，調(diào)控OsROS1對(duì)于改善水稻育種中的谷物營養(yǎng)有重要意義［55-56］。

3.3 對(duì)植物氣孔發(fā)育的影響

ROS1介導(dǎo)的DNA去甲基化在轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)座因子和一些內(nèi)源基因的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。然而，在ros1突變體植物中沒有關(guān)于明確發(fā)育表型的報(bào)道?？刂茪饪鬃V系細(xì)胞群的表皮作用因子2（EPF2）屬于植物特定的富含半胱氨酸的肽家族，作為氣孔形成的負(fù)調(diào)節(jié)物［57-58］。有研究發(fā)現(xiàn)，在ros1突變體中，EPF2的啟動(dòng)子區(qū)域是高甲基化的，這大大降低了EPF2的表達(dá)從而導(dǎo)致氣孔增加。去甲基化酶ROS1引發(fā)的DNA主動(dòng)去甲基化在控制植物發(fā)育過程中分散的氣孔譜系細(xì)胞中起作用［59］。

表1 已知DNA去甲基化酶ROS1在植物發(fā)育中的功能

3.4 ROS1對(duì)病原體防御起作用

研究表明DNA去甲基化在病原體防御中起著不可或缺的作用［60-61］。ros1突變體顯示對(duì)丁香假單胞菌的易感性增加，這與插入抗病基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)座子胞嘧啶甲基化升高相一致，該啟動(dòng)子抑制了ros1的表達(dá)［61］。利用擬南芥-鐮刀形鐮刀形孢菌的病理系統(tǒng)，與野生型（WT）植物相比，三重DNA去甲基酶突變體rdd（ros1 dml2 dml3）對(duì)這種真菌病原體高度敏感［8］。以上表明DNA去甲基化在細(xì)菌和真菌的抗病性中發(fā)揮作用。通過對(duì)rdd下調(diào)基因的組織特異性和致病誘導(dǎo)表達(dá)模式研究，結(jié)果表明，在擬南芥中的DNA去甲基化（主要由ROS1完成）可以促進(jìn)防御相關(guān)基因的表達(dá)［62］。

3.5 在煙草中ROS1過表達(dá)對(duì)鹽脅迫耐受

鹽脅迫影響植物的許多生理、生物化學(xué)、細(xì)胞和分子過程［63］。在植物中，黃酮類和抗氧化途徑的酶對(duì)于防御鹽脅迫的影響有關(guān)鍵作用［64］。在鹽脅迫條件下，編碼黃酮類和抗氧化途徑酶的各種基因的表達(dá)增強(qiáng)［65］。研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AtROS1增加了類黃酮生物合成途徑相關(guān)基因和抗氧化途徑相關(guān)基因的去甲基化水平。在鹽脅迫條件下，過表達(dá)AtROS1的轉(zhuǎn)基因煙草，這些基因啟動(dòng)子及編碼區(qū)域的甲基化水平降低，表現(xiàn)出對(duì)鹽脅迫的耐受性［66］。

4 總結(jié)與展望

目前，植物中DNA主動(dòng)去甲基化有了很多研究進(jìn)展，ROS1是一種重要的DNA主動(dòng)去甲基化酶，已經(jīng)對(duì)其糖基化酶的功能和酶活性調(diào)節(jié)的機(jī)制有一定的了解，但仍不全面。ROS1主動(dòng)去甲基化途徑的底端切除修復(fù)途徑比較明確，ROS1的招募機(jī)制也已經(jīng)提出，但仍未發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶的相關(guān)信息，下游是如何識(shí)別并添加未甲基化的胞嘧啶等問題也有待研究。研究表明DME和ROS1在體外具有顯著的5hmC切除活性，然而在擬南芥中沒有檢測到5hmC，說明植物不太可能利用5hmC作為DNA去甲基化的中介，這表明了在植物中DNA去甲基化的替代途徑的可能性［67］。已顯示生長素在擬南芥中的APOLO基因座處觸發(fā)DNA主動(dòng)去甲基化［68］。然而，我們并不知曉在APOLO基因座上連接生長素與活性DNA去甲基化的媒介。植物中是否還存在其他家族的去甲基化酶，是否還有其他的去甲基化途徑，都是很有意義的研究方向。

目前，ROS1對(duì)植物生長發(fā)育影響的研究并不多，對(duì)于基因表達(dá)的調(diào)控、表型的改變、果實(shí)成熟等方面的作用仍不清晰，所以ROS1介導(dǎo)的DNA主動(dòng)去甲基化在植物發(fā)育中的影響機(jī)制或許會(huì)有新的發(fā)現(xiàn)。在園藝作物中，番茄sldml2突變體有可能產(chǎn)生具有表觀遺傳變異的育種材料，從而導(dǎo)致抑制番茄果實(shí)成熟等多種性狀，因此，利用CRISPR技術(shù)選擇源自DNA甲基化/去甲基化突變體的等位基因或產(chǎn)生等位基因作為編輯位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯，獲得突變系，可能成為植物育種的重要方法［70］?？梢詰?yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在不同物種中檢測ROS1在不同生物學(xué)過程中的作用，進(jìn)一步了解ROS1的功能機(jī)制及在育種方面的作用。