西藏湖泊放線菌的分離鑒定及抗菌活性測定

潘文娟 林家富 王小桃 郭義東 褚以文 劉超蘭

（成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所 抗生素研究與再評價四川省重點實驗室，成都 610052）

抗生素耐藥性已成為全球關(guān)注的醫(yī)學(xué)與社會問題，超級耐藥菌嚴重威脅著人類的健康，新型抗生素的研發(fā)迫在眉睫［1］。眾所周知，土壤放線菌一直是新抗生素研發(fā)的重要來源［2-5］。但隨著研究深入，從土壤中篩選得到新放線菌及新次級代謝產(chǎn)物的概率呈顯著下降趨勢［6-7］，迫使人們從新的生境中篩選新的放線菌資源，如海洋放線菌、動物共生放線菌、植物內(nèi)生放線菌、極端環(huán)境放線菌等［8-12］。而湖泊生境中的放線菌資源開發(fā)至今未得到充分重視，尤其是位于高海拔西藏湖泊的放線菌資源研究仍處于空白。

西藏自治區(qū)是我國湖泊最多的地區(qū)，這些湖泊分為內(nèi)流湖和外流湖，主要包括造山運動在地層斷裂處積水而形成的斷層湖、冰川形成的冰蝕湖、泥石流使河道堵塞形成的堰塞湖等。西藏湖泊形成原因比較特別，造就了其獨特的生物多樣性，因此，研究西藏湖泊中的放線菌資源及其次級代謝產(chǎn)物對于發(fā)現(xiàn)新抗生素先導(dǎo)化合物具有重要意義。我們在西藏湖泊微生物資源調(diào)查過程中，對采集于7個湖泊的沉積物樣品進行了放線菌的分離鑒定及抗菌活性測定，本文報道獲得的初步研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 沉積物樣品 菌株分離用沉積物樣品采集自西藏7個湖泊，包括左用措、納木措、昆仲措、戈芒措、蘆布措、昂仁金措、吉力湖。采集點位于湖中心區(qū)域，用淤泥分層采集裝置采集表層沉積物（1-10 cm），樣品存放于無菌試管中，放置4℃保存。采樣信息見表1。

表1 西藏7個湖泊采樣信息

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液 （1）分離培養(yǎng)基:ISP2培養(yǎng)基［13］、ISP3 培養(yǎng)基［13］、SCA 培養(yǎng)基［14］、高氏一號培養(yǎng)基［15］，各培養(yǎng)基中均含30 mg/mL萘啶酮酸和放線菌酮。（2）純化培養(yǎng)基:ISP2培養(yǎng)基。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g，糊精25 g，燕麥粉20 g，棉籽餅粉10 g，魚粉5 g，糖蜜5 g，干酵母2 g，CaCO33 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0-7.2，121℃高壓滅菌15 min。（4）體外抗菌活性篩選用培養(yǎng)基:LB 細菌培養(yǎng)基［15］，PDA 真菌培養(yǎng)基［15］。（5）NGM線 蟲 培 養(yǎng) 基［16］。（6）M9緩 沖 液:Na2HPO46 g，KH2PO43 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，121℃高壓滅菌15 min，宜現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.1.3 線蟲 野生型秀麗隱桿線蟲N2由加拿大戴爾豪斯大學(xué)Balakrishnan Prithiviraj博士惠贈，飼養(yǎng)于NGM線蟲培養(yǎng)基中。

1.1.4 檢定菌 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusSIIA1005）、大腸桿菌（Escherichia coliSIIA 1006）、白色念珠菌（Candida albicansSIIA 2284）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisSIIA 1007）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosaSIIA 2261）由中國醫(yī)藥集團總公司四川抗菌素工業(yè)研究所菌種保藏中心提供。

1.1.5 主要試劑和儀器 引物27F/1492R購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR mix kit購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；萬古霉素、慶大霉素、5-氟-2-脫氧尿嘧啶購自上海源葉生物科技有限公司；放線菌酮購自卡邁舒（上海）生物科技有限公司，萘啶酮酸購自阿法埃莎（天津）化學(xué)有限公司。使用儀器如下:超凈工作臺SW-CJ-1FD（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），恒溫培養(yǎng)箱HWS-150（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），振蕩式搖床THZ-92A（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），高速離心機H1650（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），PCR擴增儀T100（Bio-Rad，美國），凝膠成像儀Gel DocTMXR+（Bio-Rad，美國）、體視顯微鏡SMZ-168（杭州歐爾柏維科技有限公司）、96孔板（Corning，美國）。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 將沉積物樣品自然干燥7 d后，稱取樣品2 g于60℃再干燥1 h后研磨過80目篩。將1 g干燥樣品加入裝有9 mL無菌蒸餾水的試管中，用渦旋振蕩器振蕩均勻，吸取1 mL土壤懸液至9 mL無菌蒸餾水中，進行10倍梯度稀釋，使其終濃度為 10-2、10-3、10-4、10-5。吸取 0.2 mL 稀釋液分別涂布于分離培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)30 d，從第7天開始，每天挑取新出現(xiàn)的菌落至純化培養(yǎng)基上進行純化，純化后的菌株用30%甘油保藏于-80℃冰箱。

1.2.2 菌株分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用16S上游引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、下游引物1492R（5'- TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR擴增體系（25 μL）:PCR mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA 模板 2 μL，引物各 1 μL，擴增程序為:95℃ 5 min，94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 2 min，34個循環(huán)，4℃無限延伸。擴增完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物。將結(jié)果為陽性的PCR反應(yīng)產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST程序?qū)y序結(jié)果進行比對分析，選擇GenBank中與之同源性較高的模式菌株的16S rRNA基因序列，分析菌株與參比菌株間的序列相似度，利用MEGA6.0［17］軟件，選擇Tamura-Nei模型，構(gòu)建菌株Maximum Likelihood系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株發(fā)酵及粗提液制備 將菌株接種于ISP2斜面培養(yǎng)基中于28℃生長10-14 d后，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、220 r/min發(fā)酵7 d。取20 mL發(fā)酵液加入20 mL乙酸乙酯進行萃取，吸取乙酸乙酯層10 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，加入2 mL甲醇溶解后，備用。

1.2.4 體外抗菌活性篩選 采用紙片擴散法進行抗菌活性檢測。吸取60 μL發(fā)酵粗提液至直徑為6 mm的圓形滅菌濾紙片上，待甲醇揮發(fā)后，貼于含有檢定菌的培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，然后觀察并記錄抑菌圈大小，將抑菌圈直徑大于1 cm作為陽性結(jié)果。

1.2.5 體內(nèi)抗菌活性篩選 （1）線蟲培養(yǎng):線蟲按照國際標準流程進行培養(yǎng)［18］。（2）線蟲同期化:挑取處于產(chǎn)卵期的成年線蟲于新的NGM平板，于15℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，待產(chǎn)卵后將成蟲挑出，于20℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h使蟲卵孵化并成長至L4期線蟲。（3）菌懸液制備:挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，備用。（4）線蟲抗感染實驗:吸取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液100 μL接種至NGM培養(yǎng)基（含50 μg/mL 5-氟-2-脫氧尿嘧啶，用于抑制線蟲產(chǎn)卵），37℃培養(yǎng)24 h。挑取已同期化的L4期線蟲，于M9緩沖液中反復(fù)清洗干凈后備用。將線蟲分別挑取到含有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的平板上，感染時間為14-16 h。96孔板中每孔加入20條已感染的L4期線蟲和190 μL M9緩沖液，其中陽性對照組加入10 μL抗生素（萬古霉素、慶大霉素，終濃度為50 μg/mL），陰性對照組加入10 μL甲醇，空白對照組加入10 μL M9緩沖液，樣品組加入10 μL發(fā)酵粗提液，每個發(fā)酵粗提液做3個復(fù)孔，并于培養(yǎng)箱中20℃靜置培養(yǎng)。（5）線蟲觀察:每隔2 h觀察1次，觀察時間為20 h。正常線蟲保持著正弦S形，并活躍地移動［19］，而死線蟲呈筆直狀。記錄存活和死亡線蟲數(shù)量，計算存活率，線蟲存活率（%）=線蟲存活數(shù)/線蟲總數(shù)×100%。以存活率＞50%為陽性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離

從西藏7個湖泊沉積物樣品中分離得到73株放線菌（圖1），其中分離自蘆布措湖的菌株數(shù)最多，共23株，占比31.5%；分離自昂仁金措湖的菌株數(shù)最少，為5株，占比6.8%。

圖1 西藏7個湖泊沉積物樣品分離菌株數(shù)

采用不同分離培養(yǎng)基所獲菌株數(shù)有差異，ISP2、ISP3、SCA、高氏一號培養(yǎng)基分離菌株數(shù)分別為30株、25株、8株和10株，其中ISP2和ISP3培養(yǎng)基是分離西藏湖泊沉積物中放線菌的適用培養(yǎng)基。

2.2 菌株鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

根據(jù)16S rRNA基因序列，利用Maximum Likelihood和Tamura-Nei模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果表明，73株放線菌分屬于5個科8個屬，以鏈霉菌科為主，其次為小單胞菌科、諾卡菌科、鏈孢子囊科、擬諾卡菌科等。鏈霉菌屬（Streptomyces）為優(yōu)勢屬，共59株，占80.8%，小單孢菌屬（Micromonospora）次之，共7株；其他屬包括諾卡氏菌屬（Nocardia，1株）、北里孢菌屬（Kitasatospora，1株）、小雙孢菌屬（Microbispora，1株）、野野村菌屬（Nonomuraea，1株）、游動放線菌屬（Actinoplanes，1株）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis，2株）。

根據(jù)Kim［20］提出的新種16S rRNA臨界值98.65%，分離的菌株中存在潛在新種3株，分別為菌株P(guān)F1（Streptomyces pratensisch24T，相似度為98.4%）、 菌 株 PF26（Streptomyces pseudovenezuelaeDSM 40212T， 相 似 度 為 98.25%）、 菌 株 PF188（Nonomuraea guangzhouensisNEAU-ZJ3T，相似度為98.13%）。

不同湖泊所分離到的放線菌種類具有明顯差異。各湖泊所分離菌株的屬水平相對豐度（圖3）表明，Streptomyces是各湖泊的優(yōu)勢菌屬。而在蘆布措湖的沉積物樣品中發(fā)現(xiàn)最多稀有放線菌屬，包括Kitasatospora、Microbispora、Nonomuraea、Actinoplanes，在昆仲措湖沉積物樣品中還分離到Nocardiopsis。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建湖泊放線菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 西藏7個湖泊沉積物樣品的放線菌屬相對豐度

2.3 菌株發(fā)酵粗提液的體外抗菌活性

放線菌發(fā)酵粗提液的體外抗菌活性結(jié)果總結(jié)于表2，73株放線菌中有55株放線菌至少對一種檢定菌表現(xiàn)出抗菌活性，陽性率為75.3%，其中抗金黃色葡萄球菌比例為57.5%，抗枯草芽孢桿菌比例為54.8%，抗白色念珠菌比例為37.0%，抗綠膿桿菌比例為17.8%，抗大腸桿菌比例為11.0%，菌株發(fā)酵產(chǎn)物的體外抗菌活性以抗革蘭氏陽性細菌為主。

2.4 線蟲體內(nèi)抗菌活性

73株菌株發(fā)酵提取液的線蟲體內(nèi)活性結(jié)果（表3），顯示8個（11%）發(fā)酵粗提液為陽性，其中3株菌株的代謝產(chǎn)物使線蟲存活率達到80%-100%，2株菌株的代謝產(chǎn)物使線蟲存活率達到65%-80%，3株菌株的代謝產(chǎn)物使線蟲存活率達到50%-65%。結(jié)合體外抗菌活性結(jié)果，其中2個發(fā)酵粗提液同時具有體內(nèi)和體外活性，6個發(fā)酵粗提液僅有體內(nèi)活性而無體外活性。

菌株P(guān)F188（Nonomuraeasp.）的代謝產(chǎn)物對感染金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的線蟲均有100%的保護作用，其對感染金黃色葡萄球菌的線蟲體內(nèi)活性與50 μg/mL的萬古霉素相當，但該代謝產(chǎn)物無體外抗大腸桿菌活性。菌株P(guān)F187（Microbispora tritici）的代謝產(chǎn)物具有良好的體外抗金黃色葡萄球菌活性，對感染金黃色葡萄球菌的線蟲有90%保護作用，同時該代謝產(chǎn)物無體外抗大腸桿菌活性，但對感染大腸桿菌的線蟲有60%保護作用。菌株P(guān)F33（Streptomyces sparsus）的代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無體外活性，但對感染金黃色葡萄球菌的線蟲有80%保護作用，對感染大腸桿菌的線蟲有50%保護作用（圖4）。預(yù)示菌株P(guān)F188、PF187、PF33的代謝產(chǎn)物具有不同于傳統(tǒng)抗生素的作用機制。

3 討論

七個西藏湖泊沉積物中鏈霉菌屬菌株為豐度最高的放線菌優(yōu)勢菌屬，與羅紅麗等［21］和夏占峰等［22］報道的研究結(jié)果基本一致。小單孢菌屬是僅次于鏈霉菌屬的優(yōu)勢菌屬，在左用措、昆仲措、戈芒措、昂仁金措、吉力湖中均有分布，而在納木措和蘆布措中未分離得到。比較各湖泊生態(tài)環(huán)境參數(shù)，推測小單孢菌屬的分離頻度與湖泊的pH值呈正相關(guān)，與張學(xué)武［23］報道的小單孢菌屬是分布于低溫、堿性水體生境中的優(yōu)勢菌屬的研究結(jié)果一致。近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者從湖泊生境分離獲得大量放線菌。如夏占峰等［22］采用不同鹽濃度的9種選擇性培養(yǎng)基從艾丁湖沉積物中分離放線菌，獲得8個屬的55株放線菌；Zothanpuia等［24］從印度東北部淡水湖泊分離得到9個屬的68株放線菌。而本研究分離菌株數(shù)相比其他類似研究偏少［25］，其原因除了生態(tài)環(huán)境因素外，可能與預(yù)處理方法單一、分離培養(yǎng)基設(shè)計未考慮鹽度因素等有關(guān)。深入挖掘西藏湖泊放線菌資源的多樣性，需要結(jié)合湖泊水體的物理化學(xué)參數(shù)，從培養(yǎng)基設(shè)計、樣品預(yù)處理方法等多個環(huán)節(jié)建立優(yōu)化的分離體系。

表2 西藏湖泊放線菌的體外抗菌活性統(tǒng)計結(jié)果

圖4 三株菌株代謝產(chǎn)物對感染致病菌的線蟲的保護作用

表3 西藏湖泊放線菌陽性菌株的體內(nèi)外抗菌活性統(tǒng)計結(jié)果

秀麗隱桿線蟲作為一種模式生物，因蟲體較小、通體透明、生命周期短、易于實驗室培養(yǎng)，近年來被廣泛應(yīng)用于藥物高通量篩選中［26-27］。利用秀麗隱桿線蟲感染模型，除了可以篩選得到體內(nèi)外均有抗菌活性的化合物外，還可以獲得僅有體內(nèi)活性而無體外活性的化合物，包括作用于致病菌毒力因子或增強宿主免疫力的抗菌物質(zhì)［28-29］。線蟲感染方法分為固體平板法和液體法，大多數(shù)學(xué)者采用液體感染法的原因主要由于其操作簡便、數(shù)據(jù)偏差較小。本研究采用秀麗隱桿線蟲模型篩選獲得的活性菌株次級代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有良好的抑制作用，對這些次級代謝產(chǎn)物開展活性化合物分離純化、結(jié)構(gòu)解析和作用機制研究，有望獲得具有新作用機制的抗菌先導(dǎo)化合物。

4 結(jié)論

（1）從西藏7個湖泊中分離得到73株放線菌，分屬于4個目5個科8個屬，其中含有潛在新種3株，鏈霉菌屬和小單孢菌屬為優(yōu)勢菌屬。（2）放線菌發(fā)酵粗提液體外抗菌活性結(jié)果中，對至少一種檢定菌具有抗菌活性的菌株數(shù)為55株。采用秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗菌活性篩選模型，篩選獲得陽性菌株數(shù)8株，其中菌株P(guān)F33（Streptomyces sparsus）、PF187（Microbispora tritici）、PF188（Nonomuraeasp.）具有強大的線蟲體內(nèi)廣譜抗菌活性，值得深入研究。