不同調(diào)控元件及組合對(duì)煙草外源蛋白瞬時(shí)表達(dá)的效果分析

劉文浩 王瑞豐 劉琬琳 許杰

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)是一種快速將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞、且高效表達(dá)蛋白的系統(tǒng)［1］。相對(duì)于穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，瞬時(shí)表達(dá)無需將外源基因整合到基因組上，消除了外源基因整合過程中位置效應(yīng)的影響，具有表達(dá)周期短，表達(dá)量高等優(yōu)勢［2］。因此，瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究中，包括啟動(dòng)子功能分析、轉(zhuǎn)錄因子對(duì)下游基因調(diào)控分析及蛋白質(zhì)間互作研究等［3］。但該系統(tǒng)蛋白表達(dá)量的穩(wěn)定性受到多種因素（載體自身組件構(gòu)成和轉(zhuǎn)化條件）的影響，如何更加高效和穩(wěn)定的提高瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)外源蛋白的表達(dá)量，是該系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化和擴(kuò)大使用的前提和基礎(chǔ)。

植物瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)入目標(biāo)外源基因的方法主要包括:基因槍法、農(nóng)桿菌滲透法、聚乙二醇（PEG）法、電擊法及植物病毒載體介導(dǎo)的方法［1］。其中，農(nóng)桿菌滲透法因其操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高且比較穩(wěn)定等特點(diǎn)，是目前最常使用的平臺(tái)系統(tǒng)［4］。其外源蛋白表達(dá)量的提高可以從以下兩個(gè)方面改進(jìn):其一是表達(dá)載體自身組件構(gòu)成的優(yōu)化，包括表達(dá)載體中的作用元件和表達(dá)載體骨架等；其二是轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，包括菌株、菌液濃度及轉(zhuǎn)化時(shí)間等［5］，最終目的是希望外源蛋白在該瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中能夠快速、高效地表達(dá)，從而進(jìn)一步用于后期功能分析。

目前瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中表達(dá)載體自身組件的優(yōu)化方面，主要集中在啟動(dòng)子、終止子、非編碼區(qū)、轉(zhuǎn)錄后沉默抑制因子等這些主要作用元件上。啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵元件，組成型啟動(dòng)子可以調(diào)控基因在植物任何組織器官中持續(xù)表達(dá)［6］，而組織特異型啟動(dòng)子引導(dǎo)外源基因在植物特定組織或器官表達(dá)，并且大部分組織特異型啟動(dòng)子在植物特定位置驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的能力高于組成型啟動(dòng)子［7］。表達(dá)載體中的5'非編碼區(qū)（5'UTR）能與宿主細(xì)胞競爭轉(zhuǎn)錄起始因子和核糖體，還可以減少mRNA降解和轉(zhuǎn)錄后基因沉默，避免與有害蛋白或抑制性RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用，延長mRNA半衰期，從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平提高轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物表達(dá)［8］。終止子在提高外源基因表達(dá)方面同樣發(fā)揮重要作用，正確的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷化能提高mRNA跨核運(yùn)輸效率、維持mRNA穩(wěn)定性、提高蛋白翻譯效率，并能減少基因沉默［9］。Rosenthal等［9］發(fā)現(xiàn)表達(dá)載體中插入去掉內(nèi)含子的Extensin終止子（Ext）相較于NOS終止子在煙草葉片和生菜葉片中均能顯著提高外源基因表達(dá)。此外，Beyene等［10］發(fā)現(xiàn)相比單個(gè)終止子，將不同終止子串聯(lián)可以使基因表達(dá)達(dá)到更高水平?；|(zhì)附著區(qū)（Matrix attachment regions，MAR）序列是一段與核基質(zhì)特異結(jié)合的DNA序列，能使目的基因定位于核基質(zhì)上而與周圍染色質(zhì)分開，減少基因沉默［11］。Diamos等［12］發(fā)現(xiàn)基質(zhì)附著區(qū)Rb7通過動(dòng)態(tài)結(jié)合核基質(zhì)調(diào)控臨近基因表達(dá)，在表達(dá)載體終止子后插入基質(zhì)附著區(qū)Rb7使得報(bào)告基因GFP表達(dá)增強(qiáng)。轉(zhuǎn)錄后基因沉默是重組蛋白表達(dá)低的原因之一，添加RNA沉默抑制因子能減少外源基因轉(zhuǎn)錄后基因沉默從而提高重組蛋白表達(dá)［13］。來自葡萄卷葉相關(guān)病毒2（GRLaV2）的p24蛋白被鑒定為一種強(qiáng)沉默抑制因子，能阻止植物中雙鏈反向重復(fù)序列誘導(dǎo)沉默［14］。目前關(guān)于表達(dá)載體中影響外源基因表達(dá)的單個(gè)元件研究較多，而多個(gè)作用元件組合效應(yīng)如何影響外源基因表達(dá)的研究卻很少。

農(nóng)桿菌侵染和轉(zhuǎn)化過程中，多種因素可以影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的重組載體轉(zhuǎn)化效率，從而影響外源基因的瞬時(shí)表達(dá)［15］，例如，Diamos等［12］比較農(nóng)桿菌菌株GV3101、EHA105和LBA4301發(fā)現(xiàn)，EHA105介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化可獲得更高的蛋白表達(dá)。李曉君等［16］研究pCambia1304載體侵染的最佳注射液濃度OD600在0.3-0.7時(shí)均有較高的轉(zhuǎn)化效率，而孫春蓮等［17］發(fā)現(xiàn)pCB302載體的最佳注射液濃度OD600在0.8-1.0之間。因此，不同轉(zhuǎn)化菌株的選擇、不同菌液注射液濃度的選擇，也是提高瞬時(shí)轉(zhuǎn)化中外源蛋白表達(dá)的一些重要因素。

因此，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，篩選和獲得有效提高外源基因表達(dá)的6個(gè)作用元件（包括煙草葉片特異型啟動(dòng)子rbcS、AtPsaK基因上游63 bp的5'UTR、終止子Ext、CaMV35S 3'UTR、基質(zhì)附著區(qū)Rb7和RNA沉默抑制因子p24），在植物雙元表達(dá)載體pCambia1300骨架基礎(chǔ)上，來分析不同元件的添加及相互組合，是否可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平有效的提高外源蛋白（eGFP為報(bào)告基因）在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量；并進(jìn)一步結(jié)合最佳注射液濃度的探索，以期構(gòu)建新的可以快速高效的表達(dá)外源基因的植物瞬時(shí)表達(dá)體系，從而進(jìn)一步拓寬瞬時(shí)表達(dá)體系在基因功能探究和重組蛋白表達(dá)方面應(yīng)用，以及為研究載體中能夠有效提高外源基因表達(dá)的元件功能及其組合效應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本氏煙草（Nicotianabenthamiana）、擬南芥（Columbia 0，哥倫比亞生態(tài)型）。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株:EHA105；大腸桿菌（Escherichia coli）菌 株 DH5α。pCambia1300、pCambia1301、pGreen-0000、pGreen0801、pEHQ-HT載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存。pEff載體購自Addgene。

1.1.3 試劑和引物 限制性內(nèi)切酶和Gflex高保真酶均購自NEB有限公司；CE重組酶和RNA提取試劑盒購自諾唯贊公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均購自天根公司；luciferin和鼠源GFP抗體購自Sigma公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購自雅酶公司。引物合成及測序分別由英濰捷基和上海派森諾公司完成，所用引物序列見表1。

表1 引物序列及信息

1.1.4 儀器 96孔PCR儀（Thermo Fisher）；定量PCR儀（Roche）；凝膠成像儀（Bio-Rad）；激光共聚焦顯微鏡（Leica）；Tanon-5200化學(xué)發(fā)光成像儀（Tanon）。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)控元件的篩選和克隆 根據(jù)已報(bào)道的煙草葉片組織特異型核酮糖1，5-二磷酸加氧酶/羧化酶啟動(dòng)子（rbcS啟動(dòng)子）基因序列［18］，擬南芥 AtPsaK上 游 63 bp 5' UTR序列［19］以及質(zhì)粒pCambia1301中CaMV35S序列，采用NCBI Primer設(shè)計(jì)重疊PCR引物（表1）。用CTAB法提取煙草基因組DNA，并以基因組和質(zhì)粒pCambia1301-eGFP為模板克隆獲得rbcS啟動(dòng)子和CaMV35S啟動(dòng)子，并合成AtPsaK 5' UTR，后以克隆產(chǎn)物為模板通過重疊PCR獲得PrbcS-35S-UTR融合片段。根據(jù)已報(bào)道的煙草細(xì)胞壁延伸因子Ext 3' UTR［9］，基質(zhì)附著區(qū)Rb7［20］和 CaMV35S 3' UTR［21］序列，分別以煙草基因組，質(zhì)粒pEHQ-HT為模板，通過表1引物分別克隆獲得Ext 3' UTR，CaMV35S 3' UTR和Rb7，并通過重疊PCR分別獲得Ext-35S 3' UTR（EU）和Ext-35S 3' UTR-Rb7（EUR）。參照 Mardanova等［13］的方法，以pEff載體為模板，采用NCBI Primer設(shè)計(jì)引物p24-Fw/p24-Rv，PCR擴(kuò)增獲得35S-p24-NOS片段。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，對(duì)大小正確的基因片段用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.2.2 重組載體構(gòu)建與鑒定 首先將獲得的EU和EUR連入酶切好的pCambia1300載體，獲得pEU和pEUR中間載體。然后用EcoRI和SpeI酶切載體，通過CE重組酶將PrbcS-35S-UTR連入載體獲得pREU和pREUR載體。在pREUR載體基礎(chǔ)上，將從pEff載體上克隆的35S-p24-NOS連入，獲得pREUR-p24載體。以pCambia1301載體為模板，克隆eGFP標(biāo)簽并通過CE重組酶連入pGreen0000載體，以此為模板設(shè)計(jì)引物克隆獲得eGFP標(biāo)簽和FLAG標(biāo)簽（eGFP-2×FLAG）。然后將eGFP-2×FLAG連入中間載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并將陽性重組質(zhì)粒送至上海派森諾生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體命名為pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF。

1.2.3 煙草葉片轉(zhuǎn)化［22］將 pCambia1301-eGFP、pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF重組質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，28℃暗培養(yǎng)3 d后，挑取單克隆，在含有卡那霉素和利福平的YEB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)0.8時(shí)收集菌體，用含有10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和200 μmol/L乙酰丁香酮的緩沖液重懸菌體，稀釋至OD600值為0.3，室溫靜置3 h后，用去掉針頭的注射器注射4周大的煙草葉片。分別稀釋至OD600值為0.2、0.3、0.4、0.5，注射煙草葉片。

1.2.4 重組蛋白提取及SDS-PAGE電泳 比較農(nóng)桿菌侵染煙草葉片48 h后，取注射部位的葉片進(jìn)行熒光觀察。收集侵染后48 h的煙草葉片，以液氮處理后于研缽中研磨成粉，取樣品100 mg，加入1 mL蛋白提取液（25 mmol/L磷酸鈉緩沖液pH7.4，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1% TritonX-100，10 mg/mL抗壞血酸鈉，0.3 mg/mL PMSF），顛倒裂解30 min后，12 000×g離心10 min，取上清提取總蛋白粗提液。使用雅酶SDS-PAGE凝膠試劑盒配制10%凝膠，將蛋白粗提液與5×SDS loading按4∶1比例混合沸水煮10 min后，12 000×g離心3 min，取10 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并取1 μL上清用5×SDS loading稀釋至10 μL后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后進(jìn)行Western-blot分析，使用鼠源GFP抗體進(jìn)行檢測。以rbcS小亞基為內(nèi)參，使用Image J軟件對(duì)SDS-PAGE凝膠GFP目的條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.2.5 煙草葉片RNA提取與定量PCR分析 取100 mg研磨后的樣品，加入1 mL Trizol室溫裂解5 min，后加入200 μL氯仿充分混勻，室溫靜置3 min后，4℃ 12 000 r/min離心10 min，吸取400 μL上清至1.5 mL離心管中，加入200 μL無水乙醇，吹打混勻后將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，后續(xù)操作參照諾唯贊植物總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。使用天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)獲得的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，稀釋至100 ng/μL，以此為模板進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)。定量PCR使用編碼GFP基因上的特異引物（qeGFPFw/qeGFP-Rv），內(nèi)參基因選用延伸因子1a（EF1a），其擴(kuò)增引物為EF-Fw和EF-Rv，每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測實(shí)驗(yàn)［23］將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pREUR-eGFP-MYB80和proUNDEAD-Luc轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，28℃暗培養(yǎng)3 d后，挑取單克隆，過夜培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)0.8時(shí)收集菌體，用重懸緩沖液重懸菌體稀釋至OD600值為1。轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子按4∶1比例混合，室溫靜置3 min后注射煙草葉片。弱光培養(yǎng)36 h后取煙草葉片，在葉片上加100 mmol/L的luciferin，涂布均勻后放置5 min，于Tanon-5200化學(xué)發(fā)光成像儀下檢測信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 瞬時(shí)表達(dá)載體元件克隆與構(gòu)建

本研究設(shè)計(jì)主要從啟動(dòng)子、5' UTR、終止子、基質(zhì)附著區(qū)和RNA沉默抑制因子五個(gè)方面篩選和添加作用元件（圖1-A）。首先通過PCR克隆獲得了煙草葉片組織特異型啟動(dòng)子rbcS，組成型啟動(dòng)子CaMV35S，高效終止子元件Ext和CaMV35S 3'UTR，以及能增強(qiáng)外源基因表達(dá)的基質(zhì)附著區(qū)Rb7和減少轉(zhuǎn)錄后基因沉默的RNA沉默抑制因子p24（圖1-B）。然后對(duì)各個(gè)載體元件按照?qǐng)D1-A進(jìn)行了組裝，分別獲得pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF載體。用目的片段上特有的SacI酶切位點(diǎn)和載體上的SpeI酶切位點(diǎn)雙酶切重組質(zhì)粒，出現(xiàn)2個(gè)與預(yù)期值相符的DNA片段（大小約為10 kb和750 bp），證明重組載體構(gòu)建成功（圖1-C）。

2.2 重組表達(dá)載體活性分析

根據(jù)1.2.3實(shí)驗(yàn)方法分別將pREU-EF、pREUREF和pREUR-p24-EF 3個(gè)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草葉片，48 h后，利用激光共聚焦顯微鏡分析煙草葉片中報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況。結(jié)果（圖2）表明，在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜中均能觀察到GFP的表達(dá)，初步說明構(gòu)建的3個(gè)瞬時(shí)表達(dá)載體都能在煙草葉片中穩(wěn)定工作。

圖1 重組表達(dá)載體構(gòu)建及驗(yàn)證

圖2 重組表達(dá)載體侵染后煙草葉片中GFP表達(dá)分析

2.3 作用元件組合與目標(biāo)蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

為探究不同作用元件組合對(duì)外源蛋白表達(dá)的影響，對(duì)侵染48 h后的煙草葉片中報(bào)告基因表達(dá)進(jìn)行分析。qRT-PCR結(jié)果（圖3-A）顯示，在轉(zhuǎn)錄水平上PrbcS-35S-UTR和EUR-p24元件組合相比pCambia1301載體中CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子組合使GFP表達(dá)提高28倍，相比PrbcS-35S-UTR和EU與EUR元件組合分別提高7倍和1.4倍，說明增加的作用元件能在轉(zhuǎn)錄水平上顯著提高報(bào)告基因表達(dá)，并且在終止子后插入基質(zhì)附著區(qū)Rb7和RNA沉默抑制因子均能提高GFP的轉(zhuǎn)錄能力。

SDS-PAGE凝膠Image J灰度值分析結(jié)果表明，在蛋白水平上pREUR-EF和pREUR-p24-EF相比pREU-EF增強(qiáng)2倍和1.7倍（圖3-B-3-D），說明終止子后Rb7的插入能增強(qiáng)蛋白表達(dá)能力，但再增加p24后GFP表達(dá)并沒有顯著性變化（圖3-D）。

2.4 菌液注射液濃度對(duì)GFP瞬時(shí)表達(dá)效率的影響

為分析菌液注射濃度對(duì)重組載體中外源蛋白表達(dá)的影響，對(duì)注射不同菌液濃度（載體pREUR-EF，菌液濃度:0.2-0.5，轉(zhuǎn)化48 h）的煙草葉片中報(bào)告基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測分析。定量PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄水平上報(bào)告基因GFP的表達(dá)量隨著注射液濃度升高而逐漸增強(qiáng)（圖4-A）。

SDS-PAGE凝膠Image J灰度值結(jié)果（圖4-B-4-D）分析顯示，OD600為0.4時(shí)，報(bào)告基因的蛋白水平信號(hào)相對(duì)最強(qiáng)。結(jié)果說明，菌液注射液濃度也是影響外源蛋白表達(dá)的重要因素。

2.5 重組表達(dá)載體在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中的應(yīng)用

為驗(yàn)證改造的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)是否可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控Dual-Luciferase分析，將擬南芥花藥特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子AtMYB80和AMS（ABORTED MICROSPORES）分別連入pREUR-EF載體，來驗(yàn)證AtMYB80對(duì)其下游基因天冬氨酸蛋白酶UNDEAD轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。Effector和Reporter載體構(gòu)建示意如圖5-A所示。農(nóng)桿菌侵染煙草葉片36 h后，可在細(xì)胞核中觀察到AtMYB80的表達(dá)（圖5-B）。Tanon-5200化學(xué)發(fā)光成像儀信號(hào)檢測結(jié)果顯示，只有Effector時(shí)只有本底信號(hào)，加入pREUR-eGFP-MYB80后引起Luc信號(hào)增強(qiáng)，但是加入AMS轉(zhuǎn)錄因子并不能使信號(hào)增強(qiáng)（圖5-C），這個(gè)結(jié)果與此前報(bào)道利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)在植物體內(nèi)研究結(jié)果一致，說明構(gòu)建的表達(dá)體系可用于Dual-Luciferase系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析。

圖3 對(duì)比分析不同元件對(duì)報(bào)告基因GFP表達(dá)的影響

圖4 對(duì)比分析不同注射液濃度對(duì)pREUR-EF載體中報(bào)告基因GFP表達(dá)的影響

3 討論

圖5 轉(zhuǎn)錄因子MYB80對(duì)UNDEAD的調(diào)控分析

植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)具有廣泛應(yīng)用，既可以用于快速研究基因功能，也可以用于獲取重組蛋白。已有研究表明，目的蛋白性質(zhì)、宿主、表達(dá)載體系統(tǒng)、密碼子偏好性、轉(zhuǎn)化條件等因素都會(huì)影響外源蛋白表達(dá)［4］。表達(dá)載體系統(tǒng)中各作用元件的優(yōu)化一直是進(jìn)一步提高外源蛋白的研究熱點(diǎn)。在本研究中，我們挖掘和比較文獻(xiàn)中不同作用元件對(duì)外源蛋白表達(dá)影響，篩選和克隆獲得可以用于表達(dá)載體改造的6個(gè)相關(guān)作用元件（包括煙草葉片特異型啟動(dòng)子rbcS、AtPsaK基因上游63 bp的5' UTR、終止子Ext、CaMV 35S 3' UTR、基質(zhì)附著區(qū)Rb7和RNA沉默抑制因子p24）。其中，煙草葉片特異型啟動(dòng)子rbcS和組成型啟動(dòng)子CaMV35S及基質(zhì)附著區(qū)Rb7主要從轉(zhuǎn)錄水平提高外源基因表達(dá)，克隆自光系統(tǒng)小亞基K的5' UTR及細(xì)胞壁Extensin和煙草花葉病毒35S的3'UTR既能影響外源基因mRNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性，也能影響外源基因的翻譯效率。沉默抑制因子p24主要通過減少RNA沉默從轉(zhuǎn)錄后水平提高外源基因表達(dá)［13］。因此，我們組裝的瞬時(shí)表達(dá)載體可以從多個(gè)層次改善外源基因的表達(dá)，這為表達(dá)載體的改良提供了新的思路。

啟動(dòng)子是影響外源基因表達(dá)的關(guān)鍵作用元件，孫家利等［18］發(fā)現(xiàn)煙草葉片特異型啟動(dòng)子rbcS驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)能力強(qiáng)于組成型啟動(dòng)子CaMV35S。表達(dá)載體中5' UTR被用作翻譯增強(qiáng)子［8］，像苜?；ㄈ~病毒（AMV）的5' UTR［24］，煙草花葉病毒的Ω序列等［25］，Diamos等［8］發(fā)現(xiàn)將來源擬南芥基因組AtPsaK 5' UTR插入CaMV35S啟動(dòng)子后能增強(qiáng)GFP翻譯效率。雙終止子串聯(lián)能在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中有效提高基因表達(dá)［21］，Beyene等［10］發(fā)現(xiàn)將CaMV35S和NOS終止子串聯(lián)使用能顯著提高基因表達(dá)，Yamamoto等［21］也發(fā)現(xiàn)將Ext終止子和HSP終止子串聯(lián)使用可以獲得更多的GFP蛋白。在本研究中，通過轉(zhuǎn)錄水平（qRT-PCR）和蛋白水平（SDS-PAGE）分析表明，我們發(fā)現(xiàn)相比于常用的以CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，以NOS為終止子的載體，采用組織特異型rbcS啟動(dòng)子和CaMV 35S組成型啟動(dòng)子及AtPsaK 5'UTR串聯(lián)驅(qū)動(dòng)，輔以Ext和35S 3' UTR作為終止子元件的載體能顯著提高外源基因的轉(zhuǎn)錄。已有研究表明，基質(zhì)附著區(qū)能減少轉(zhuǎn)基因沉默［26］，Ji等［27］發(fā)現(xiàn)TM6能減少臨近基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化從而提高煙草中重組蛋白表達(dá)。我們的定量結(jié)果表明，在雙終止子之后插入基質(zhì)附著區(qū)Rb7后，GFP轉(zhuǎn)錄顯著增強(qiáng)，蛋白表達(dá)提高。轉(zhuǎn)錄后基因沉默是影響外源蛋白積累的常見因素，Mardanova等［13］研究發(fā)現(xiàn)，將RNA沉默抑制因子p24插入pEff載體后，相對(duì)不添加p24的載體，GFP表達(dá)提高3倍。我們的結(jié)果表明，p24插入載體后，GFP在轉(zhuǎn)錄水平上提高1.4倍，但是蛋白水平上GFP表達(dá)沒有顯著性差異，我們認(rèn)為這可能與我們?nèi)〔臅r(shí)間較早有關(guān)，隨著體內(nèi)表達(dá)時(shí)間的延長，含有RNA沉默抑制因子的pREUR-p24-EF載體可能會(huì)獲得更高的蛋白積累。我們的研究結(jié)果表明，外源基因表達(dá)水平與高效作用元件的組合具有正相關(guān)性。Sheludko認(rèn)為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化中適合的注射液濃度OD600在0.1-1.5之間［4］，我們的結(jié)果顯示菌液注射液濃度OD600為0.4左右時(shí)，可以獲得更高的外源基因表達(dá)。

Phan等［28］利用體內(nèi)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)證明，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtMYB80能結(jié)合到天冬氨酸蛋白酶UNDEAD基因的啟動(dòng)子區(qū)從而正向調(diào)控該基因表達(dá)。本研究將AtMYB80轉(zhuǎn)錄因子插入pREUR-EF瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行Dual-Luciferase實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果與該ChIP-PCR結(jié)果一致。該系統(tǒng)相比其他用于Dual-Luciferase實(shí)驗(yàn)的瞬時(shí)表達(dá)載體的優(yōu)勢在于在轉(zhuǎn)化過程中不需要與含有RNA沉默抑制因子的pSoup-p19載體共轉(zhuǎn)化，并且增加eGFP標(biāo)簽后可實(shí)時(shí)監(jiān)測轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況。此外，由于該瞬時(shí)表達(dá)載體具有更高的表達(dá)效率，可縮短體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了含有eGFP和FLAG標(biāo)簽的高效的瞬時(shí)表達(dá)載體pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF，定量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了影響載體表達(dá)的作用元件組合與外源基因表達(dá)具有正相關(guān)性，高效作用元件的組合使用可以提高瞬時(shí)表達(dá)載體的穩(wěn)定性和外源基因表達(dá)。此外，對(duì)菌液注射液濃度的探索進(jìn)一步完善了瞬時(shí)表達(dá)體系研究。采用上述優(yōu)化載體和最佳注射濃度可用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。