植物miRNA作用方式的分子機(jī)制研究進(jìn)展

張翠桔 莫蓓莘 陳雪梅 崔潔

（深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳 518037）

MicroRNA（miRNA）是一類真核生物中廣泛存在的約20-24個核苷酸（Nucleotide，nt）長度的內(nèi)源非編碼單鏈RNA，成熟的miRNA與Argonaute（AGO）家族蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）， 在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。miRNA在生物的細(xì)胞增殖分化、生長發(fā)育和響應(yīng)外界環(huán)境信號等多種生物過程中發(fā)揮重要作用。1993年和2000年，Ambros與Reinhart的研究小組分別先后在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中鑒定了最早的動 物 miRNA，lin-4和let-7［1-2］。2002 年 Bartel、Carrington與Chen分別帶領(lǐng)各自的研究小組發(fā)現(xiàn)了植物擬南芥中的miRNA［3-5］。幾十年來，科學(xué)家已經(jīng)在動植物中發(fā)現(xiàn)了數(shù)以萬計的miRNA，2018年10月miRBase收錄了38 589條miRNA前體信息，這些前體共計產(chǎn)生48 860條不同的成熟miRNA；其中人類基因組中鑒定發(fā)現(xiàn)2 654個成熟miRNA，擬南芥中發(fā)現(xiàn)428個成熟miRNA［6］。有關(guān)miRNA產(chǎn)生的生物學(xué)過程、功能分析、逆境脅迫等方面的研究報道逐年攀升，miRNA已然成為科學(xué)研究領(lǐng)域炙手可熱的“明星分子”。

2002年，研究者們發(fā)現(xiàn)植物中第一個miRNA，“miR171”，同時發(fā)現(xiàn)植物miRNA與靶基因序列高度互補配對的特性［3-5］。在此之前的1999年，植物中首次發(fā)現(xiàn)了小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA與靶基因完全互補配對，通過剪切靶基因mRNA調(diào)控基因的表達(dá)［7］?；趕iRNA作用機(jī)制的啟示，Llave［4］發(fā)現(xiàn)miR171也是通過剪切mRNA沉默靶基因。有趣的是，miR171既是植物miRNA作用方式的第一個實例，也是植物中少數(shù)與靶基因完全互補配對的miRNA之一。在miRNA被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和報道的前期，通過定量PCR檢測mRNA水平的實驗技術(shù)非常成熟，對靶基因mRNA水平的檢測成為早期主流手段，因此植物miRNA對靶基因mRNA剪切的現(xiàn)象被大量報道。然而，蛋白水平的檢測需要借助特異性強(qiáng)且靈敏度高的抗體，植物蛋白抗體開發(fā)的不足大大限制了對miRNA靶基因蛋白水平的檢測。以上因素綜合作用造成了長期以來該領(lǐng)域的觀點認(rèn)為，植物miRNA主要通過剪切靶基因mRNA發(fā)揮作用。隨后開始有報道發(fā)現(xiàn)有的植物miRNA并不影響靶基因mRNA的水平，而是降低靶基因蛋白的水平［8-10］，由此提出植物miRNA也存在與動物miRNA類似的抑制蛋白翻譯的作用機(jī)制。Brodersen等［11］發(fā)現(xiàn)了擬南芥中多個miRNA可以介導(dǎo)翻譯抑制，并且通過突變體篩選報道了數(shù)個影響miRNA翻譯抑制的基因，為植物miRNA翻譯抑制機(jī)制的廣泛存在提供了遺傳學(xué)的證據(jù)支持。近些年的研究報道進(jìn)一步揭示了植物miRNA翻譯抑制的普遍性。迄今為止，植物miRNA主要通過剪切mRNA和翻譯抑制兩種方式對靶基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控，已經(jīng)成為該領(lǐng)域最新的共同認(rèn)知。

自植物miRNA首次被報道以來，近十幾年的研究已經(jīng)對miRNA的生物學(xué)發(fā)生與降解，及其參與的生物學(xué)過程等方面作了清晰的闡述，也有不少文獻(xiàn)針對上述內(nèi)容進(jìn)行了很好的總結(jié)［12-16］。相比在動物中的研究，miRNA在植物中作用方式的分子機(jī)制的報道相對匱乏和滯后。對植物miRNA-RISC復(fù)合體核心效應(yīng)因子AGO1的功能解析，結(jié)合mRNA降解通路的基因功能研究，闡明了miRNA對靶基因的切割以及隨后的mRNA降解機(jī)制；相比之下，在翻譯抑制方面，盡管發(fā)現(xiàn)了一系列影響miRNA翻譯抑制的基因，但是這些基因影響這一過程的分子機(jī)制仍然不夠清晰。本文將回顧和概述植物miRNA作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)過程與最新的研究進(jìn)展，系統(tǒng)地總結(jié)植物miRNA介導(dǎo)的mRNA剪切和翻譯抑制這兩種主要作用方式的發(fā)生、產(chǎn)生的結(jié)果（靶基因mRNA降解、次生小干擾RNA發(fā)生）和影響因素等方面的研究進(jìn)展。本文也將討論miRNA發(fā)生作用的亞細(xì)胞場所，以及不同作用機(jī)制的聯(lián)系和區(qū)別。綜合以上信息，文末將對該領(lǐng)域內(nèi)未來的研究方向進(jìn)行展望，同時提出一些亟待解決的問題并進(jìn)行討論。

1 miRNA介導(dǎo)的靶基因mRNA剪切

動物miRNA與靶基因匹配程度不高（配對僅限于種子序列區(qū)域（Seed region）），因此無法直接剪切mRNA［17］。動物miRNA通過RISC復(fù)合體招募去腺苷化酶和脫帽蛋白對mRNA進(jìn)行降解［18］。相比之下，植物miRNA與靶基因的互補配對程度遠(yuǎn)大于動物miRNA，大部分只存在4個堿基以下的錯配，主要通過對靶基因mRNA的剪切發(fā)揮沉默效應(yīng)，作用方式與siRNA類似。迄今為止，既沒有生化證據(jù)表明在植物中存在與動物中類似的，不依賴剪切的mRNA降解機(jī)制［19］，在AGO1剪切活性缺陷突變體的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中也未檢測到這一類機(jī)制的明確存在［20］。由于實驗手段的限制，早期僅能通過Northern Blot和5'cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）鑒定和克隆到少數(shù)miRNA剪切的靶基因片段；mRNA被miRNA 切割后的3'端片段暴露出5'單磷酸基團(tuán)，該結(jié)構(gòu)能夠被連接酶捕獲并添加接頭構(gòu)建得到降解組文庫。得益于近些年測序技術(shù)的不斷發(fā)展，對3'切割產(chǎn)物（降解組）進(jìn)行高通量測序和分析，German等［21］發(fā)現(xiàn)大部分?jǐn)M南芥miRNA都存在對靶基因mRNA進(jìn)行剪切的作用方式。

植物miRNA主要通過AGO蛋白的核酸內(nèi)切酶活性發(fā)揮作用。AGO蛋白是一類進(jìn)化上非常保守的蛋白，廣泛存在于細(xì)菌、古生菌、真菌、植物和動物中［22］。擬南芥AGO蛋白家族有10個成員（AGO1-10），其中AGO1結(jié)合絕大多數(shù)的miRNA發(fā)揮作用［23-24］，此外AGO2、AGO4、AGO7和AGO10也可以結(jié)合部分miRNA發(fā)揮剪切功能［25-30］。成熟的miRNA與AGO蛋白組裝成miRNA-RISC復(fù)合體，miRNA引導(dǎo)及識別與自身核苷酸互補配對的靶基因mRNA并與之結(jié)合；AGO1蛋白保守的PIWI結(jié)構(gòu)域具有類似RNA酶H催化中心的三級結(jié)構(gòu)［31］，特異性地在miRNA第10-11位對應(yīng)的靶基因mRNA位置切斷核苷酸之間的磷酸二酯鍵［32］，產(chǎn)生5'端包含帽子結(jié)構(gòu)和3'端帶有polyA尾的兩段切割產(chǎn)物。

經(jīng)miRNA剪切后的mRNA 5'和3'端片段進(jìn)入核酸外切酶降解途徑。Northern blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)3'切割產(chǎn)物更容易被檢測到，意味著5'切割產(chǎn)物更容易被降解，而3'切割產(chǎn)物更穩(wěn)定［4］。在擬南芥中，催化降解3'切割產(chǎn)物的是一類5'-3'的外切酶EXORIBONUCLEASE 4（XRN4）［33］（圖 1-b，mRNA剪切）。miRNA 5'切割產(chǎn)物的降解步驟相對復(fù)雜，擬南芥的核酸轉(zhuǎn)移酶HEN1 SUPPRESSOR 1（HESO1）以及其同源蛋白RNA URIDYLYLTRANSFERASE 1（URT1）對其3'末端進(jìn)行尿苷化修飾能夠加速5'切割產(chǎn)物的降解［35-36］（圖1-b，mRNA剪切）。在萊茵衣藻中，5'切割產(chǎn)物的3'末端被HESO1同源蛋白核酸轉(zhuǎn)移酶MUT68腺苷化［34］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，擬 南 芥RICE1（RISC-INTERACTING CLEARING3'-5'EXORIBONUCLEASE 1）在尿苷化的5'切割產(chǎn)物隨后的降解過程中發(fā)揮重要作用［37］（圖1-b，mRNA剪切）。RICE1是AGO1蛋白的輔因子，結(jié)構(gòu)上與3'-5'外切酶DnaQ家族類似，RICE1催化活性的缺失導(dǎo)致尿苷化的5'切割產(chǎn)物在突變體內(nèi)過度積累［37］。此外，在xrn4突變體中也報道了5'切割產(chǎn)物的異常積累，表明XRN4也參與了5'切割產(chǎn)物的降解［35］。早期對細(xì)胞質(zhì)外切體（Exosome）相關(guān)基因突變體csl4和rrpl6的研究未發(fā)現(xiàn)明顯的5'切割產(chǎn)物的積累［35］，認(rèn)為外切體不參與該降解步驟。直到2015年，Branscheid等［38］證實了組成外切體復(fù)合體的其他亞基突變體中5'切割產(chǎn)物存在積累的情況，表明該過程需要外切體輔因子的亞基SUPERKILLER2（SKI2），SKI3和SKI8的參與。因此，植物miRNA切割后產(chǎn)生的5'切割產(chǎn)物與果蠅和衣藻中siRNA切割后5'端片段的降解過程類似，均需要外切體的參與，外切體在這個過程中的作用機(jī)制是保守的［34，39］。

2 miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制

2.1 植物中廣泛存在miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制

1993年在C. elegans中報道了第一個鑒定到的miRNA“l(fā)in-4”，它的靶基因lin-14的mRNA無明顯變化，而蛋白水平下降［1］?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，提出miRNA抑制蛋白翻譯過程這一作用機(jī)理，這是第一次提出“翻譯抑制”的概念。由于植物中第一例關(guān)于作用機(jī)制的報道中miR171是通過剪切靶基因mRNA發(fā)揮作用，以及植物蛋白抗體的匱乏，在研究早期，植物miRNA的主要作用方式被認(rèn)為與siRNA一樣通過剪切mRNA實現(xiàn)。植物中被大家所熟知的首例miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制發(fā)生在花序組織中:擬南芥miR172使參與花器官發(fā)育調(diào)控的靶基因APETALA 2（AP2）的蛋白水平下降，而mRNA水平無明顯變化［8-9］。植物中第二個發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)翻譯抑制的miRNA參與開花時間的調(diào)控:miR156/157識別和結(jié)合靶基因SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 3（SPL3），通過翻譯抑制引起基因沉默，抑制植物早花現(xiàn)象［10］。Brodersen 等［11］通過正向遺傳學(xué)方法篩選影響miRNA作用機(jī)制突變體時發(fā)現(xiàn)，包括miR171、miR395、miR398和miR834在內(nèi)的miRNA均可以降低其相應(yīng)靶基因SCARECROWLIKE PROTEIN 4（SCL4），ATP SULFURYLASE 1（APS1），COPPER/ZINC SUPEROXIDEDISMUTASE 2（CSD2），COP1-INTERACTING PROTEIN 4（CIP4）的蛋白水平而mRNA水平未出現(xiàn)明顯變化，表明翻譯抑制是植物中廣泛存在的一種機(jī)制；該報道不僅發(fā)現(xiàn)了影響miRNA剪切靶基因mRNA的突變體，還鑒定到了一系列影響miRNA翻譯抑制的突變體（ktn1、vcs、ago1、ago10，后續(xù)章節(jié)具體闡述），為翻譯抑制在植物體內(nèi)的發(fā)生奠定了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。2010年，Alonso-Peral等［40］通過比較miR159靶基因MYB DOMAIN PROTEIN 33（MYB33）的轉(zhuǎn)錄本和蛋白的相對豐度，發(fā)現(xiàn)miR159也能介導(dǎo)翻譯抑制。

圖1 植物miRNA作用方式的模型（改自Yu等［16］）

盡管通過比較靶基因mRNA和靶蛋白穩(wěn)定狀態(tài)相對豐度的方法發(fā)現(xiàn)了許多植物miRNA介導(dǎo)翻譯抑制的例子，然而直到2013年還沒有直接的證據(jù)證明miRNA-RISC復(fù)合體可以抑制靶蛋白的翻譯過程。2013年Li等［41］通過放射性同位素標(biāo)記追蹤miRNA靶基因蛋白合成速率的變化，證實miR398和miR165/166抑制其相應(yīng)靶基因CSD2和PHABULOSA（PHB）的蛋白合成，且新生成的蛋白量降低這一過程依賴ALTERED MERISTEM PROGRAM1（AMP1）。Liu等［42］通過核糖體組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miRNA靶基因的編碼區(qū)上附著的核糖體密度降低，miRNA靶基因在核糖體上的翻譯效率顯著低于非靶基因，而靶基因與非靶基因的穩(wěn)態(tài)mRNA水平并沒有明顯差異。在影響翻譯抑制的DOUBLE-STRANDED RNABINDING 2（DRB2）基因的報道中指出，DRB2及其同源基因在苔蘚和早期基部被子植物中已經(jīng)存在，且氨基酸的保守程度非常高，暗示了其功能的保守性，以及在遠(yuǎn)古的植物中可能已經(jīng)存在DRB2介導(dǎo)的翻譯抑制機(jī)制［43］。綜上所述，越來越多的證據(jù)支持miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制在植物中的普遍存在。

2.2 影響miRNA翻譯抑制的基因

動物miRNA主要通過翻譯抑制發(fā)揮作用，具體機(jī)制得到了比較深入的研究。動物miRNA組裝成RISC復(fù)合體之后，通過miRNA第2-8位的“種子序列”與靶基因mRNA 3'非編碼區(qū)（Untranslated region，UTR）互補配對。動物的miRNA-RISC復(fù)合體包括AGO2蛋白和支架蛋白GW182。GW182是miRNA發(fā)揮翻譯抑制作用的重要橋梁因子，GW182不僅可以與AGO2蛋白相互作用，也可以與mRNA去穩(wěn)定化及翻譯過程的眾多因子相互作用［18］。動物實驗研究表明，GW182介導(dǎo)的翻譯抑制機(jī)制既包括使polyA結(jié)合蛋白（Poly A binding protein，PABP）從mRNA上脫落［44］，也包含招募翻譯阻遏物的參與［18］。然而植物中不存在GW182的同源蛋白［45］，暗示了植物翻譯抑制機(jī)制與動物的差異。對植物AGO1相關(guān)蛋白的研究發(fā)現(xiàn)了一系列促進(jìn)RISC復(fù)合體組裝、miRNA裝載的基因，例如HEAT SHOCK PROTEIN 90（HSP90）［46］，CYCLOPHILIN-40（CYP40）［47］和TRANSPORTIN1（TRN1）［48］等，遺憾的是，并沒有直接線索顯示這些與AGO1相關(guān)的蛋白與翻譯抑制機(jī)制相關(guān)。

近年來陸續(xù)報道了為數(shù)不多的影響植物miRNA翻譯抑制的基因。2008年，Brodersen等［11］通過正向遺傳篩選突變體的方法，發(fā)現(xiàn)微管切割酶KATANIN 1（KTN1）基因的突變體中miRNA靶蛋白的水平明顯升高而mRNA水平變化不大。KTN1編碼微管切割酶中的P60亞基，暗示細(xì)胞微管可能參與翻譯抑制［11］。Brodersen 等［11］還發(fā)現(xiàn)加工小體（the processing body，P body）的組分VARICOSE（VCS）影響miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制。無獨有偶，2012年Yang等［49］發(fā)現(xiàn)另一個加工小體的組分SUO基因的突變體與AGO1活性降低的突變表型類似，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)該基因的突變導(dǎo)致miRNA翻譯抑制功能受到影響。加工小體是細(xì)胞質(zhì)中一類由核糖核蛋白聚集形成的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，目前其已知的組分包含脫帽復(fù)合體的成員VCS、DECAPPING1（DCP1）和DECAPPING2（DCP2）以及AGO1［50］、XRN4［51］和SUO［49］。VCS是脫帽復(fù)合物中的一種蛋白，其外切酶活性以5'-3'的方向降解mRNA［11］。SUO基因編碼的蛋白在C端有兩個GW（Glycine and tryptophan）重復(fù)序列［49］，從蛋白結(jié)構(gòu)猜測SUO有可能是動物GW182在植物中特異存在的發(fā)揮類似作用的等價基因，但尚無證據(jù)表明SUO直接與AGO1蛋白結(jié)合。從AGO1、XRN4與加工小體的相關(guān)性可以推測VCS和SUO可能通過在加工小體中對一些需要被翻譯抑制調(diào)控的基因進(jìn)行加工或者降解來參與miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制［52］（圖1-a，翻譯抑制）。此外，Brodersen等［11］根據(jù)AGO家族中各個AGO蛋白與miRNA已知的聯(lián)系，結(jié)合突變體的表型，驗證發(fā)現(xiàn)AGO1和AGO10也參與植物miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制。

2013年，Li等［41］報道了一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜整合蛋白 ALTERED MERISTEM PROGRAM 1（AMP1） 及其同源蛋白LIKE AMP1（LAMP1）參與植物miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制，這兩個蛋白均可以與AGO1相互作用并且與AGO1共定位在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上（圖1-a，翻譯抑制）。利用同位素標(biāo)記檢測新合成蛋白量的實驗表明，在半衰期內(nèi)一定時間中，amp1突變體中miRNA對靶基因蛋白生成量的抑制能力降低，表明靶基因的翻譯抑制依賴AMP1的作用［41］。相比野生型，miRNA靶基因mRNA在amp1突變體的膜結(jié)合多聚核糖體中發(fā)生顯著富集，以上證據(jù)表明AMP1通過抑制mRNA的翻譯起始發(fā)揮功能［41］。雙鏈RNA結(jié)合蛋白DRB是植物中一類保守的蛋白，擬南芥中包含5個家族成員，DRB1-5，其中最被熟知的DRB1（即HYL1）參與miRNA的生物合成。有趣的是，Reis等［43］對野生型和drb2突變體材料同時進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)分析時，發(fā)現(xiàn)蛋白組學(xué)分析鑒定到的miRNA靶蛋白水平升高而對應(yīng)的mRNA水平與野生型無異，意味著DRB2參與翻譯抑制過程，然而作者并未對DRB2影響翻譯抑制的分子機(jī)制展開挖掘和論述。

諸多報道發(fā)現(xiàn)了一系列僅在蛋白水平影響miRNA 靶基因的突變體［11，41，49］；2009 和 2013 年兩篇文獻(xiàn)均報道AGO1的剪切活性被抑制時翻譯抑制所受影響不顯著［19，53］；利用體外組裝的RISC復(fù)合體檢測發(fā)現(xiàn)在miRNA-靶基因剪切位點附近（中心配對區(qū)）引入錯配，依然能發(fā)生顯著水平的翻譯抑制［19］。以上證據(jù)表明miRNA介導(dǎo)的剪切和翻譯抑制是兩種相互獨立的機(jī)制。目前已知的影響翻譯抑制基因的報道并未闡明這一調(diào)控方式具體的分子機(jī)制。最新的一項以萊茵衣藻為對象的研究發(fā)現(xiàn)，VASA INTRONIC GENE 1（VIG1）基因編碼的蛋白能夠與AGO蛋白相互作用，是RISC復(fù)合體的組分之一，也與多聚核糖體組分相關(guān)聯(lián)，影響翻譯抑制，并可能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的多個步驟［54］。衣藻VIG1在酵母、果蠅和哺乳動物中的同源基因與核糖體小亞基蛋白RACK1（RECEPTOR FOR ACTIVATED PROTEIN C KINASE 1）及影響翻譯延伸的蛋白相關(guān)，并且影響翻譯抑制［55-56］。擬南芥中，RACK1通過與miRNA加工復(fù)合體蛋白SERRATE（SE）相互作用影響miRNA前體的加工；此外免疫共沉淀實驗和蛋白共定位結(jié)果表明RACK1是AGO1復(fù)合體的組分。線蟲rack1突變體中miRNA表達(dá)量升高，然而利用RNA干擾技術(shù)敲除線蟲的RACK1基因?qū)е耺iRNA靶基因蛋白水平的升高，表明動物的RACK1參與翻譯抑制的過程［57］。在擬南芥中，由于rack1突變體中多數(shù)miRNA產(chǎn)生減少，靶蛋白水平的升高不能簡單歸因于RACK1影響miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制，這使得RACK1與翻譯抑制關(guān)系的探究變得富有挑戰(zhàn)性［58］。VIG1在擬南芥中有3個同源基因（AT4G16830、AT4G17520、AT5G47210）尚未有這3個基因與miRNA作用機(jī)制相關(guān)的報道［54］。

2.3 影響mRNA剪切或翻譯抑制的因素

植物miRNA與動物miRNA的主要差異有兩點:第一，與靶基因互補配對程度不同，植物中互補配對程度遠(yuǎn)高于動物中依賴種子序列的配對；第二，miRNA結(jié)合靶基因位置不同，植物miRNA主要結(jié)合靶基因編碼區(qū)，動物主要結(jié)合3' UTR。小鼠miR196除了一個G-U錯配，基本與靶基因HOXB8完全互補配對，是動物中為數(shù)不多的執(zhí)行mRNA剪切的miRNA之一［59］。植物中首例解析的miRNA作用機(jī)制也是與靶基因完全互補配對并且剪切mRNA［4］。因此早期觀點認(rèn)為近乎完全的互補配對是發(fā)生靶基因剪切的分子基礎(chǔ)。動物miRNA結(jié)合在靶基因的3'UTR并且翻譯抑制是其主要的作用機(jī)制［8-10］；植物miR156/157是最早發(fā)現(xiàn)的翻譯抑制的例子之一，它與靶基因SPL3的3' UTR區(qū)結(jié)合，暗示結(jié)合位點可能也是影響作用機(jī)制的重要因素。

早期Brodersen等［11］對結(jié)合位點和互補程度各不相同的一系列miRNA靶基因mRNA和蛋白水平分析發(fā)現(xiàn)沒有明顯的規(guī)律，提出靶基因剪切或者翻譯抑制與mRNA靶位點在基因上的位置（5' UTR、編碼區(qū)或3' UTR）和互補配對程度無關(guān)。動物中的研究也發(fā)現(xiàn)動物miRNA無論在編碼區(qū)還是3' UTR都可以實現(xiàn)翻譯抑制［60］。另一方面，植物miRNA與靶基因幾乎完全互補配對，而翻譯抑制廣泛存在，說明互補配對程度并不影響miRNA沉默機(jī)制的選擇，Brodersen等［11］通過人為引入堿基錯配也已經(jīng)加以證明。衣藻中miRNA報告基因的研究發(fā)現(xiàn)miRNA與靶基因mRNA完全互補配對仍然可以引起翻譯抑制［61］。利用農(nóng)桿菌侵染在煙草細(xì)胞中瞬時表達(dá)miRNA及其靶標(biāo)的報告基因，研究者們發(fā)現(xiàn)模擬動物中以種子序列與靶基因的配對形式，無論將結(jié)合位點設(shè)計在靶基因的UTR區(qū)還是基因編碼區(qū)，改造后的miRNA都不能發(fā)揮剪切或是翻譯抑制作用［62］。將純化的植物AGO蛋白與人工合成的miRNA在體外反應(yīng)，能夠組裝成有生物活性的RISC復(fù)合體并發(fā)揮基因沉默作用［46］。2013年的一項研究基于上述體外系統(tǒng)對翻譯抑制的分子機(jī)制進(jìn)行了解析［19］。通過在人工miRNA中引入錯配堿基并且檢測沉默效應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)植物miRNA與動物相比確實需要更高的堿基配對程度才可以實現(xiàn)翻譯抑制；同時與衣藻中的發(fā)現(xiàn)類似，當(dāng)植物miRNA與靶基因的完全互補配對發(fā)生在3' UTR時，也能夠?qū)崿F(xiàn)翻譯抑制［19］。綜上所述，miRNA的結(jié)合位點和與靶基因互補的情況并不是影響作用機(jī)制選擇的重要因素，真正起決定作用的因素仍有待進(jìn)一步研究。

2.4 植物miRNA翻譯抑制的分子機(jī)制初探

利用突變體和各種報告系統(tǒng)對miRNA作用方式分子機(jī)制的研究沒有得到明確的結(jié)論，一些體外的生化試驗為植物miRNA翻譯抑制分子機(jī)制的研究提供了一些線索。以熒光素酶作為報告基因，設(shè)計人工干擾miRNA使RISC復(fù)合體的結(jié)合位點位于編碼區(qū)時發(fā)現(xiàn)，miRNA的翻譯抑制作用引起全長的靶蛋白水平降低；有趣的是，與miRNA結(jié)合位點之前的編碼區(qū)區(qū)域?qū)?yīng)的截短蛋白出現(xiàn)明顯的積累，然而在報告基因5' UTR設(shè)計的miRNA沒有檢測到截短蛋白的積累，表明RISC復(fù)合體結(jié)合在編碼區(qū)時能夠在空間上阻礙靶基因上正在翻譯的核糖體延伸［19］。體外實驗利用AGO1剪切活性位點突變的RISC復(fù)合體（翻譯抑制功能正常）與靶基因孵育后進(jìn)行蔗糖密度梯度組分分析發(fā)現(xiàn)，完整的80S核糖體明顯減少，說明RISC復(fù)合體通過干擾核糖體組裝影響翻譯起始過程［19］。AMP1是翻譯抑制必需的，而amp1突變體中的靶基因在活躍翻譯的核糖體上的豐度高于野生型，說明AMP1的存在阻止靶基因mRNA進(jìn)入翻譯機(jī)器，表明翻譯抑制是通過影響翻譯起始實現(xiàn)。此外，利用人工合成miRNA的報告株系檢測miRNA沉默效率探索發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miRNA與靶基因結(jié)合位點位于5'端起始密碼子前200堿基對范圍時能更加有效的實現(xiàn)翻譯抑制，也暗示了miRNA通過抑制翻譯起始過程發(fā)揮作用［63］。

核糖體印跡測序技術(shù)又稱ribo-seq（ribosomesequencing），是近些年新興的一種翻譯組學(xué)研究手段。利用RNA酶消化降解沒有被核糖體覆蓋的mRNA片段后，對被核糖體保護(hù)的RNA小片段添加接頭并進(jìn)行測序；可以得到體內(nèi)轉(zhuǎn)錄本上核糖體的分布和密度等信息，從而對翻譯過程進(jìn)行直接研究。利用ribo-seq檢測植物體內(nèi)miRNA對靶基因上核糖體結(jié)合情況的影響，能夠提供更貼近體內(nèi)翻譯抑制作用機(jī)制的線索。當(dāng)RISC復(fù)合體與靶基因的結(jié)合導(dǎo)致核糖體的延伸受阻時，在靶基因mRNA結(jié)合位點前后可能會出現(xiàn)核糖體的停滯或者堆積，然而在衣藻和擬南芥的ribo-seq數(shù)據(jù)中，均沒有發(fā)現(xiàn)剪切位點附近核糖體密度的明顯變化［42，54，64］。這一發(fā)現(xiàn)也更加支持miRNA在植物體內(nèi)通過影響翻譯起始實現(xiàn)翻譯抑制的分子機(jī)制。

3 miRNA剪切的另一種結(jié)果:產(chǎn)生次生siRNA

3.1 phasiRNA與miRNA剪切

被miRNA剪切的mRNA除了進(jìn)入核酸外切酶降解途徑以外，還有可能產(chǎn)生phasiRNA。phasiRNA的產(chǎn)生是植物中廣泛存在的一種保守機(jī)制，即miRNA對一類特殊的靶基因轉(zhuǎn)錄本的剪切可以觸發(fā)產(chǎn)生具有一定相位（Phase）的siRNA，稱為phasiRNA（Phased siRNA）。phasiRNA在擬南芥中的數(shù)目相對較少［65］，近些年伴隨著植物基因組數(shù)據(jù)的不斷披露，研究人員發(fā)現(xiàn)在玉米、水稻、短柄草等單子葉植物中存在大量的phasiRNA，這些物種的生殖組織中存在的數(shù)量尤為豐富［66-68］。通常來說，phasiRNA的生成由22 nt的miRNA觸發(fā)，與絕大多數(shù)編碼蛋白的靶基因不同的是，miRNA-RISC復(fù)合體切割PHAS轉(zhuǎn)錄本，產(chǎn)生的5'和3'片段會被SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3（SGS3）捕獲并穩(wěn)定（圖1-c，產(chǎn)生次生siRNA），阻止了切割產(chǎn)物進(jìn)入核酸外切酶的降解途徑；隨后RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 6（RDR6）將上述剪切片段復(fù)制成雙鏈RNA，之后DICER LIKE 4（DCL4）從頭開始以21堿基為單位連續(xù)剪切雙鏈RNA，形成具有一定相位的，頭尾相接的 21 nt雙鏈 siRNA［69］（圖 1-c，產(chǎn)生次生siRNA）。成熟的phasiRNA與AGO1組裝成沉默復(fù)合體，通過堿基互補配對作用于產(chǎn)生phasiRNA的轉(zhuǎn)錄本自身或者其同源基因，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。其中一類特殊的phasiRNA來自一類長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的轉(zhuǎn)錄本“TAS”，因其最終產(chǎn)生的小RNA片段作用于非自身或同源的靶基因而被稱為反式作用小干擾RNA（trans acting siRNA，tasiRNA）。

phasiRNA主要來源于長鏈非編碼RNA，但也并非都產(chǎn)生于非編碼的轉(zhuǎn)錄本?；蚪M測序及生物信息分析發(fā)現(xiàn)部分編碼蛋白的基因，包括免疫反應(yīng)受體NUCLEOTIDE-BINDING LEUCINE-RICH REPEAT（NBS-LRR）和PENTATRICOPEPTIDE REPEAT（PP R）家族以及轉(zhuǎn)錄因子MYB家族等，也能夠被22 nt的miRNA觸發(fā)產(chǎn)生phasiRNA，這一類phasiRNA可能在植物與有益微生物的相互作用或者防御外界脅迫中發(fā)揮功能［65］。

tasiRNA的產(chǎn)生起始于特定miRNA對TAS轉(zhuǎn)錄本的剪切，擬南芥中有4個TAS基因，TAS1-4［69-70］。根據(jù)TAS轉(zhuǎn)錄本中miRNA結(jié)合位點的數(shù)目，將tasiRNA的產(chǎn)生機(jī)制分為“one-hit model”和“two-hit model”。顧名思義，“one-hit model”中TAS初級轉(zhuǎn)錄本只有一個miRNA結(jié)合位點，引起切割的miRNA長度為22 nt［70］，由AGO1蛋白介導(dǎo)，在5'端進(jìn)行剪切（圖1-c，產(chǎn)生次生siRNA）?！皁ne-hit model”是主要的tasiRNA/phasiRNA產(chǎn)生模型。而“two-hit model”特異地用于解釋TAS3基因轉(zhuǎn)錄本的切割，TAS3轉(zhuǎn)錄本有兩個21 nt長度的miR390的結(jié)合位點，參與的AGO蛋白是AGO7而非AGO1，剪切點靠近3'端而非5'端［71］（圖1-c，產(chǎn)生次生siRNA）?！皌wo-hit model”在植物中廣泛存在，然而在不同物種中的具體分子機(jī)制略有差別，在苜蓿和蘋果等物種中這些差異涉及參與的miRNA長度，結(jié)合的AGO蛋白成員以及剪切發(fā)生的位置［72-73］。

3.2 影響phasiRNA產(chǎn)生的因素

早期研究發(fā)現(xiàn)，“one-hit model”中能觸發(fā)tasiRNA產(chǎn)生的miRNA長度均為22 nt，而大部分miRNA的長度都是21 nt，不會產(chǎn)生tasiRNA，所以推測miRNA的長度對于tasiRNA的生成至關(guān)重要［65］。在這些報道中，一些miRNA以21 nt的標(biāo)準(zhǔn)形式存在時不會觸發(fā)phasiRNA的產(chǎn)生；當(dāng)被添加額外一個配對堿基產(chǎn)生22 nt的異構(gòu)體時，即可觸發(fā)產(chǎn)生phasiRNA［74-75］。此外在小RNA甲基化基因HEN1（HUA ENHANCER ONE）的突變體中，由于miR171的3'端沒有被甲基化保護(hù)，在核酸轉(zhuǎn)移酶URT1的催化下miR171的3'端添加了一個尿嘧啶，變成22 nt的miR171也導(dǎo)致phasiRNA的產(chǎn)生，而野生型中HEN1對miRNA 3'端甲基化阻止了尿嘧啶的添加，野生型中21 nt的miR171則不能產(chǎn)生phasiRNA［76］。

除了特定的長度以外，其他影響phasiRNA產(chǎn)生的因素也被陸續(xù)報道。2012年，Manavella等［77］發(fā)現(xiàn)21 nt的miRNA和22 nt的互補鏈miRNA*組成的非對稱結(jié)構(gòu)也能觸發(fā)tasiRNA的產(chǎn)生。通過在報告基因不同位置引入miRNA靶位點，Zhang等［78］發(fā)現(xiàn)終止密碼子緊挨著位于miR173靶位點上游時，tasiRNA產(chǎn)量最高；而終止密碼子相距靶位點上游存在一定間隔時，翻譯提前終止，tasiRNA生成被抑制，說明翻譯過程對于tasiRNA生成也很關(guān)鍵。擬南芥TAS基因上存在一些短的讀碼框，TAS2的其中一個短讀碼框包含了miR173的結(jié)合位點，體外實驗表明這個短的讀碼框可以被翻譯產(chǎn)生短肽；利用煙草報告系統(tǒng)的實驗發(fā)現(xiàn)，該讀碼框在miR173識別位點上游一段距離處發(fā)生的無義突變，造成tasiRNA的積累降低［79］，這一現(xiàn)象與Zhang等［78］的發(fā)現(xiàn)一致；然而在擬南芥體內(nèi)這些讀碼框?qū)asiRNA產(chǎn)生的影響并不清楚。miRNA的3'端與靶基因的配對程度也會影響tasiRNA的生成:在miRNA的3'端引入錯配堿基會抑制tasiRNA的生成［78］。此外，觸發(fā)phasiRNA生成的miRNA與細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)程度的降低，也會使體內(nèi)phasiRNA的豐度降低或者導(dǎo)致其相位特征的喪失［80］。最近的一項研究報道了與已知tasiRNA生成模型不完全相符的現(xiàn)象:在AGO1剪切活性缺陷的擬南芥幼苗中，體內(nèi)的tasiRNA位點產(chǎn)生仍然可以產(chǎn)生大量siRNA；這些siRNA的產(chǎn)生同樣依賴于RDR6和SGS3，不同的是，它們失去了“相位”特征。該研究表明miRNA-RISC復(fù)合體對TAS的剪切決定了tasiRNA產(chǎn)生的“相位”特征，而非tasiRNA產(chǎn)生與否的決定因素［81］。

4 miRNA介導(dǎo)的剪切和翻譯抑制發(fā)揮活性的亞細(xì)胞場所

AGO1在miRNA-RISC復(fù)合體中發(fā)揮核心功能，因此AGO1的亞細(xì)胞定位暗示了復(fù)合體發(fā)揮活性的場所。近幾年一系列AGO1在細(xì)胞核里的新功能被挖掘和報道［82］，然而被調(diào)控的靶蛋白的翻譯過程在細(xì)胞質(zhì)中完成，因此AGO1在細(xì)胞質(zhì)中的分布更能體現(xiàn)其作用的場所。通過熒光蛋白標(biāo)記結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，AGO1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞的核膜周圍富集［83］。Li等［41］通過熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn) AGO1在某種細(xì)胞質(zhì)顆粒中積累，這種顆粒狀信號與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記重合；AGO1與定位在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜整合蛋白AMP1的相互作用進(jìn)一步證實了AGO1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布（圖1）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為一種膜結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯的重要場所，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上附著了mRNA與大量正在執(zhí)行翻譯功能的核糖體。眾多核糖體聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上被稱為膜結(jié)合多聚核糖體（Membrane bound poly-ribosome，MBP），多聚核糖體在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行著活躍的蛋白翻譯過程。2009年Lanet等［53］在多聚核糖體組分中檢測到一些miRNA的分布，隨后Li等［41］利用大規(guī)模組學(xué)測序證實擬南芥中大量miRNA以及其對應(yīng)的靶基因在MBP的明顯富集。AMP1及其同源基因LAMP1參與miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制，而與mRNA的剪切無關(guān)。在amp1 lamp1雙突變體中，檢測到細(xì)胞內(nèi)總多聚核糖體（包含膜結(jié)合多聚核糖體和游離多聚核糖體）中miRNA 靶基因mRNA的量與野生型無差別，而MBP中靶基因mRNA的豐度高于野生型，說明AMP1的存在抑制mRNA在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聚集，從而導(dǎo)致翻譯抑制，由此推斷miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制可能發(fā)生在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

除了粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外，AGO1與細(xì)胞中的加工小體緊密相關(guān)［84］。加工小體中含有許多與mRNA降解相關(guān)的蛋白因子，通過募集靶基因mRNA抑制翻譯過程（圖1-a，翻譯抑制），可能參與細(xì)胞應(yīng)對環(huán)境脅迫的響應(yīng)［85］。在擬南芥中，早期的研究報道發(fā)現(xiàn)兩個影響翻譯抑制的蛋白，其中VCS是加工小體的組成因子，SUO與加工小體存在共定位［11，49］（圖1-a，翻譯抑制）。另一個影響翻譯抑制的基因KTN1與細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)相關(guān)［11］，可見植物中多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)都參與了miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制，然而尚不清楚加工小體與微管如何調(diào)控翻譯抑制，以及這些細(xì)胞活動是如何共同協(xié)調(diào)發(fā)揮作用的。

對miRNA介導(dǎo)mRNA剪切發(fā)生的亞細(xì)胞場所的報道較少。類異戊二烯可能影響AGO1與膜結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，在類異戊二烯合成酶基因HYDROXY METHYLGLUTARYL COA REDUCTASE 1（HMG1）突變體中AGO1與膜的相關(guān)程度降低，同時miRNA剪切效率也降低［86］，結(jié)合已知的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與AGO1的相關(guān)性［41］，暗示剪切的發(fā)生場所也是粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。進(jìn)一步針對mRNA降解產(chǎn)物的全基因組測序結(jié)果表明，miRNA靶基因在與正在翻譯的核糖體結(jié)合的狀態(tài)下被切割［64，87］。MBP的組分測序分析也發(fā)現(xiàn)了許多miRNA剪切后產(chǎn)生的3'切割產(chǎn)物［80］。由此我們可以推測，至少部分miRNA對mRNA的剪切發(fā)生在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，同時剪切過程的發(fā)生與翻譯過程偶聯(lián)。

phasiRNA產(chǎn)生的第一步也是miRNA的切割，研究發(fā)現(xiàn)包括長度為22 nt的miRNA（phasiRNA trigger）在內(nèi)的所有miRNA都富集在MBP上；ago1-27突變體中檢測到22 nt的miRNA與MBP這一膜結(jié)構(gòu)的結(jié)合能力下降，伴隨phasiRNA的豐度下降［80］。能夠生成phasiRNA的TAS雖然是一類長鏈非編碼RNA，但是其序列上存在一些短的開放式閱讀框，使TAS轉(zhuǎn)錄本與核糖體結(jié)合［64］，甚至特異地與MBP結(jié)合［80］。綜合以上發(fā)現(xiàn)表明，miRNA對PHAS的剪切步驟也發(fā)生在膜結(jié)合多聚核糖體上。

5 總結(jié)與展望

植物miRNA對mRNA進(jìn)行直接剪切或者抑制其翻譯實現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控。miRNARISC復(fù)合體利用miRNA與靶基因的互補配對找到靶位點［21］，并且發(fā)揮AGO1蛋白PIWI結(jié)構(gòu)域的核酸外切酶活性切割靶基因mRNA［31］，切割片段隨后被5'-3'核酸外切酶XRN4和外切體降解［35］。對于體內(nèi)的許多miRNA來說，剪切不是唯一的作用機(jī)制，類似動物中的翻譯抑制也在植物中大量存在［8-10，11，41，43，49］，盡管近十幾年的研究揭示了一系列影響 miRNA 翻譯抑制的重要基因［11，41，43，49］，但是多數(shù)僅限于在相應(yīng)基因的突變體中發(fā)現(xiàn)翻譯抑制受到影響的現(xiàn)象，對于這些基因在分子層面調(diào)控翻譯抑制的機(jī)制仍不清楚?；谟绊懛g抑制的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜整合蛋白AMP1 的相關(guān)研究及植物中的riboseq 數(shù)據(jù)［41，54，64］，當(dāng)前的研究比較支持植物 miRNA對翻譯抑制的調(diào)控是通過抑制翻譯起始過程實現(xiàn)的；動物中這一過程的實現(xiàn)主要依靠AGO2的互作蛋白GW182實現(xiàn)［44］，然而植物中GW182同源基因的缺失使植物中的作用機(jī)制變得更為復(fù)雜［45］。植物中影響翻譯抑制的蛋白“SUO”含有動物GW182蛋白的GW保守結(jié)構(gòu)域［49］，但是其是否與AGO1存在相互作用還有待進(jìn)一步的驗證。盡管有一些研究報道了能夠與植物AGO1相關(guān)或者存在相互作用的蛋白，但多數(shù)與RISC復(fù)合體的組裝和AGO1自身的降解或者再循環(huán)有關(guān)［46-48］。核糖體小亞基蛋白RACK1被報道存在于AGO1復(fù)合體中，然而一方面RACK1的突變影響了體內(nèi)大多數(shù)miRNA的生成［58］，另外也并沒有檢測到其與AGO1的直接相互作用。綜上所述，目前并未找到植物中能夠與AGO1互作的，明確與翻譯過程相關(guān)的因子或者類似GW182的橋梁蛋白，miRNA抑制翻譯起始影響蛋白翻譯的分子機(jī)制有待進(jìn)一步挖掘。從最新的藻類VIG1的功能研究中可以得到啟示［54］，植物中存在一些潛在的與動物中已知影響翻譯抑制基因的同源基因，其功能機(jī)制尚未得到闡述，對這部分基因的深入挖掘?qū)槲覀兲峁┬碌木€索。此外，設(shè)計翻譯抑制報告株系進(jìn)行正向遺傳學(xué)的大量篩選，也將幫助我們盡快地闡明這一機(jī)制的分子基礎(chǔ)。

植物中miRNA選擇翻譯抑制還是切割mRNA的決定因素，目前并不清楚。早期研究認(rèn)為的影響因素（miRNA與靶基因結(jié)合的位置和互補配對的程度），目前看來都不能很好地解釋兩種機(jī)制產(chǎn)生的原因。miRNA介導(dǎo)的兩種作用機(jī)制背后，可能有一些其他原因。miRNA與靶基因在MBP上的富集表明切割和翻譯抑制是與翻譯過程相偶聯(lián)的，因此RISC復(fù)合體與mRNA的結(jié)合在某種程度上是與核糖體的一種競爭。靶基因上的核糖體密度，RISC復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)豐度的高低是否會影響機(jī)制的選擇，都是未來非常值得探索的問題。植物miRNA不僅可以通過胞間連絲實現(xiàn)細(xì)胞之間的短距離擴(kuò)散，還可以通過篩管進(jìn)行長距離的運輸［88］。在miRNA產(chǎn)生的部位原位地和運輸?shù)降倪h(yuǎn)程部位中miRNA對靶基因沉默的機(jī)制，是否存在差異，仍待進(jìn)一步的闡明。當(dāng)然，這兩種機(jī)制的選擇也許由更為復(fù)雜的因子綜合決定。除了miRNA、靶基因mRNA和miRNA剪切產(chǎn)物在MBP上的富集，翻譯抑制中關(guān)鍵的GW182橋梁因子在植物中的缺失，體內(nèi)ribo-seq數(shù)據(jù)未顯示核糖體在剪切位點附近的異常堆積等發(fā)現(xiàn)；在對多個AGO1剪切缺陷突變的轉(zhuǎn)基因株系的研究中發(fā)現(xiàn)，個別miRNA靶基因在mRNA剪切活性被阻斷以后，其蛋白的翻譯抑制情況也受到了影響［20］。綜合以上發(fā)現(xiàn)，我們可以推測:翻譯抑制對某些靶基因來說可能是發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種mRNA剪切，由于其發(fā)生的位點是在活躍翻譯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)機(jī)器上，使我們認(rèn)為這是一種翻譯抑制的機(jī)制。

此外，對一些主要執(zhí)行翻譯抑制功能的miRNA來說，在RISC復(fù)合體中AGO1的內(nèi)切酶活性是如何被抑制的也不清楚。動物miRNA-RISC復(fù)合體中的AGO2蛋白存在各種翻譯后修飾，例如，AGO2不同氨基酸位點的磷酸化可以引起AGO2與miRNA或者靶基因結(jié)合能力的變化，以及翻譯抑制效率的增強(qiáng)［89］。此外，AGO2的二磷酸腺苷核糖基化（ADP-ribosylation）導(dǎo)致miRNA的抑制效應(yīng)降低等等［89］。已知植物AGO1蛋白的翻譯后修飾在一些病毒與植物的互作中發(fā)揮重要作用。病毒中的沉默抑制因子，通常編碼能夠泛素化底物的F box蛋白，以宿主體內(nèi)的沉默效應(yīng)蛋白AGO1為底物進(jìn)行泛素化。被修飾的AGO1蛋白隨之進(jìn)入自噬體或者“泛素—蛋白酶體”降解途徑。此外在非病毒與植物互作背景下，研究者們也發(fā)現(xiàn)了F box蛋白編碼基因FBW2能夠負(fù)調(diào)控AGO1蛋白水平［90-91］，暗示AGO1蛋白泛素化修飾的廣泛存在。然而AGO1其他翻譯后修飾仍未有報道，這些修飾的存在與否，以及對 miRNA作用機(jī)制的選擇或者RISC復(fù)合體的沉默效應(yīng)的影響，將是未來非常值得關(guān)注和討論的問題。

很多靶基因在植物中同時存在mRNA的剪切和翻譯抑制［8，11，92］。兩種作用方式之間的平衡和分子機(jī)制，也需要更多更深入的研究。動物中miRNA誘導(dǎo)的翻譯抑制是可逆的［93-95］。研究發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)進(jìn)入加工小體的mRNA分子在人類細(xì)胞受到饑餓刺激時可以被重新招募到多聚核糖體上進(jìn)行翻譯［93］。加工小體可以作為mRNA的一個臨時儲存場所，以保證可逆的翻譯抑制的解除，使細(xì)胞在響應(yīng)外界脅迫時做出迅速的反應(yīng)。植物中也有多個加工小體相關(guān)的基因參與了翻譯抑制，暗示植物中的翻譯抑制可能也是一個可逆的過程。因為剪切后的mRNA進(jìn)入降解是一種不可逆的生理過程，翻譯抑制機(jī)制可逆性的存在將豐富miRNA-靶基因調(diào)控的層次。此前也有綜述中提到，可逆的翻譯抑制可能是植物應(yīng)對環(huán)境脅迫的一種臨時響應(yīng)［96］，盡管這個假設(shè)還沒有被相關(guān)研究證實。2012年在蒺藜狀苜蓿（Medicago truncatula）被根瘤菌侵染的研究中，研究者們發(fā)現(xiàn)了miRNA及其靶基因上附著的核糖體存在動態(tài)變化［97］，該研究在一定程度上支持了這一假說。植物miRNA翻譯抑制與植物響應(yīng)環(huán)境脅迫之間的關(guān)聯(lián)，未來仍然需要更多的研究證實。

相信實驗技術(shù)的不斷精進(jìn)和基因組學(xué)的深入探索，必將推動miRNA作用方式分子機(jī)制研究的進(jìn)步。我們期待miRNA及其他小RNA分子參與的表達(dá)調(diào)控機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)逐步明晰，這將有利于我們進(jìn)一步了解生物體內(nèi)部的運作機(jī)制，促進(jìn)miRNA技術(shù)在抵御逆境脅迫、病毒侵染等領(lǐng)域中的應(yīng)用。