IGF-1R-Stat3信號通路通過激活中期因子表達促進肝癌細胞活力、遷移和侵襲*

陳埏芳， 馮淑芬， 施 穎， 鐘 綠， 李觀宏， 湯紹輝

（暨南大學附屬第一醫(yī)院消化科，廣東廣州510630）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的病理類型，是世界上第五大常見惡性腫瘤，也是腫瘤死亡的第三大原因［1］。雖然近年來HCC 的診療水平有所提高，但我國HCC 患者的5年生存率僅約12%［2］。復發(fā)和轉移是導致HCC患者死亡的兩大主因。因此，研究HCC 發(fā)生和轉移的分子機制，對HCC的個體化精準治療極其重要。

胰島素樣生長因子1 受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）是一種廣泛表達于多種類型細胞表面的酪氨酸激酶跨膜蛋白，主要介導IGF-1和IGF-2 的生物學作用，參與機體物質代謝調節(jié)、細胞增殖分化及胚胎發(fā)育等生物學過程［3-4］。近年研究表明，IGF-1R 在多種惡性腫瘤（包括HCC）中表達水平顯著增高，IGF-1R過表達促進肝癌細胞生長、侵襲與轉移，抑制IGF-1R 表達可能成為HCC 治療的新靶點［5-7］。但是，目前有關IGF-1R調控HCC生長與侵襲轉移的機制尚未完全明確。

IGF-1R 致癌的分子機制涉及Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉導及轉錄激活蛋白（signal transducers and activators of transcription，Stat）信號通路的異常活化［8-11］。Stat3 蛋白屬于 Stat 家族成員，研究顯示Stat3 的激活可以促進HCC 發(fā)生和腫瘤血管形成，與HCC 的進展和預后密切相關［12］。但是目前對IGF-1R-Stat3 通路的研究尚不夠深入，活化狀態(tài)的Stat3調節(jié)下游靶基因的中間環(huán)節(jié)并不明確［8-11］。

我們前期研究顯示，IGF-1R 通過正向調控中期因子（midkine）表達促進HCC 生長與侵襲，而抑制midkine 表達則可以逆轉IGF-1R 對HCC 生長及侵襲的促進作用［7］。但是，IGF-1R 調控 midkine 表達的機制目前國內外尚缺乏系統(tǒng)深入研究。因此，我們對肝癌細胞中IGF-1R-Stat3信號通路與midkine表達調控的關系進行了初步探討，以期為HCC 分子靶向治療提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 臨床標本收集 32例HCC 組織標本（男25例，女 7 例，平均年齡 52.6 歲）、32 例配對癌旁肝組織（matched adjacent nontumorous tissues，MANT）標本（術中切除距離肝癌病灶≥2 cm）和13 例正常成人肝組織（normal adult liver tissues，NALT）標本（男10例，女3例，11例為外傷性肝破裂患者，2例為肝血管瘤患者）于 2006 年 1 月至 2017 年12 月收集于暨南大學附屬第一醫(yī)院。所有患者的診斷均通過病理證實。組織標本離體后立即放入液氮中速凍后轉入超低溫冰箱存放。本研究由暨南大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 細胞株 肝癌細胞株（Huh7 和Hep3B）和正常肝細胞株（HL-7702）購于ATCC。穩(wěn)定敲減IGF-1R表達的Huh7 細胞株及midkine 表達載體已由本課題組前期構建并保存［7］。

1.3 主要試劑 小量質粒抽提試劑盒購于北京全式金生物公司；Lipofectamine?2000 轉染試劑購于Invitrogen；抗Stat3、磷酸化Stat3（phosphorylated Stat3，p-Stat3）和GAPDH 兔單克隆抗體及抗兔IgG（H+L）生物素化抗體購于Cell Signaling Technology；抗midkine 兔單克?。跡P1143Y］抗體購于Abcam；MTT 檢測試劑盒購于Abcam；Transwell 細胞培養(yǎng)板購于BD。

2 方法

2.1 RT-qPCR 實驗 采用TRIzol 試劑盒制備各細胞株及肝組織標本總RNA，驗證總RNA 抽提完整后，逆轉錄合成cDNA 并進行實時熒光定量PCR 分析。采用相對定量法（2-ΔΔCt）表示目的基因表達量。以18S rRNA 作為內參照。引物由蘇州金唯智公司合成。IGF-1R 的上游引物序列為5'-GGTGTC-CAATAACTACATTG-3'，下游引物序列為5'-CAGCGGTTTGTGGTCCAGC-3'；Stat3 的上游引物序列為5'-CATCTTGAGCACTAAGCCT-3'，下游引物序列為5'-GAGATAGACCAGTGGAGACA-3'；midkine的上游引物序列為5'-CTGGGGTGCGTGTGATGGGG-3'，下游引物序列為5'-CTTTGGTCTTGGGGGTGCAG-3'；18S rRNA 的上游引物序列為5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3'，下游引物序列為5'-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3'。

2.2 Western blot 檢測 Stat3、p-Stat3 和 midkine 的蛋白水平 用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，4℃離心，收集上清，采用BCA法測定蛋白濃度，將待測樣品上樣后進行電泳。電泳至PVDF膜后封閉，加入Ⅰ抗和Ⅱ抗。ECL 顯色試劑盒進行顯色，用凝膠成像儀進行拍照，以GAPDH為內參照，分析蛋白表達水平。

2.3 篩選針對Stat3的siRNA（siStat3） 通過查詢GenBank 中人 Stat3 mRNA 序列（NM_139276.2），根據 siRNA 設計原則，設計 3 對 siRNA（Stat3_001、Stat3_002 和Stat3_003）及1 對無任何靶基因的陰性對照siRNA（negative control siRNA，NC siRNA），并委托蘇州金唯智公司合成，序列見表1。培養(yǎng)Huh7細胞至匯合度為30%～50%，采用Lipofectamine ?2000轉染試劑轉染siRNA。實驗分為4組，即陰性對照組（NC siRNA）和3 個實驗組（Stat3_001、Stat3_002和Stat3_003），每組設置3 個siRNA 濃度梯度（25、50和 100 nmol/L）。轉染 24 h 后，按 TRIzol 試劑盒說明抽提Huh7 細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA 并進行定量 PCR 擴增，測定 Stat3 的 mRNA 表達量，引物序列同前。每個樣本同時擴增3個復管，并連續(xù)進行3次實驗。采用2-ΔΔCt表示目的基因表達量。

表1 Stat3 siRNA候選序列Table 1.Candidate sequences of Stat3 siRNA

2.4 IGF-1R 和Stat3 過表達載體的構建 提取Hun7細胞總RNA進行反轉錄。以反轉錄產物cDNA為模板，PCR 擴增。PCR 條件為:94℃ 5 min；98℃30 s，58℃ 30 s，68℃ 20 s，30 個循環(huán)；68℃下延伸5 min；16℃保存。引物由蘇州金唯智公司合成。IGF-1R 的上游引物序列為5'-ccggaattcgccaccATGAAGTCTGGCTCCGGAGGAG-3'，下游引物序列為5'-ctagtctagaTCAGCAGGTCGAAGACTGGGG-3'；Stat3的上游引物序列為5'-GATCCGCTTCAGACCCGTCAACAAACTCGAGTTTGTTGACGGGTCTGAAGTTTTTTG-3'，下游引物序列為5'-AATTCAAAAAACTTCAGACCCGTCAACAAACTCGAGTTTGTTGACGGGTCTGAAGCG-3'。在上、下游分別引入EcoRI 與XbaI 的酶切位點及保護性堿基。用EcoRI 和XbaI 雙酶切質粒載體pcDNA3.1和PCR擴增得到的目的基因，分別收集目的片段后使用T4 連接酶進行連接，構建重組質粒，并進行酶切鑒定和送至蘇州金唯智基因公司進行測序鑒定。

2.5 MTT 法檢測細胞活力 實驗分為5 組:空白對照（blank control，Bla）組（未轉染的Huh7細胞）、IGF-1R 組（瞬時轉染IGF-1R 過表達質粒的Huh7 細胞）、siStat3+midkine 組（瞬時共轉染 siStat3 及 midkine 過表達質粒的Huh7細胞）、shIGF-1R 組（穩(wěn)定敲減IGF-1R表達的Huh7 細胞）和shIGF-1R+Stat3 組（穩(wěn)定敲減IGF-1R表達的Huh7 細胞瞬時轉染Stat3 過表達質粒）。取上述5 組細胞，調整密度為1×108/L，接種至96 孔板，每孔加入 100 μL DMEM 培養(yǎng)液，于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，待貼壁后收集各時點（0、24、48和72 h）細胞，加入MTT，孵育4 h后，用酶標儀在波長570 nm處讀取吸光度。

2.6 Transwell 實驗檢測細胞遷移及侵襲能力 在細胞遷移實驗中，取上述5 組細胞，計數(shù)1×105個細胞，取100 μL 細胞懸液接種于Transwell 小室的上室，下室中加入600 μL 完全培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育12～48 h。取出Transwell 小室，棄培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室內的細胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 洗滌 1 次，用結晶紫染色 10 min，再用 PBS洗滌1 次，顯微鏡下觀察5 個高倍視野計數(shù)，拍照統(tǒng)計結果。檢測細胞侵襲能力時，取Matrigel 加入Transwell 小室中，37℃孵育 2 h 使Matrigel 凝固，余下步驟同遷移實驗。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析，用GraghPad Prism 7 軟件作圖。每次實驗重復3 次，記錄平均值。計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，兩變量相關性評估采用Pearson 積矩相關分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HCC 細胞株及組織中 IGF-1R、Stat3 和 midkine mRNA表達水平上調

RT-qPCR 結果顯示，Huh7 和 Hep3B 細胞中 IGF-1R、Stat3 和 midkine 的 mRNA 表達水平均顯著高于HL-7702 細胞（P＜0.01），見圖1A；HCC 組織中IGF-1R、Stat3 和 midkine 的 mRNA 表達水平均顯著高于MANT 及 NALT（P＜0.01），MANT 中 IGF-1R mRNA表達水平也顯著高于NALT（P＜0.05），見圖1B。線性相關分析結果進一步顯示，HCC 組織中Stat3 和midkine mRNA 表達水平均與IGF-1R mRNA 表達水平呈正相關（r=0.716 和r=0.681，P＜0.01），midkine mRNA 表達水平與Stat3 mRNA 表達也呈正相關（r=0.657，P＜0.01），見圖1C。

Figure 1.The mRNA expression of IGF-1R，Stat3 and midkine was up-regulated in HCC cell lines and tissues.A:the mRNA expression of IGF-1R，Stat3 and midkine in HCC cell lines（Huh7 and Hep3B）and normal liver cell line（HL-7702）was detected by RT-qPCR（n=3）；B:the mRNA expression of IGF-1R，Stat3 and midkine in human HCC tissues（n=32），matched adjacent nontumorous tissues（MANT，n=32）and normal adult liver tissues（NALT，n=13）was detected by RT-qPCR；C:linear correlation analyses among IGF-1R，Stat3 and midkine mRNA expression levels in HCC tissues（n=32）.Mean±SD.**P＜0.01 vs HL-7702 group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs NALT group；##P＜0.01 vs MANT group.圖1 IGF-1R、Stat3和midkine在HCC細胞株和組織中的mRNA表達水平上調

2 siStat3的篩選結果

siStat3 轉染 Huh7 細胞后，RT-qPCR 檢測轉染效果，結果顯示，轉染 Stat3_001、Stat3_002 及Stat3_003的Huh7 細胞中Stat3 mRNA 表達量均有不同程度的降低，抑制效率約為37%～80%，其中Stat3_003 濃度在100 nmol/L 時抑制效率最高，達80%，見表2。因此采用此siRNA用于后續(xù)研究。

3 IGF-1R 通過上調Huh7 細胞Stat3 表達并增加其磷酸化水平而促進midkine表達

RT-qPCR 結果顯示，與空白對照組相比，瞬時上調 IGF-1R 表達，Stat3 和 midkine 的 mRNA 表達水平顯著上調（P＜0.01），見圖2A；Western blot 結果顯示，瞬時上調 IGF-1R 表達后 Stat3、p-Stat3 及 midkine的蛋白水平也顯著上調，見圖2B。

表2 針對Stat3的siRNA篩選結果Table 2.Results of siRNA screening for Stat3

穩(wěn)定敲減IGF-1R表達則可顯著降低Stat3 和midkine 的mRNA 表達水平（P＜0.01）及Stat3、p-Stat3和midkine的蛋白水平，見圖2A、B。

在穩(wěn)定敲減IGF-1R表達的Huh7細胞中，瞬時上調Stat3 表達逆轉了敲減IGF-1R表達所致的midkine mRNA及蛋白表達水平降低（P＜0.01），見圖2A、B。

在Huh7細胞中瞬時敲減Stat3表達，可下調midkine mRNA 及蛋白表達（P＜0.01），瞬時上調Stat3 表達則可上調midkine mRNA 及蛋白表達（P＜0.01），見圖2C、D。

4 IGF-1R 通過激活 Stat3、上調 midkine 表達而增強Huh7細胞活力，促進其遷移和侵襲

MTT 法及 Transwell 實驗結果顯示，在 Huh7 細胞中瞬時上調IGF-1R 表達可顯著增強其活力、遷移能力和侵襲能力（P＜0.01）；瞬時敲減Stat3表達并同時瞬時上調midkine 表達則其活力、遷移能力和侵襲能力無明顯變化（P＞0.05）；而穩(wěn)定敲減IGF-1R表達則顯著抑制Huh7 細胞活力、遷移能力和侵襲能力（P＜0.01）；在穩(wěn)定敲減IGF-1R表達的 Huh7 細胞中瞬時上調Stat3 表達可逆轉敲減IGF-1R表達所致的細胞活力、遷移能力和侵襲能力的抑制（P＜0.01），見圖3、4。

討 論

IGF-1R 是IGF 家族中的一個重要成員。大量研究表明，IGF-1R 在多種惡性腫瘤包括HCC 中的表達水平顯著上調，其致癌機制涉及多條信號通路活化，其中IGF-1R-Stat3 信號通路激活在HCC 發(fā)生中具有重要作用，但Stat3 信號的下游靶分子尚未完全明確［8-11］。

Stat3 是Stat 轉錄因子家族的一員，參與調控細胞增殖、分化、凋亡、血管生成、免疫反應、腫瘤發(fā)生和轉移等病理生理過程［8，10，13-14］，而且對于細胞惡性轉化的建立和維持至關重要［8，13］。此外，midkine 是一種肝素結合生長因子［15］，在胚胎發(fā)育過程中呈現(xiàn)高水平表達，但在正常成人組織表達水平極低［16-17］。最近研究表明，midkine 參與人類多種腫瘤（包括HCC）的發(fā)生發(fā)展［18-21］。

在本研究中，我們檢測到IGF-1R、Stat3 和midkine 在 HCC 細胞株（Huh7 和 Hep3B）和 32 例人 HCC組織中的mRNA 表達水平顯著升高；線性相關分析顯示HCC 組織中Stat3 和midkine mRNA 的表達水平均與IGF-1R mRNA 表達水平呈正相關，midkine mRNA 表達水平也與Stat3 mRNA 表達水平呈正相關。這些結果表明，IGF-1R-Stat3 信號通路和midkine 表達在HCC 中被激活，且前者可能正向調控后者表達。與本研究結果相似，多項研究報道IGF-1R［5-7，22］、Stat3［23-24］及 midkine［25-26］在 HCC 中的表達水平顯著上調。

為進一步明確IGF-1R-Stat3 信號通路與midkine表達之間的聯(lián)系，我們在Huh7 肝癌細胞中進行了過表達或敲減IGF-1R和Stat3的體外細胞實驗。結果顯示，在 Huh 細胞中，IGF-1R 正向調控 Stat3 和 midkine 的 mRNA 表達水平及 Stat3、p-Stat3 和 midkine 的蛋白表達水平；在穩(wěn)定敲減IGF-1R表達的Huh7細胞中，瞬時上調Stat3 表達逆轉了敲減IGF-1R表達所致的midkine mRNA 及蛋白表達水平降低；在Huh7 細胞中瞬時上調或下調Stat3表達，則midkine 的mRNA和蛋白表達水平也出現(xiàn)了同向變化。上述結果表明，在 HCC 細胞中，IGF-1R 通過上調 Stat3 表達并增加其磷酸化水平促進midkine表達；結合前述HCC組織中IGF-1R、Stat3 和midkine 表達的線性相關分析結果，表明IGF-1R-Stat3 信號通路正向調控midkine表達。

為了探討IGF-1R-Stat3信號通路影響midkine 表達對HCC細胞生物學行為的影響，我們在Huh7細胞中過表達或敲減IGF-1R和Stat3及上調midkine 表達后觀察細胞活力、遷移能力和侵襲能力的變化。結果顯示，在Huh7 細胞中瞬時上調IGF-1R 表達可顯著增強其活力、遷移能力和侵襲能力；瞬時敲減Stat3表達并同時瞬時上調midkine 表達則其活力、遷移能力和侵襲能力無明顯變化；而穩(wěn)定敲減IGF-1R表達則顯著抑制Huh-7 細胞活力、遷移能力和侵襲能力；在穩(wěn)定敲減IGF-1R表達的Huh7 細胞中，瞬時上調Stat3 表達可逆轉敲減IGF-1R表達所致的細胞活力、遷移能力和侵襲能力的抑制。

Figure 2.Effect of IGF-1R on the expression of Stat3 and midkine（A，B），and effect of Stat3 on midkine expression（C，D）in Huh7 cells.The mRNA expression of Stat3 and midkine was detected by RT-qPCR（A，C），and the protein levels of Stat3，p-Stat3 and midkine were detected by Western blot（B，D）.Bla:blank control；shIGF-1R:stable knockdown of IGF-1R；IGF-1R:transient over-expression of IGF-1R；Stat3:transient over-expression of Stat3；siStat3:transient knock-down of Stat3.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs Bla group；##P＜0.01 vs shIGF-1R group.圖2 IGF-1R對Huh7細胞Stat3和midkine表達水平及Stat3對Huh7細胞midkine表達水平的影響

Figure 3.Effect of IGF-1R-Stat3 signaling pathway and midkine expression changes on Huh7 cell viability.Bla:blank control；IGF-1R:transient over-expression of IGF-1R；siStat3+midkine:transient knock-down of Stat3 and transient over-expression of midkine；shIGF-1R:stable knockdown of IGF-1R；shIGF-1R+Stat3:stable knockdown of IGF-1R and transient over-expression of Stat3.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs Bla group；##P＜0.01 vs shIGF-1R group.圖3 IGF-1R-Stat3信號通路及midkine表達改變對Huh7細胞活力的影響

Figure 4.Effect of IGF-1R-Stat3 signaling pathway and midkine expression changes on Huh7 cell migration（A）and invasion（B）.Scale bar=50 μm.Bla:blank control；IGF-1R:transient over-expression of IGF-1R；siStat3+midkine:transient knockdown of Stat3 and transient over-expression of midkine；shIGF-1R:stable knockdown of IGF-1R；shIGF-1R+Stat3:stable knockdown of IGF-1R and transient over-expression of Stat3.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs Bla group；#P＜0.05 vs shIGF-1R group.圖4 IGF-1R-Stat3通路及midkine表達改變對Huh7細胞遷移和侵襲的影響

綜上所述，本研究結果提示，IGF-1R-Stat3 信號通路通過激活midkine表達增強HCC細胞活力，促進其遷移和侵襲，而抑制該通路激活則顯著降低HCC細胞的活力、遷移能力和侵襲能力。