氯喹通過抑制NF-κB和MAPK信號通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)*

方明楚， 林振浪

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院新生兒科，浙江溫州325027）

炎癥反應(yīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色。介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的炎癥反應(yīng)是以小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化為特征的病理過程。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的免疫細(xì)胞，靜息狀態(tài)時表現(xiàn)出免疫監(jiān)視的功能，維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；當(dāng)受到炎癥、感染、缺血缺氧等病理刺激時被激活，由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，表現(xiàn)出促炎功能［1］。眾多研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的刺激后會被激活并大量分泌白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP1）、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和一氧化氮（nitric oxide，NO）等促炎因子［2］，而大量釋放的炎癥介質(zhì)參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)并加劇神經(jīng)細(xì)胞的損傷。因此，在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病治療中，如何抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化從而減輕過度炎癥反應(yīng)對神經(jīng)系統(tǒng)造成的損害至關(guān)重要。

氯喹（chloroquine，CQ）是一種應(yīng)用于臨床的抗瘧疾藥物，具有一定的安全性，具有抑制自噬、調(diào)節(jié)免疫、抗炎等多種性能［3］。在體外實(shí)驗研究中，氯喹能顯著抑制脂多糖/內(nèi)毒素誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的抗炎特性［4］。此外，在肺損傷、肝損傷、哮喘和胰腺炎等動物模型實(shí)驗研究中，氯喹能顯著減輕炎癥反應(yīng)起到良好治療效果［5-6］。而當(dāng)前有關(guān)氯喹在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抗炎特性研究較少，且氯喹是否能夠通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化并減少炎癥反應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究觀察了氯喹對脂多糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞炎癥因子釋放的抑制作用，并初步探討了其相關(guān)機(jī)制，旨在為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病提供新的實(shí)驗資料。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗材料

1.1 主要試劑 BV2 細(xì)胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心。DMEM 培養(yǎng)基、鏈/青霉素、無菌PBS溶液和 0.25% 胰蛋白酶溶液（Gibco）；胎牛血清（Hy-Clone）；LPS和氯喹（Sigma）；TRIzol試劑（Roche）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；SYBR Green（Bio-Rad）；引物和 RNase-free H2O（Sangon Biotech）；小鼠 TNF-α 和IL-6 ELISA 試劑盒（eBioscience）；抗 NF-κB p65 和IκB-α 抗體（Santa Cruz）；抗JNK、p-JNK、p38 和p-p38抗體（Cell Signaling Technology）；IgG-488Ⅱ抗（Abcam）；IgG-HRP Ⅱ抗（Bioworld）。

1.2 主要儀器 倒置顯微鏡和正置熒光顯微鏡（Nikon）；CFX96 TouchTM熒光定量 PCR 儀及 SDSPAGE電泳儀、電轉(zhuǎn)儀和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2 實(shí)驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將小鼠BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞置于飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱（5% CO2、37℃）中，用DMEM 培養(yǎng)基（含10 mg/L 鏈霉素、1×105U/L 青霉素、10 mmol/L 谷氨酰胺及10%胎牛血清）培養(yǎng)BV2 細(xì)胞。1～2 d更換1次培養(yǎng)基，5 d左右傳代，選取優(yōu)良生長狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。氯喹和LPS 粉末均用無菌PBS 溶液溶解。實(shí)驗分為對照（control）組、LPS 組和LPS+CQ組。根據(jù)實(shí)驗要求，將BV2細(xì)胞均勻鋪于6 孔板中，LPS+CQ 組的 BV2 細(xì)胞預(yù)先給予 10 μmol/L的氯喹處理30 min 后再給予LPS 刺激，在LPS 組和LPS+CQ 組中加入 500 μg/L 的 LPS 分別作用 30 min、6 h和24 h。

2.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變 LPS刺激24 h 后，將BV2 細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察。每組樣品取3個不同視野計數(shù)，重復(fù)3次?；罨疊V2細(xì)胞的相對數(shù)=（多極型細(xì)胞數(shù)量+紡錘樣雙極細(xì)胞數(shù)量）/總細(xì)胞數(shù)量。

2.3 RT-qPCR 檢 測 BV2 細(xì) 胞 內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的mRNA 表達(dá)情況 LPS刺激6 h后，收集BV2細(xì)胞，按TRIzol 試劑盒說明書抽提細(xì)胞總RNA，測定總RNA濃度并鑒定純度，然后根據(jù)RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA 通過熒光定量PCR 的方法，檢測熒光信號強(qiáng)度，然后轉(zhuǎn)化成Ct 值。以β-actin 作為內(nèi)參照來消除因標(biāo)本處理、PCR 反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄不同而出現(xiàn)的差異。因此，用目的指標(biāo)mRNA 與內(nèi)參照β-actin mRNA 含量的比值作為該指標(biāo)的mRNA 表達(dá)水平指標(biāo)。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.4 ELISA 檢測 BV2 細(xì)胞上清液中 TNF-α 和 IL-6蛋白的含量 LPS刺激24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液1 mL 于EP 管中，離心后取上清按照ELISA 檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作，測定上清液中TNF-α 和IL-6的蛋白水平。

2.5 Western blot 檢測 BV2 細(xì)胞內(nèi) IκB-α 蛋白表達(dá)情況及JNK 和p38 蛋白的磷酸化水平 LPS 刺激30 min 后，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS 清洗3 次，每孔加入80 μL 細(xì)胞裂解液并于冰上裂解20 min。刮刀均勻刮取孔內(nèi)的細(xì)胞，吸取至EP 管內(nèi)，4℃、12 000 r/min離心10 min。BCA 法測定上清液蛋白濃度，配制20 μL體系（40 μg總蛋白/泳道），100 ℃變性10 min?？偟鞍捉?jīng)10% SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% BSA 室溫封閉 90 min，TBST 洗膜后加入抗 IκB-α抗體（1∶300 稀釋）、抗p-JNK 抗體（1∶1 000 稀釋）、抗p-p38 抗體（1∶1 000 稀釋）和抗β-actin 抗體（1∶3 000稀釋），放置在4℃搖床中過夜，次日取出后置室溫放置1 h，TBST 洗膜后加入Ⅱ抗（1∶10 000 稀釋），室溫?fù)u床中孵育2 h，TBST洗膜，曝光、顯色。膜再生后加入抗 JNK 抗體（1∶1 000 稀釋）、p38 抗體（1∶1 000 稀釋）4℃搖床中過夜，次日取出后于室溫放置1 h，TBST洗膜后加入Ⅱ抗（1∶10 000稀釋），室溫?fù)u床孵育2 h，TBST 洗膜，曝光、顯色。以IκB-α/β-actin、p-JNK/JNK和p-p38/p38灰度比值進(jìn)行定量分析。

2.6 免疫熒光染色法檢測BV2 細(xì)胞內(nèi)NF-κB 蛋白的核內(nèi)移位情況 取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于內(nèi)置細(xì)胞拍片的6 孔板中（每孔1×106個）。進(jìn)行分組處理，LPS 刺激 30 min 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗 2 次。細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗3 次。0.1% Triton X-100 孵 育 10 min 后 ，PBS 清 洗 。 5%BSA 室溫封閉30 min，棄去多余的封閉液，不洗。滴加抗NF-κB p65抗體（1∶300稀釋），4℃孵育過夜。次日取出，PBS清洗。滴加熒光Ⅱ抗（1∶1 000稀釋），避光室溫孵育1 h。PBS 避光清洗后，滴加DAPI 染核7 min。PBS 避光清洗，滴加抗熒光淬滅劑封片后于正置熒光顯微鏡下觀察拍片。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism 5 軟件中單因素方差分析的Tukey 法來分析數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氯喹對LPS刺激下BV2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

LPS 刺激24 h 后，倒置顯微鏡下觀察各組BV2細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果顯示，對照組絕大部分BV2 細(xì)胞形態(tài)呈圓形或者橢圓形，提示細(xì)胞處于靜息狀態(tài)；LPS組大多數(shù)細(xì)胞的形態(tài)呈分枝樣改變，體積較靜息狀態(tài)下增大，且部分細(xì)胞向多極細(xì)胞轉(zhuǎn)變或向兩級延長、呈紡錘樣改變，提示LPS 組存在較多呈現(xiàn)活化形態(tài)的BV2 細(xì)胞；而在LPS+CQ 組中，呈現(xiàn)活化形態(tài)的BV2 細(xì)胞數(shù)量較LPS 組顯著減少。通過統(tǒng)計呈現(xiàn)活化形態(tài)的BV2 細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量的比值，我們發(fā)現(xiàn)LPS 組中呈現(xiàn)活化形態(tài)的BV2 細(xì)胞數(shù)占總BV2 細(xì)胞數(shù)量的比值顯著高于對照組（P＜0.01），而預(yù)先給予氯喹能夠明顯降低活化細(xì)胞數(shù)比值（P＜0.05），見圖1。

2 氯喹對 LPS 刺激下 BV2 細(xì)胞釋放 TNF-α 和 IL-6的影響

LPS 刺激 6 h 后，我們通過 RT-qPCR 來檢測 BV2細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-6的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，LPS組BV2 細(xì)胞內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的 mRNA 水平相比于對照組均顯著上升（P＜0.01），而LPS+CQ 組BV2 細(xì)胞內(nèi)TNF-α 和 IL-6 的 mRNA 表達(dá)水平較 LPS 組均明顯降低（P＜0.01），見圖2A。LPS 刺激24 h 后，我們采用ELISA 法來檢測上清液中炎癥因子的含量，結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α 和IL-6 的表達(dá)水平較對照組均顯著上升（P＜0.01）；而預(yù)先給予氯喹在蛋白水平上明顯抑制了 TNF-α 和IL-6 的表達(dá)（P＜0.05），見圖2B。由此可見，CQ 能抑制 LPS 誘導(dǎo)BV2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

3 氯喹對LPS 刺激下BV2 細(xì)胞中MAPK 信號通路的影響

LPS 刺激 30 min 后，我們通過 Western blot 測定MAPK 家族中與炎癥密切相關(guān)的p38 和JNK 蛋白磷酸化的程度。結(jié)果顯示，相比于對照組，LPS 刺激后顯著提高了BV2 細(xì)胞內(nèi)p38 和JNK 蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）；與LPS 組相比，預(yù)先給予氯喹明顯抑制了BV2 細(xì)胞內(nèi)p38 和JNK 蛋白的磷酸化水平（P＜0.05），見圖3。由此可見，CQ 是通過抑制 MAPK 信號通路來減輕LPS刺激的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的。

Figure 1.The effect of CQ on the morphological changes of LPS-induced BV2 microglia.Scale bar=200 μm.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖1 氯喹對LPS刺激下BV2細(xì)胞形態(tài)改變的影響

Figure 2.Effects of CQ on LPS-induced TNF-α and IL-6 production in the BV2 microglia.A:relative mRNA levels of TNF-α and IL-6 were detected by RT-qPCR；B:the secretion of TNF-α and IL-6 was detected by ELISA.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.圖2 氯喹對LPS刺激下BV2細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6的影響

4 氯喹對LPS 刺激下BV2 細(xì)胞中NF-κB 信號通路的影響

LPS 刺激 30 min 后，我們采用 Western blot 方法檢測IκB-α蛋白降解的情況，并通過免疫熒光來觀察NF-κB p65 蛋白的核內(nèi)轉(zhuǎn)移情況。Western blot 結(jié)果顯示，相比于對照組，LPS 組細(xì)胞內(nèi) IκB-α 蛋白水平明顯降低（P＜0.01），提示LPS刺激后IκB-α蛋白大量降解；而預(yù)先給予氯喹后IκB-α 蛋白表達(dá)較LPS組顯著增加（P＜0.05），提示氯喹可以減少 LPS 所致的IκB-α 蛋白降解，見圖4A。免疫熒光結(jié)果顯示，對照組中NF-κB p65的綠色熒光主要聚集在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，且強(qiáng)度較弱；而 LPS 刺激后，NF-κB p65 的綠色熒光大量聚集在細(xì)胞核內(nèi)，且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，提示LPS 刺激會使BV2 細(xì)胞中NF-κB p65 蛋白表達(dá)增多，且由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移；相比于LPS 組，LPS+CQ 組BV2 細(xì)胞核內(nèi)的綠色熒光減少且強(qiáng)度有所下降，反而胞質(zhì)內(nèi)的綠色熒光表達(dá)有所增多。由此可見，CQ還可通過抑制NF-κB 信號通路來減輕LPS 刺激下BV2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

Figure 3.Effects of CQ on LPS-induced phosphorylation of JNK and p38 in the BV2 microglia.Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.圖3 氯喹對LPS刺激下BV2細(xì)胞內(nèi)p38和JNK的蛋白磷酸化水平

Figure 4.Effects of CQ on the expression of IκB-α（A）and nuclear location of NF-κB（B）in LPS-stimulated BV2 microglia.Scale bar=200 μm.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖4 氯喹對LPS刺激下BV2細(xì)胞中NF-κB炎癥信號通路的影響

討 論

許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程中均有炎癥反應(yīng)的參與［7］。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是神經(jīng)炎癥反應(yīng)的特征之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)展中占據(jù)著重要的位置。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到外傷、感染、缺氧缺血等，小膠質(zhì)細(xì)胞因受病理因素刺激由靜止態(tài)向活化態(tài)轉(zhuǎn)變，引發(fā)過度的炎癥反應(yīng)，誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦外傷、腦缺血再灌注損傷、新生兒腦損傷等疾?。?］。LPS是經(jīng)典的炎癥模型誘導(dǎo)物。LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞被廣泛用于模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)革蘭氏陰性細(xì)菌感染引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化。BV2 細(xì)胞是小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞，具備原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的表型及各項功能。因此，本研究通過LPS 刺激BV2 細(xì)胞建立經(jīng)典的神經(jīng)炎癥細(xì)胞模型。結(jié)合我們課題組前期研究基礎(chǔ)，本研究選擇500 μg/L 的LPS 來刺激BV細(xì)胞建立神經(jīng)炎癥細(xì)胞模型［8］。

氯喹是廣泛應(yīng)用于臨床中的一種抗瘧疾藥物，它具有較好的免疫調(diào)節(jié)和抑制自噬、抗炎等藥理學(xué)作用。當(dāng)前，許多基礎(chǔ)研究表明氯喹在缺血性腦損傷、腦創(chuàng)傷和脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中通過調(diào)節(jié)自噬起到良好的神經(jīng)保護(hù)作用，其有關(guān)抗炎特性的研究較少［9-11］。在神經(jīng)炎癥細(xì)胞模型中，Koch 等［12］的研究表明氯喹能顯著減少LPS 刺激的人類小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子（如TNF-α、IL-6和IL-12）的分泌，但氯喹的抗炎作用是通過何種信號通路來實(shí)現(xiàn)的尚未被闡述。Koch 等［12］研究顯示在 LPS 刺激的人類小膠質(zhì)細(xì)胞中預(yù)先給予10 μmol/L 氯喹就能顯著地減少LPS刺激下的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α，且此濃度下人腦小膠質(zhì)細(xì)胞仍具有較高存活率［12］。故本研究中選擇10 μmol/L的濃度作為氯喹的最適藥物濃度。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)500 μg/L的LPS刺激24 h后，BV2 細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生顯著地改變，BV2 細(xì)胞在LPS 刺激后由靜息態(tài)向活化態(tài)轉(zhuǎn)變，而CQ 組則逆轉(zhuǎn)了這一改變，提示氯喹具有抑制LPS 刺激下BV2 細(xì)胞向活化方向轉(zhuǎn)變的作用。

活化的小膠質(zhì)細(xì)胞會分泌過多的炎癥因子，尤其是促炎因子。TNF-α 和IL-6 是促炎性細(xì)胞因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中起著重要作用，它們除了能直接損傷神經(jīng)元外，還能刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子和NO 等炎癥介質(zhì)加劇神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷［13］。因此，本研究對 TNF-α 和 IL-6 這兩種炎癥因子的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示BV2細(xì)胞在 LPS 刺激后 TNF-α 和 IL-6 的 mRNA 及蛋白水平均增加，證實(shí)我們所建立的炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型是成功的。而預(yù)先給予氯喹能顯著下調(diào)LPS 活化的BV2 細(xì)胞內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的 mRNA 和蛋白的表達(dá)。由此可見，氯喹能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著抑制LPS活化的BV2 細(xì)胞過度表達(dá)促炎因子，進(jìn)一步證實(shí)了氯喹能減輕LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

在LPS 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過程中，LPS激活MAPK 和NF-κB信號通路，從而促進(jìn)多種促炎因子基因表達(dá)和炎癥因子產(chǎn)生、釋放［14］。MAPK是小膠質(zhì)細(xì)胞氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要激酶，調(diào)控促炎因子、趨化因子、酶類的基因表達(dá)。MAPK 家族成員包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、JNK 和p38，三者主要以非磷酸化形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。其中p38，JNK 作為應(yīng)激活化蛋白激酶在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。過度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠通過提高M(jìn)APK 家族中3 個亞型的磷酸化水平來調(diào)控神經(jīng)炎癥因子的產(chǎn)生。因此，我們也檢測了氯喹對LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中JNK和p38 磷酸化水平的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給予氯喹能顯著抑制BV2 細(xì)胞內(nèi)JNK 和p38 的磷酸化。NF-κB 是是關(guān)鍵的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，在靜息細(xì)胞中，NF-κB 和其抑制劑 IκB-α 緊密結(jié)合形成 NF-κBIκB 復(fù)合物并定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；而 LPS 刺激下，IκB-α發(fā)生磷酸化或被降解，NF-κB從NF-κB-IκB復(fù)合物解離并入核促進(jìn)炎癥因子基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄，此時將釋放大量的炎癥因子［2，15］。本研究檢測了氯喹對 LPS 誘導(dǎo)的 BV2 細(xì)胞中 IκB-α 和 NF-κB 蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示預(yù)先給予氯喹能顯著抑制LPS 刺激下BV2細(xì)胞中IκB-α 的降解，且能顯著減少NF-κB 由胞漿向核內(nèi)移位。由此可見，氯喹顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與降低JNK 和p38 蛋白磷酸化水平及抑制NF-κB核內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

在LPS、缺氧、缺血等病理性刺激下，小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面的Toll 樣受體如TLR4 表達(dá)會上調(diào)，從而激活MAPK 和 NF-κB 信號通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［2，14，16］。此外許多研究表明氯喹可通過抑制TLR4/MAPK、TLR4/NF-κB 信號通路從而抑制LPS 刺激下巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［4，17］。因此，我們推斷氯喹在BV2細(xì)胞中也可能是通過抑制 TLR4 介導(dǎo)的 MAPK、NF-κB 信號通路來減輕LPS 刺激下炎癥反應(yīng)的，這需要我們在后續(xù)實(shí)驗中進(jìn)一步證實(shí)。

雖然LPS 具有熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，但當(dāng)前關(guān)于氯喹和LPS 在接觸小膠質(zhì)細(xì)胞之前是否存在相互作用后影響LPS 的活性及LPS 激活小膠質(zhì)細(xì)胞的能力未知。這一點(diǎn)是本研究設(shè)計的缺陷，將在后續(xù)實(shí)驗中進(jìn)一步驗證。

綜上所述，氯喹能減少LPS 刺激下的BV2 細(xì)胞分泌促炎因子以減輕炎癥反應(yīng)，表明氯喹具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，這將為后續(xù)治療小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病提供相應(yīng)的實(shí)驗資料。