HET0016對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用研究*

許 燕， 舒仕瑜

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院麻醉科，2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，重慶400000）

小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的巨噬細(xì)胞，一直以來(lái)被認(rèn)為是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)抵御病原入侵的第一道防線［1］。在正常的大腦內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞能不斷運(yùn)動(dòng)，執(zhí)行多種功能，例如突觸調(diào)節(jié)、吞噬凋亡的細(xì)胞碎片、防御感染等。當(dāng)組織發(fā)生損傷時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)遷移到損傷部位周?chē)?，發(fā)揮屏障作用［2］。但是在腦缺血、感染等病理狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞可被迅速激活，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞將釋放多種炎癥因子，包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）等，從而誘導(dǎo)周?chē)?xì)胞損傷。已有研究表明，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷（如神經(jīng)退行性疾?。?］、腦出血［4］等）中起著重要的作用。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化并減少炎癥因子釋放，對(duì)緩解神經(jīng)系統(tǒng)損傷炎癥反應(yīng)有重要意義［5］。

花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)著機(jī)體的細(xì)胞分化、增殖、激素分泌、凝血及纖溶系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡等生理過(guò)程。20-羥二十烷四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）是AA 的代謝產(chǎn)物，其水平上升對(duì)于炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、心血管疾病發(fā)生等都有重要意義［6］。HET0016 是 20-HETE合成酶的抑制劑，研究證實(shí)HET0016 可減小小鼠腦梗死局灶性缺血的體積，并改善神經(jīng)功能評(píng)分，其機(jī)制與增強(qiáng) Na+-K+-ATP 酶活性有關(guān)［7］。此外，有實(shí)驗(yàn)證明，HET0016可通過(guò)抑制 MMP-9 表達(dá)、JNK 通路和氧化應(yīng)激以激活緊密連接蛋白的表達(dá)，從而減輕實(shí)驗(yàn)性創(chuàng)傷后腦水腫，發(fā)揮保護(hù)腦屏障功能［8］。但是HET0016 是否能在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮作用，目前并不清楚。

核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一種快反應(yīng)因子，以無(wú)活性的形式廣泛存在于多種組織和細(xì)胞中，被激活以后參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［9］。近年來(lái)的研究顯示，NF-κB 活化與神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）、帕金森病（Parkinson disease，PD）等［10］的發(fā)生有密切的聯(lián)系。此外，在小膠質(zhì)細(xì)胞中，NF-κB 激活可通過(guò)核移位而參與調(diào)節(jié)炎癥因子的基因表達(dá)，而阻斷NF-κB 所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)很可能是修復(fù)中樞神經(jīng)相關(guān)損傷的途徑之一［11］。本研究通過(guò)分離、培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察HET0016 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力及遷移的影響，進(jìn)一步檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)水平及NF-κB 信號(hào)通路中p50 和p65 兩種蛋白的表達(dá)情況，為探究小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 儀器和試劑

HET0016（Sigma）；抗 CD11b、p50 和 p65 抗體（Abcam）；DMEM/F12 培養(yǎng)液、PBS 和0.25%胰蛋白酶（HyClone）；胎牛血清（Gibico）；CCK-8 試劑盒（Dojindo）；20-HETE ELISA 試劑盒（上海生工）；TNF-α 和IL-1β ELISA 試劑盒（北京欣博盛生物科技有限公司）。

2 主要方法

2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 取出生24 h 內(nèi)SD 大鼠放入75%乙醇中進(jìn)行浸泡消毒，取出小鼠并轉(zhuǎn)移至無(wú)菌干凈的平皿中，用剪刀剪開(kāi)顱骨，取出腦組織，剪去腦干后置于D-Hanks 洗液中清洗，去除血污后轉(zhuǎn)移至新的盛有D-Hanks 洗液的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，仔細(xì)去除腦組織表面腦膜和血管（盡量在15 min 內(nèi)完成）。將剝離完血管膜的組織放入預(yù)置有1 mL 解剖液的青霉素小瓶中，用顯微剪剪碎（＜1 mm×1 mm×1 mm），加入2 滴DNA 酶和1 mL 胰酶（胰酶終濃度為0.125%），于37℃孵箱中孵育15 min。結(jié)束后取出小瓶，將液體轉(zhuǎn)移至離心管中，并加5 mL 完全培養(yǎng)液，900×g離心 5 min 棄上清，重懸在 5 mL 無(wú)血清培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)移至75 cm2培養(yǎng)瓶中，加入10 mL 完全培養(yǎng)液（37℃預(yù)熱）。5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，全量換液，以后每3 d半量換液。

2.2 小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純化 待原代細(xì)胞培養(yǎng)到9～14 d 時(shí)，細(xì)胞充分分層生長(zhǎng)，用封口膜封閉培養(yǎng)瓶瓶口，將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫振蕩搖床上，在160×g下震蕩6 h，收集上清至無(wú)菌離心管中，400×g離心8 min，棄上清，加入4 mL 無(wú)血清培養(yǎng)液輕輕吹打重懸，均勻滴加于24孔培養(yǎng)板的中央4個(gè)孔中，于孵箱中培養(yǎng)半小時(shí)使小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁，取出，吸出上清，再向每個(gè)孔加1 mL 培養(yǎng)液，所得細(xì)胞可用于細(xì)胞純度鑒定及下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色 取種于載玻片中的小膠質(zhì)細(xì)胞，PBS 洗3 次，每次5 min。加入4%多聚甲醛進(jìn)行固定，20 min 后用PBS 清洗三次，每次5 min。用0.1%Triton X-100進(jìn)行破膜處理，一共3次，每次5 min。將載玻片置于濕盒內(nèi)，加入5%山羊血清，室溫封閉30 min。加入抗CD11b 抗體（1∶200）于4℃過(guò)夜孵育。將載玻片從濕盒中取出，PBS 洗3 次，每次5 min。加入Goat anti-Rat IgG H&L（1∶1 000）置于濕盒內(nèi)，室溫孵育30 min。用PBS 洗3 次，每次5 min。DAPI（1∶2 000）染核10 min。PBS洗3次，每次5 min，用免疫熒光防淬滅劑封片，晾干后置于熒光顯微鏡下觀察。

2.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 取小膠質(zhì)細(xì)胞，分為對(duì)照（control）組（培養(yǎng)液+細(xì)胞）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）組（50 μg/L LPS+培養(yǎng)液+細(xì)胞）、HET0016 組（1 μmol/L HET0016+培養(yǎng)液+細(xì)胞）和LPS+HET0016 組（50 μg/L LPS+1 μmol/L HET0016+培養(yǎng)液+細(xì)胞）；其中LPS 和HET0016 的處理時(shí)間均為24 h，共處理時(shí)先用LPS處理24 h，再用HET0016處理24 h。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)S 期細(xì)胞比例 處理結(jié)束后，將小膠質(zhì)細(xì)胞離心收集，用300 μL 含10%胎牛血清的PBS 重懸，轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 的EP 管中，加入0.7 mL 無(wú)水乙醇，于4℃固定過(guò)夜；次日，將EP 管于500×g離心 1 min 后，加入 1 mL PBS 重懸細(xì)胞，再加入400 μL 50 mg/L PI，避光孵育10 min，用流式細(xì)胞術(shù)分析S期細(xì)胞比例。

2.6 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將小膠質(zhì)細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，以每孔100 μL（含約8 000 個(gè)細(xì)胞）細(xì)胞懸液接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后，按照實(shí)驗(yàn)分組在培養(yǎng)板加入不同濃度的待測(cè)物，處理結(jié)束后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，向每個(gè)孔加入CCK-8 工作液（100 μL 培養(yǎng)液+10 μL CCK-8 溶液），于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度（A）。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）/（對(duì)照組A值-空白組A值）×100%。

2.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

2.7.1 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞消化離心后，用完全培養(yǎng)液重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞稀釋成為1×108/L 的細(xì)胞懸液；先向Transwell 板中加入500 μL的完全培養(yǎng)液，將小室放入板中；再向Transwell小室中加入 200 μL 的細(xì)胞懸液，將 Transwell 板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；處理結(jié)束后，取出Transwell 小室，吸掉培養(yǎng)液，用PBS 清洗。最后用結(jié)晶紫溶液染色10 min，PBS 清洗去除多余染料后，置于顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算遷移細(xì)胞的數(shù)量。

2.7.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取適量小膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，用200 μL吸頭垂直于培養(yǎng)板劃痕；用PBS 清洗細(xì)胞3 次，去除細(xì)胞碎片和未貼壁細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)液，立刻在顯微鏡下觀察，并拍攝劃痕區(qū)域圖像（即0 h）；繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，再次于同一區(qū)域進(jìn)行觀察并拍攝（即24 h）。

2.8 ELISA 法檢測(cè) 20-HETE、TNF-α 和 IL-1β 的水平 將小膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約4×105個(gè)，并分為對(duì)照組、LPS 組、HET0016 組和 LPS+HET0016組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，處理結(jié)束后收集細(xì)胞上清液進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。按照20-HETE、TNF-α 和IL-1β 檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行測(cè)定，在酶標(biāo)儀中于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)的濃度。

2.9 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 依次提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。制備用于SDSPAGE 的凝膠，每孔加入 40 μg 細(xì)胞總蛋白，90 V 電泳約30 min 后，調(diào)整電壓至120 V，電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)玻璃板底部。取出凝膠，采用濕轉(zhuǎn)法于磚模夾子中210 mA 電泳2 h，蛋白可被轉(zhuǎn)到PDVF 膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h；TBST 清洗 3 次，每次 5 min；加入 I 抗（抗p50 和p65 抗體均按1∶1 000 稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜；TBST 清洗3 次，每次5 min；加入II 抗，室溫孵育2 h；TBST 清洗 3 次，每次5 min；結(jié)束后加入顯色劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，在多功能凝膠成像系統(tǒng)下，觀察并拍照分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和純度鑒定

分離并培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞后，顯微鏡下可見(jiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，單個(gè)細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)或橢圓形，從胞體發(fā)出兩個(gè)或多個(gè)突起，胞體形態(tài)清晰，生長(zhǎng)附著良好，成團(tuán)情況少見(jiàn)，見(jiàn)圖1A、B。進(jìn)一步用免疫熒光法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞特異性表面抗原CD11b（呈綠色熒光），用DAPI 標(biāo)記其胞核（呈藍(lán)色熒光）。結(jié)果顯示，視野內(nèi)所見(jiàn)細(xì)胞均呈綠色熒光，證實(shí)所檢測(cè)的細(xì)胞為CD11b 陽(yáng)性細(xì)胞，即為小膠質(zhì)細(xì)胞，見(jiàn)圖1C、D。這說(shuō)明通過(guò)本方法可獲得狀態(tài)良好、純度較高的小膠質(zhì)細(xì)胞，可用于繼續(xù)培養(yǎng)并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2 HET0016對(duì)LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

CCK-8 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS 組小膠質(zhì)細(xì)胞活力顯著提高（P＜0.01）；當(dāng) HET0016 濃度為0.5～1.5 μmol/L 時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞的活力顯著下降（P＜0.05）；當(dāng)應(yīng)用1 μmol/L 的HET0016處理小膠質(zhì)細(xì)胞24～48 h 時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞活力相比于LPS 組也有所下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，HET0016處理小膠質(zhì)細(xì)胞的濃度為1 μmol/L，處理時(shí)間為24 h。

Figure 2.HET0016 inhibited the viability of microglia induced by LPS.A:the effects of different concentrations of HET0016 on the viability of microglia；B:the viability of microglia after treated with 1 μmol/L HET0016 for different time.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖2 HET0016抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活力

3 HET0016對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞上清液20-HETE 水平的影響

ELISA 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS 組小膠質(zhì)細(xì)胞上清液 20-HETE 水平顯著上升（P＜0.05），HET0016 處理組20-HETE 水平顯著下降（P＜0.05）；與 LPS 組相比，LPS+HET0016 組 20-HETE 水平顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

4 HET0016對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞S期比例的影響

Figure 3.The level of 20-HETE was decreased in the supernatant of microglia after HET0016 treatment.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖3 HET0016下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞上清液20-HETE水平

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對(duì)照組、HET0016組、LPS組和LPS+HET0016 組小膠質(zhì)細(xì)胞S 期比例分別為36.19%、27.37%、43.8%和34.48%；與對(duì)照組相比，LPS 處理能夠增加 S 期細(xì)胞百分比（P＜0.05）；而與LPS 組相比，LPS+HET0016 組S 期細(xì)胞百分比下降，即HET0016 處理能降低S 期細(xì)胞百分比（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

5 HET0016對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS組穿膜小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著增多（P＜0.05）；與LPS 組相比，HET0016 組和LPS+HET0016 處理組穿膜細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)圖5A。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS 組劃痕縮減面積顯著大于對(duì)照組（P＜0.05）；與 LPS 組相比，HET0016 組和 LPS+HET0016 組劃痕縮減面積顯著減?。≒＜0.05），見(jiàn)圖5B。這2 個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，均說(shuō)明HET0016 能抑制LPS 引起的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移。

6 HET0016 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子（TNF-α 和IL-1β）釋放的影響

ELISA 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS 組小膠質(zhì)細(xì)胞上清液TNF-α和IL-1β水平顯著上升（P＜0.05）；與 LPS 組相比，HET0016 組和 LPS+HET0016 組小膠質(zhì)細(xì)胞上清液 TNF-α 和 IL-1β 水平顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

7 HET0016 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞 NF-κB 通路 p50 和 p65蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS 組p50 和p65 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS組相比，HET0016 組和 LPS+HET0016 組 p50 和 p65蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖7。

Figure 4.HET0016 decreased the S-phase proportion in microglia induced by LPS.Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖4 HET0016降低LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞S期比例

討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的免疫細(xì)胞，介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的內(nèi)源性免疫反應(yīng)。有研究證實(shí)，LPS 可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化并大量釋放NO、TNF-α、IL-6 等炎癥因子，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)；與此同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞的大量增殖將使得更多小膠質(zhì)細(xì)胞被活化，從而加重神經(jīng)系統(tǒng)的損傷［12］。而應(yīng)用非甾體抗炎藥水楊酸甲酯糖苷處理LPS 刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞，可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-6 的釋放，且不同程度地抑制iNOS、COX-1和COX-2蛋白的表達(dá)，以緩解小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)LPS刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用［13-14］。因此，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化及炎癥反應(yīng)對(duì)緩解神經(jīng)系統(tǒng)的損傷有著重要意義。

Figure 5.HET0016 inhibited the migration of microglia exposed to LPS.A:results of Transwell assay；B:results of scratch wound healing assay.Scale bar=20 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖5 HET0016抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移

Figure 6.HET0016 decreased the levels of TNF-α（A）and IL-1β（B）in the supernatant of microglia.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖6 HET0016下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞上清液TNF-α和IL-1β水平

Figure 7.HET0016 decreased the protein expression of p50 and p65 in microglia.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖7 HET0016下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞p50和p65蛋白表達(dá)水平

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS可引起小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移能力增強(qiáng)，炎癥因子IL-1β 和TNF-α 的水平均有所增加，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［15］。小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移能力增強(qiáng)將導(dǎo)致更多小膠質(zhì)細(xì)胞被活化，釋放大量炎癥因子，其中，IL-1β 和TNF-α 都被證實(shí)參與了神經(jīng)炎癥反應(yīng)［13］。此外，本研究還檢測(cè)到LPS 能引起20-HETE 表達(dá)增加，而已有研究指出20-HETE的增加不僅與腦梗死的發(fā)生相關(guān)［16］，還可以通過(guò)激活NF-κB 促進(jìn)血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)［17］。HET0016作為20-HETE 合成的特異性抑制劑，對(duì)20-HETE 的抑制效果比17-十八炔酸（17-octadecynoic acid，17-ODYA）和1-氨基苯并三唑（1-aminobenzotriazole，1-ABT）更為明顯，因此在很多由于20-HETE 失衡導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病及心血管疾病中具有潛在價(jià)值［18-20］。本研究進(jìn)一步探究HET0016 在LPS 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用，結(jié)果顯示，HET0016在有效降低20-HETE水平的同時(shí)，不僅抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移，還減少了LPS 所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-1β 和TNF-α的釋放。與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似的是，HET0016在其它疾病模型中也發(fā)揮了一定作用。有研究證實(shí)，HET0016 能抑制缺血/再灌注大鼠模型中的超氧陰離子的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化程度，降低血腦屏障通透性，以減輕腦水腫［18］。而在紋狀體腦出血小鼠模型中，HET0016 可減少活化小膠質(zhì)細(xì)胞和變性壞死神經(jīng)元的數(shù)量，減小腦損傷體積，從而減輕腦出血后周?chē)窠?jīng)的損傷［21］。而在本研究中，HET0016 可通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活力和遷移能力，減少炎癥因子釋放，進(jìn)而減輕小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)機(jī)體的損傷。

NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于多種細(xì)胞中，激活后參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中有重要的意義。有研究顯示，雷公藤內(nèi)酯可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，緩解神經(jīng)系統(tǒng)損傷，其機(jī)制與下調(diào) NF-κB 的表達(dá)有關(guān)［22］。另外，20-HETE 可通過(guò)激活NF-кB 通路，進(jìn)一步對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮氧化應(yīng)激和促炎作用，參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展［23］。由于 NF-κB 以 p65/p50 異源二聚體發(fā)揮主要作用，因此本研究檢測(cè)了p50 和p65 蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LPS 處理后細(xì)胞內(nèi)p50 和p65 蛋白的表達(dá)水平顯著上升，而HET0016 處理不僅下調(diào)細(xì)胞中p50 和p65 蛋白表達(dá)水平，且抑制LPS 所引起的p50 和p65 蛋白表達(dá)上調(diào)。此外，p65/p50 蛋白表達(dá)水平增加還見(jiàn)于急性腎損傷模型、食管鱗癌組織等［24-25］。張思思等［26］研究證實(shí)，羥基積雪草苷可以有效抑制LPS 刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子生成，其機(jī)制也與抑制 NF-κB 的表達(dá)有關(guān)，因此 NF-κB 可能是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的重要途徑之一。由于激活的NF-κB 需要轉(zhuǎn)移入核內(nèi)才能發(fā)揮功能，因此盡管HET0016 處理引起的p50 和p65 蛋白表達(dá)水平下調(diào)可在一定程度上抑制NF-κB 通路的功能，但是其中的機(jī)制需要更深入的研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示HET0016 能抑制LPS刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移能力，減少炎癥因子的釋放，其發(fā)揮作用的途徑很可能與NF-κB 通路有關(guān)，然而更深入的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。