大鼠DRG內(nèi)ClC-3敲減導(dǎo)致的TNF-α/IL-10失衡對電壓門控性鈉通道表達(dá)和機(jī)械痛敏的影響*

汪小芳， 何蘇月， 馬卓琳， 楊 杰， 龐瑞萍△

（1中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，中山大學(xué)疼痛研究中心，廣東廣州510080；2暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，廣東廣州510632）

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain）是由神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性損害或功能障礙引起的疼痛，以觸誘發(fā)痛、痛覺過敏及自發(fā)性疼痛為特征。外周感覺傳入神經(jīng)元興奮性異常增強(qiáng)導(dǎo)致的外周敏感化是神經(jīng)病理性疼痛的重要發(fā)病機(jī)制［1-2］。但外周敏感化的分子機(jī)制目前尚不完全清楚。

ClC-3 是電壓門控性氯通道ClC 家族中的一員，當(dāng)它表達(dá)在細(xì)胞膜上時可作為離子通道，表達(dá)在溶酶體膜上時可作為Cl-/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體［3-6］，在調(diào)控細(xì)胞興奮性、跨上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞容積和胞內(nèi)細(xì)胞器的酸化中具有重要作用［7-8］。我們前期的研究顯示，ClC-3 在大鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元中高表達(dá)，當(dāng)外周神經(jīng)損傷后，DRG 神經(jīng)元的ClC-3 表達(dá)顯著下調(diào)，敲除小鼠ClC-3可引起DRG神經(jīng)元興奮性異常增高，動物出現(xiàn)機(jī)械痛敏（mechanical allodynia），恢復(fù)ClC-3 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)機(jī)械痛敏［9］。上述結(jié)果表明，ClC-3參與調(diào)控DRG神經(jīng)元的興奮性，從而參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生，但ClC-3調(diào)控DRG神經(jīng)元興奮性的具體機(jī)制尚不明確。

神經(jīng)元上的電壓門控性鈉通道（voltage-gated sodium channels，VGSC）是決定神經(jīng)元興奮性的重要因素。迄今發(fā)現(xiàn)的VGSC 至少有10 種（Nav1.1～Nav 1.9和Nax），其中至少8個亞型分布于DRG。Nav1.3主要表達(dá)于胚胎期DRG，但在受損的DRG 可出現(xiàn)高表達(dá)；Nav1.7、Nav1.8 和 Nav1.9 表達(dá)于外周初級感覺傳入神經(jīng)元［10］。根據(jù)細(xì)胞分布不同，各種Nav 通道的功能也不盡相同:Nav1.1和Nav1.3主要分布于樹突，通過突觸后電位整合控制神經(jīng)元興奮閾值；Nav1.7主要與感覺神經(jīng)元外周末梢初始動作電位的生成有關(guān)；Nav1.8 主要參與動作電位的生電作用；Nav1.9則可能與靜息電位調(diào)節(jié)有關(guān)［11］。

大量研究表明，外周神經(jīng)損傷可上調(diào)致炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)，而上調(diào)的TNF-α可增加DRG神經(jīng)元Nav1.3、Nav1.7和Nav1.8表達(dá)［12-14］，抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）可逆轉(zhuǎn)TNF-α 的作用［15］。以上研究表明，DRG 局部細(xì)胞因子的失衡可直接調(diào)控神經(jīng)元鈉通道的表達(dá)，從而導(dǎo)致DRG 神經(jīng)元興奮性異常增高，產(chǎn)生自發(fā)放電和異位放電，導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生［16］。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射ClC-3shRNA腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus carryingClC-3shRNA，AAV-ClC-3shRNA）可明顯降低 ClC-3 的mRNA 和蛋白表達(dá)，大鼠出現(xiàn)機(jī)械痛敏；免疫熒光及Western blot 結(jié)果表明DRG 組織中致炎細(xì)胞因子TNF-α 的表達(dá)增加，抗炎細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)降低，DRG 組織 Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8 和 Nav1.9 的表達(dá)上調(diào)，提示細(xì)胞因子的失衡可能是ClC-3下調(diào)導(dǎo)致VGSC表達(dá)增加進(jìn)而觸發(fā)機(jī)械痛敏的重要機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF 級雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，4～5 周齡，體質(zhì)量100～120 g，由中山大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號為SCXK（粵）2016-0029。

2 主要試劑

AAV-ClC-3shRNA 和 AAV-scrambled shRNA 購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；兔抗大鼠ClC-3（ACL-001）、Nav1.3（ASC-004）、Nav1.7（ASC-008）和Nav1.9（ASC-017）多克隆抗體均購自Alomone Labs；兔抗大鼠Nav1.8（ab63331）和IL-10（ab9969）多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔II 抗及RT-qPCR 試劑盒購自 Abcam；兔抗 TNF-α 多克隆抗體（BS1857）購自Bioworld；由捷瑞公司設(shè)計并合成引物；其余生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)。

3 主要方法

3.1 AAV 介導(dǎo) shRNA 的構(gòu)建 用 AAV9 載體構(gòu)建ClC-3shRNA 和scrambled shRNA，其元件順序為U6-MCS-CAG-eGFP（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）。ClC-3shRNA 的序列為 5'-CACAGACGGATCAACAGTAAA-3'；scrambled shRNA 的序列為5'-CGCTGAGTACTTCGAAATGTC-3'。

3.2 建立敲減ClC-3表達(dá)的大鼠模型與實驗分組實驗前對大鼠進(jìn)行痛行為學(xué)檢測，痛閾正常者納入實驗，具體實驗設(shè)計見圖1A。參照文獻(xiàn)［15］，對大鼠進(jìn)行鞘內(nèi)置管術(shù)，異氟烷吸入麻醉后，將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺上，腰部剃毛消毒，選擇第4、5 腰椎間隙作為手術(shù)部位，逐層剪開皮膚，充分暴露間隙位置，用1 mL 無菌注射器的針頭刺破筋膜和韌帶，見腦脊液流出，將提前準(zhǔn)備好的無菌聚乙烯管輕柔置入。取肢體無運(yùn)動障礙的大鼠，從導(dǎo)管內(nèi)注射2%利多卡因7 μL，立即（15 s 內(nèi)）出現(xiàn)雙后肢癱瘓并持續(xù)20～30 min 的動物納入實驗。實驗動物隨機(jī)分為AAV-ClC-3shRNA 組、AAV-scrambled shRNA 組和溶劑對照組，每組24 只，從管內(nèi)分別注射10 μL 陽性病毒、陰性病毒或溶劑+10 μL生理鹽水。

3.3 疼痛行為學(xué)的檢測 采用von Frey hair 檢測不同處理組不同時點(diǎn)大鼠雙后爪撤足閾值（paw withdrawal threshold，PWT）的變化。檢測前將大鼠放置在動物專用測試室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境20～30 min，使用up-down 方法選用8 根強(qiáng)度呈對數(shù)遞增的von Frey hair檢測大鼠50%的PWT。強(qiáng)度由小到大，測試時hair垂直放置于大鼠足底，微彎，在大鼠足心部保持8～9 s，出現(xiàn)快速撤足為陽性反應(yīng)，若反應(yīng)缺失則選擇下一個更強(qiáng)的刺激，直至最大值。

3.4 免疫熒光觀察 各組大鼠腹腔注射20%烏拉坦（8 mL/kg）麻醉后，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管進(jìn)入升主動脈，灌注4℃生理鹽水500 mL 沖凈血液，再用4%多聚甲醛固定液（pH 7.4）灌注500 mL。取雙側(cè)L4～6 節(jié)段的DRG，放入4%多聚甲醛后固定1 h，轉(zhuǎn)入30%蔗糖脫水7 d。進(jìn)行冠狀冰凍切片，DRG切片厚 16 μm。PBS 洗 3 遍，室溫下封閉 1 h，加入 I抗4℃輕搖孵育過夜。次日復(fù)溫至室溫后，PBS 洗3遍。加入兔抗Cy3 標(biāo)記的 II 抗（1∶400；Jackson Immuno Research），室溫下避光孵育 1 h，PBS 洗 3 次。貼片封片后，使用熒光顯微鏡（Olympus IX71）觀察及拍照，利用ImageJ 對各組中圖片的免疫熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。

3.5 Western blot 實驗 各組動物腹腔注射20%烏拉坦（8 mL/kg）麻醉后，于冰上取雙側(cè)L4～6 DRG 放入液氮中冷凍，加入SDS 裂解液（10 μL/mg）和蛋白磷酸酶抑制劑勻漿并超聲破碎再低溫離心后取上清液-80℃保存待用，上清SDS-PAGE進(jìn)行分離，后蛋白濕轉(zhuǎn)入PVDF 膜上。經(jīng)1%BSA 室溫封閉1 h，然后再在4℃環(huán)境下與I 抗一起輕搖孵育過夜。第2 天取出在室溫復(fù)溫1 h，用TBST 洗4 遍，與對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗（1∶10 000；Abcam）孵育1 h 后，TBST洗4遍，ECL顯色曝光，再經(jīng)CCD攝像頭拍攝顯影條帶，使用Image-Pro Plus 軟件對圖像進(jìn)行灰度分析。對每個目的條帶進(jìn)行總灰度值的分析，并用βactin的總灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

3.6 RT-qPCR 實驗 各組大鼠腹腔注射20%烏拉坦（8 mL/kg）麻醉，取雙側(cè)DRG 分別放置不同RNasefree 的 EP 管中，每管內(nèi)加入 500 μL TRIzol 輕柔吹打約20 次，用事先DEPC 處理且高壓滅菌過的研磨棒將組織研磨碎，加入100 μL 氯仿用力搖1 min，靜置3 min后于4℃、12 000 r/min 離心15 min，吸出200 μL上清轉(zhuǎn)移到新RNase-free EP 管中，加入200 μL異丙醇，上下輕搖30 次左右，靜置10 min 后于4℃、12 000 r/min 離心 10 min，棄上清，加入 1 mL DEPC水配制的75%乙醇溶液，4℃、7 500 r/min 離心5 min，將液體吸干，待殘余液體揮發(fā)后，加入適量DEPC 水溶解RNA 沉淀，使用超微量分光光度計（NanoDrop 2000）測定RNA 濃度和質(zhì)量，A260/A280比值在1.8～2.0之間的樣品方可進(jìn)行后續(xù)步驟。將RNA 濃度調(diào)至統(tǒng)一后，使用PrimeScript RT Master Mix 試劑盒和S1000? PCR 儀（Bio-Rad）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用 TB Green Premix Ex Taq 試劑盒和 CFX96 Touch 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（Bio-Rad）測定ClC-3 的mRNA表達(dá)。ClC-3和內(nèi)參照β-actin的引物序列見表1。采用 2-ΔΔCt法計算，先將各組 ClC-3 mRNA 與 β-actin mRNA 相比，再以空白對照組為1 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其他各組ClC-3 mRNA 表達(dá)量是與對照組相比的相對值。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

4 統(tǒng)計學(xué)處理

通過SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。行為學(xué)數(shù)據(jù)組間比較用兩因素重復(fù)測量方差分析（two-way repeated measures ANOVA），其它數(shù)據(jù)組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）繼以 Tukey 檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 鞘內(nèi)注射AAV-ClC-3 shRNA 降低DRG 中ClC-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平

AAV 轉(zhuǎn)染28 d 后取DRG 組織切片，熒光顯微鏡觀察到病毒轉(zhuǎn)染組神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯綠色熒光（eGFP 表達(dá)），表明轉(zhuǎn)染效率較高，且熒光強(qiáng)度在兩組間無顯著差異，見圖1B。RT-qPCR、免疫熒光染色及Western blot 結(jié)果表明，與溶劑組相比，AAV-ClC-3shRNA組ClC-3的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），而 scrambled shRNA 組無明顯變化，見圖1C～E。

2 大鼠鞘內(nèi)注射AAV-ClC-3 shRNA 誘導(dǎo)雙側(cè)機(jī)械觸誘發(fā)痛

大鼠基礎(chǔ)（baseline，BL）機(jī)械撤足閾值測量后，鞘內(nèi)注射 AAV-ClC-3shRNA、scrambled shRNA 或溶劑，14 d 后AAV-ClC-3shRNA 組雙側(cè)后爪機(jī)械撤足閾值下降，至21 d 接近谷底，并持續(xù)至少2 周以上，見圖2。

3 敲減ClC-3 表達(dá)上調(diào)DRG 神經(jīng)元VGSC 亞型Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9的表達(dá)

Figure 1.The mRNA and protein levels of ClC-3 in rat DRG tissues after intrathecal injection of AAV-ClC-3 shRNA.A:experiment design was showed；B:green fluorescence in L5 DRG was observed on day 28 after AAV-scrambled shRNA-eGFP or AAVClC-3 shRNA-eGFP injection；C，D:the mRNA and protein levels of ClC-3 in the DRG tissues were decreased in ClC-3 shRNA group but not in scrambled shRNA group；E:ClC-3 fluorescence signaling in DRG neurons treated with ClC-3 shRNA，scrambled shRNA and vehicle.Scale bar=50 μm.Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs vehicle group.圖1 鞘內(nèi)注射AAV-ClC-3 shRNA可減少DRG組織中ClC-3的mRNA和蛋白表達(dá)

Figure 2.Intrathecal injection of AAV-ClC-3 shRNA induced mechanical allodynia in the rats.The changes of bilateral paw withdrawal thresholds in the rats treated with ClC-3 shRNA，scrambled shRNA and vehicle were showed.BL:baseline.The arrows indicate the intrathecal injection time.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vehicle group.圖2 鞘內(nèi)注射AAV-ClC-3 shRNA可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)機(jī)械痛敏

鞘內(nèi)注射AAV 病毒后28 d 取DRG 組織，做免疫熒光染色及Western blot 檢測，結(jié)果表明AAV-ClC-3shRNA 組 VGSC 亞 型 Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8 和Nav1.9 表達(dá)較溶劑組顯著增加（P＜0.01），而scrambled shRNA組的變化不明顯，見圖3、4。

Figure 3.Nav1.3，Nav1.7，Nav1.8 and Nav1.9 were up-regulated in the DRG tissues after knockdown of ClC-3 expression（immunofluorescence staining，scale bar=50 μm）.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vehicle group.圖3 敲減DRG組織ClC-3表達(dá)可增加Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9的表達(dá)

4 敲減 ClC-3 的表達(dá)增加 DRG 神經(jīng)元 TNF-α 表達(dá)，減少IL-10表達(dá)

鞘內(nèi)注射AAV 后28 d 取DRG 組織，免疫熒光染色及Western blot 結(jié)果表明，AAV-ClC-3shRNA 組的致炎細(xì)胞因子TNF-α 表達(dá)明顯增加，而抗炎細(xì)胞因子IL-10 表達(dá)明顯減少（P＜0.01），這2 種細(xì)胞因子在scrambled shRNA 組的變化均不顯著，見圖5。

討 論

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，外周神經(jīng)損傷（保留性神經(jīng)損傷，spared nerve injury，SNI）大鼠DRG 的ClC-3表達(dá)下調(diào)，且這種下調(diào)與機(jī)械痛閾值降低正相關(guān)，因此我們猜測ClC-3 表達(dá)下調(diào)可能是導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的重要機(jī)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠ClC-3可使DRG 神經(jīng)元動作電位閾值降低，重復(fù)放電頻率增加，興奮性異常增高，動物出現(xiàn)明顯的機(jī)械觸誘發(fā)痛；恢復(fù)神經(jīng)損傷模型大鼠DRG 神經(jīng)元ClC-3 表達(dá)可顯著減輕觸誘發(fā)痛，表明ClC-3通過調(diào)控外周感覺神經(jīng)元的興奮性參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生［9］。但ClC-3 調(diào)控背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元興奮性的機(jī)制尚不清楚。

Figure 4.The protein levels of Nav1.3（A），Nav1.7（B），Nav1.8（C）and Nav1.9（D）in the DRG tissues after knockdown of ClC-3 expression were determined by Western blot.Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs vehicle group.圖4 敲減DRG組織ClC-3表達(dá)可提高Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9蛋白的表達(dá)水平

Figure 5.TNF-α was up-regulated while IL-10 was down-regulated in the DRG tissues after knockdown of ClC-3 expression.A:immunofluorescence staining for TNF-α and IL-10 in the DRG tissues treated with ClC-3 shRNA，scrambled shRNA and vehicle（scale bar=50 μm）；B:the results of Western blot for determining the protein levels of TNF-α and IL-10 in the DRG tissues treated with ClC-3 shRNA，scrambled shRNA and vehicle.Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs vehicle group.圖5 敲減DRG組織ClC-3表達(dá)可提高TNF-α、降低IL-10的蛋白表達(dá)水平

雖然我們前期采用ClC-3全身性敲除發(fā)現(xiàn)ClC-3是調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生的關(guān)鍵分子，但全身性敲除ClC-3影響范圍廣泛，作用機(jī)制復(fù)雜。為揭示ClC-3下調(diào)導(dǎo)致機(jī)械痛敏的DRG機(jī)制，本研究采用鞘內(nèi)注射AAV-ClC-3shRNA 的方法，特異性敲減DRG組織ClC-3的表達(dá)，再進(jìn)行相關(guān)實驗。結(jié)果表明DRG組織ClC-3 下調(diào)的大鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)下即出現(xiàn)明顯的機(jī)械觸誘發(fā)痛，并持續(xù)至少2 周以上，說明DRG 的ClC-3 下調(diào)即可導(dǎo)致神經(jīng)組織興奮性增加，進(jìn)而導(dǎo)致外周敏感化，引起機(jī)械痛敏。

外周神經(jīng)損傷時，初級感覺傳入特別是未受損DRG 神經(jīng)元的興奮性增高引起的異位放電是觸誘發(fā)痛的重要原因［12，17］。決定神經(jīng)元興奮性最重要的因素是神經(jīng)元上VGSC 的激活。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的VGSC中，Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8 和 Nav1.9 被認(rèn)為是與痛信號最相關(guān)的因素［18］，這幾種VGSC亞型以不同的方式調(diào)控DRG 神經(jīng)元電生理特性［19］。在軸突切斷或其他形式的神經(jīng)損傷后，原本主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的 Nav1.3 可以在 DRG 中高表達(dá)［20］。對慢性縮窄性損傷（chronic constriction injury，CCI）大鼠鞘內(nèi)注射Nav1.3 反義寡核苷酸可顯著降低脊髓背角神經(jīng)元的高興奮性，減輕痛相關(guān)行為［21］。許多研究表明，Nav1.7與痛覺異常密切相關(guān)，其功能缺失性突變可導(dǎo)致先天性痛覺缺失，功能獲得性突變則導(dǎo)致DRG 神經(jīng)元興奮性異常增高，出現(xiàn)紅斑性肢痛癥等［22-23］。Nav1.8 主要表達(dá)于 DRG 小神經(jīng)元，參與動作電位超射和重復(fù)發(fā)放。神經(jīng)損傷時在未受損神經(jīng)元Nav1.8 表達(dá)上調(diào)［12-13］，參與神經(jīng)元高興奮性的形成。小分子干擾RNA 敲減Nav1.8可以逆轉(zhuǎn)CCI 大鼠的機(jī)械觸誘發(fā)痛［24］，選擇性Nav1.8 阻斷劑可抑制多種痛行為［25-26］。Nav1.9 多表達(dá)于 DRG 小神經(jīng)元，可能參與靜息電位的形成，一般認(rèn)為在炎性痛中具有重要作用［27］。由于多種亞型鈉通道均參與了神經(jīng)病理性疼痛的形成，因此針對某一種鈉通道的抑制劑的防治效果有限。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)敲減ClC-3明 顯 上 調(diào) VGSC 亞 型 Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8 和Nav1.9 的蛋白表達(dá)，提示ClC-3 是調(diào)控多種VGSC 亞型表達(dá)的共同上游調(diào)控分子，可能成為防治神經(jīng)病理性疼痛的重要靶點(diǎn)。

盡管我們的研究結(jié)果顯示敲減ClC-3表達(dá)可增加Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9的表達(dá)，但ClC-3 調(diào)控上述VGSC 表達(dá)的機(jī)制還不清楚。已有研究表明，在外周神經(jīng)損傷時，DRG 局部致炎細(xì)胞因子增加、抗炎細(xì)胞因子減少可使多種VGSC亞型的表達(dá)增加，DRG 神經(jīng)元興奮性增高，導(dǎo)致外周傳入信號異常增多，是引起觸誘發(fā)痛的重要機(jī)制［12-15］。為明確DRG 局部炎癥微環(huán)境是否是ClC-3 下調(diào)導(dǎo)致各種VGSC 亞型表達(dá)增加的原因，我們進(jìn)一步分析了敲減ClC-3表達(dá)對致炎細(xì)胞因子TNF-α 和抗炎細(xì)胞因子IL-10 表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲減DRG 組織ClC-3表達(dá)可以明顯增加TNF-α 表達(dá)，但減少IL-10 表達(dá)，表明促炎和抗炎細(xì)胞因子的失衡是DRG 組織ClC-3 下調(diào)促進(jìn)不同亞型VGSC表達(dá)增加的重要機(jī)制。

綜上所述，DRG組織ClC-3表達(dá)下調(diào)是導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)鍵機(jī)制。ClC-3 表達(dá)下調(diào)通過促進(jìn)致炎細(xì)胞因子表達(dá)、降低抗炎細(xì)胞因子表達(dá)而上調(diào)Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8 和Nav1.9 的表達(dá)，增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性，最終引起機(jī)械痛敏。這些結(jié)果提示維持ClC-3表達(dá)水平是防治神經(jīng)病理性疼痛的重要策略。