高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定睫毛增長液化妝品中的比馬前列素

潘 晨，許 勇，韓 晶，彭興盛，鄭 榮

(上海市食品藥品檢驗所，國家藥監(jiān)局化妝品監(jiān)測評價重點實驗室，上海 201203)

比馬前列素(Bimatoprost)屬于前列腺素類似物(結(jié)構(gòu)式見圖1)，是用于治療青光眼和高眼壓的降眼壓處方藥比馬前列素液滴眼液(商品名Lumigan)的有效成分[1-2]，由美國Allergan公司研制，該公司先后獲準上市了0.03%和0.01%的比馬前列素液滴眼液。臨床試驗發(fā)現(xiàn)，比馬前列素具有引起睫毛增長的副作用[3]。于是，Allergan公司于2008年底推出用于治療眼睫毛稀少癥(Eyelash hypotrichosis)[4]的Latisse(含0.03%比馬前列素眼科溶液)，該藥是首個也是唯一一個獲得FDA許可用于睫毛增長、增粗、增黑的藥物，歸入處方藥物管理。目前，Allergan公司擁有比馬前列素藥物用于刺激睫毛生長的全球獨家專利。但比馬前列素除了會刺激睫毛生長外，還會對眼部產(chǎn)生副作用，如刺激皮膚內(nèi)黑色素細胞的生長，眼周黑色素沉積，眼瞼發(fā)癢發(fā)腫，眼睛疼痛、結(jié)膜充血等，長期過量使用會造成視神經(jīng)損傷，導(dǎo)致視力下降甚至失明[5-7]。

近年來，某些化妝品廠商為提高市場競爭力，利用比馬前列素刺激睫毛生長的副作用，在睫毛增長液類化妝品中違規(guī)添加該成分，使得消費者在獲得睫毛增長效果的同時也飽受其帶來的如眼睛刺激、瘙癢、黑眼圈、結(jié)膜充血等傷害。目前，我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)[8]的禁限用組分列表中未提及比馬前列素，國外如歐盟化妝品法規(guī)(EC)NO 1223/2009[9]附件Ⅱ(禁用物質(zhì))和附件Ⅲ(限用物質(zhì))中也未作相關(guān)規(guī)定。但比馬前列素作為藥理活性成分，附帶可預(yù)見性的危害，不應(yīng)添加在化妝品中。值得注意的是，歐盟已重視并在近幾年多次通報并召回含比馬前列素的睫毛增長液，其中也有來自中國的產(chǎn)品，然而我國對于睫毛增長液化妝品中比馬前列素的監(jiān)管目前仍是空白。因此，為規(guī)范化妝品市場秩序，確保化妝品質(zhì)量安全，保障消費者使用安全，建立睫毛增長液化妝品中比馬前列素含量的檢測方法已迫在眉睫。

圖1 比馬前列素的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of bimatoprost

目前，比馬前列素的報道主要集中于藥品、生物制品等領(lǐng)域，分析方法主要為高效液相色譜法[10-12]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]?；瘖y品中比馬前列素的檢測方法僅有幾篇外文文獻報道，如Johansson等[15]曾報道了利用液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(LC-QTOF-MS)和核磁共振(NMR)技術(shù)對非藥用產(chǎn)品中未知活性成分的通用篩查方法，其中包含睫毛增長液中前列腺素類似物的篩查，但未作定量分析；Wittenberg等[16]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測定化妝品中的前列腺素類似物，基于QuEChERS液-液萃取法處理樣品，并采用氘代內(nèi)標定量，該方法前處理程序相對繁瑣，氘代內(nèi)標成本高，也較難獲得。為盡快監(jiān)測國內(nèi)化妝品市場中比馬前列素的使用情況，本文通過簡單、快速的溶劑提取，建立了一種科學(xué)、高效的睫毛生長液中比馬前列素的HPLC-MS/MS測定方法，填補了我國化妝品中比馬前列素測定的空白，為加快化妝品行業(yè)的質(zhì)量監(jiān)管和補充完善相關(guān)檢驗方法提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 UPLC/6495 MS/MS液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；Sartorius CP224S和225D-1CN電子天平(德國賽多利斯公司)；5800型超聲儀(美國Branson公司)；MS3渦旋混合器(德國IKA公司)；5810R型臺式離心機(德國Eppendof公司)；Milli-Q Reference A+型超純水儀(美國Millipore公司)。

比馬前列素標準品(純度99%，上海源葉生物科技有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國默克公司)；甲酸、乙酸銨(色譜純，德國Sigma公司)。

1.2 標準溶液配制

標準中間溶液：精密稱取比馬前列素標準品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，搖勻，配成質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的標準儲備液，于-18 ℃避光保存。精密吸取上述標準儲備液1 mL，用甲醇稀釋定容至100 mL棕色容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1.0 μg·mL-1的標準中間溶液。

標準工作溶液：精密吸取適量標準中間溶液，用50%(體積分數(shù))甲醇溶液稀釋制得質(zhì)量濃度分別為0.5、1、5、10、20、50、100 ng·mL-1的系列標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

精確稱取試樣0.2 g(準確至0.001 g)至50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL 50%甲醇溶液渦旋3 min，充分混勻，以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液適量經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，待測，同步進行空白試驗。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(4.6 mm×100 mm×2.7 μm)；流動相：5 mmol·L-1乙酸銨(含0.02%甲酸)(A)-乙腈(B)(體積比55∶45)，等度洗脫；柱溫30 ℃；流速0.3 mL·min-1；進樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子電離模式(ESI+)；毛細管電壓：3 500 V；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流速：14 L·min-1；霧化器壓力：1.378 bar；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11 L·min-1；裂解電壓：380 V；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

考察了水-乙腈、乙酸銨-乙腈、甲酸/乙酸銨-乙腈3種流動相體系對比馬前列素的色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)果顯示，以水-乙腈為流動相時待測物峰形有拖尾現(xiàn)象，在加入5 mmol·L-1乙酸銨后得以改善。另外，向流動相中添加一定量甲酸可提高比馬前列素的離子化效率，因此實驗考察了水相中添加不同體積分數(shù)(0.01%、0.02%、0.05%、0.1%)甲酸對測定的影響。結(jié)果顯示，甲酸含量為0.02%時待測物的響應(yīng)最高。通過優(yōu)化，最終確定采用含0.02%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨水溶液-乙腈(體積比55∶45)為流動相等度洗脫，此時比馬前列素可在5 min內(nèi)獲得良好的峰形和響應(yīng)，其總離子流圖見圖2。

圖2 比馬前列素標準溶液的總離子流圖(50 ng·mL-1)Fig.2 Total ion chromatogram of bimatoprost(50 ng·mL-1)

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

以1.0 μg·mL-1比馬前列素標準溶液進行質(zhì)譜條件優(yōu)化，在正模式下全掃描。結(jié)果顯示，[M+H]+峰響應(yīng)非常低，[M+Na]+豐度最高，為抑制加鈉峰的出現(xiàn)嘗試向流動相中添加一定量乙酸銨，但并無明顯改善[16]。文獻報道對比APCI源和ESI源測定馬前列素的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)APCI源雖可在一定程度上減少[M+Na]+，但整體靈敏度比ESI低[16]。由于[M+Na]+峰容易受分析環(huán)境影響而不穩(wěn)定，在定量分析時應(yīng)盡量避免使用。另外，進行全掃描時還發(fā)現(xiàn)存在豐度較高的[M+H-H2O]+、[M+H-2H2O]+、[M+H-3H2O]+峰，這可能是因為比馬前列素為多羥基化合物，電離時容易脫水得到系列[M+H-nH2O]+峰，因此最終采用響應(yīng)高且穩(wěn)定的[M+H-H2O]+(m/z398.2)為母離子，再利用二級質(zhì)譜掃描確定其子離子，選擇響應(yīng)好且穩(wěn)定的2個子離子(m/z362.2、317.1)組建MRM離子對，并優(yōu)化確定其它質(zhì)譜參數(shù)(表1)。

表1 比馬前列素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of bimatoprost

2.3 前處理條件優(yōu)化

比馬前列素在甲醇、乙腈等有機溶劑中均具有較好的溶解度，考慮到乙腈毒性大且成本高，故選擇甲醇為的提取劑。由于市售睫毛增長液為水溶液狀態(tài)，加入溶劑渦旋即可充分混勻，為簡化操作步驟，比較了不同甲醇含量(100%、80%、50%、30%)超聲(10 min)和渦旋(3 min)的提取效率。結(jié)果顯示，以100%甲醇提取時比馬前列素的峰形前展，其余3種比例甲醇提取后的峰形對稱，回收率均高于90%，且以50%甲醇的提取效率最高，故選擇50%甲醇為提取溶劑。通過實驗比較顯示，超聲10 min和渦旋3 min的提取效率無明顯差異，為節(jié)約時間成本，故選擇渦旋3 min進行提取。而對一些不能很好分散或溶解的樣品，可進行超聲處理。

由于化妝品基質(zhì)中含有大量表面活性劑和脂溶性物質(zhì)，實驗考察了Captiva EMR-Lip脂質(zhì)凈化柱對樣品的凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在空白基質(zhì)樣品中添加5.0 μg·g-1比馬前列素，經(jīng)Captiva EMR-Lip脂質(zhì)凈化柱重力自洗脫后的回收率低于50%，表明Captiva EMR-Lip凈化柱不適用于目標物凈化，故前處理過程不采用脂質(zhì)凈化柱凈化。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)會影響方法的準確度和精密度，通常采用提取后添加法評價[17-18]，同時考慮到基質(zhì)效應(yīng)的增強或抑制程度一般隨分析物濃度的不同而發(fā)生改變，因此本研究采用基質(zhì)匹配標準曲線的斜率與溶劑配制標準曲線的斜率之比來考察基質(zhì)效應(yīng)，若比值小于1，則為基質(zhì)抑制效應(yīng)，反之為基質(zhì)增強效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個樣品組(質(zhì)量濃度均為0.5、1.0、5.0、10、20、50 ng·mL-1)的斜率比值為0.92、0.94、0.92，表明該方法存在一定程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，采用基質(zhì)匹配標準曲線定量可較好地消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高結(jié)果準確性。

2.5 線性關(guān)系、檢出限及定量下限

選用不含比馬前列素的空白樣品，按照“1.3”方法進行樣品前處理，取濾液作為稀釋液，配制比馬前列素質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、5.0、10、20、50、100 ng·mL-1的系列標準溶液，分別進樣5 μL，以比馬前列素的定量離子對峰面積為縱坐標(y)，對應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(x，ng·mL-1)進行線性回歸。結(jié)果顯示，比馬前列素在0.5～100 ng·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，線性方程為y=1 706.4x-7.559 6，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.998 2。以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10計算得檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)分別為0.015、0.05 μg·g-1，可滿足分析要求。

2.6 回收率與相對標準偏差

取空白樣品0.2 g，分別加入一定量比馬前列素標準溶液，配成低(0.05 μg·g-1)、中(0.5 μg·g-1)和高(5.0 μg·g-1)3個水平的加標溶液，在優(yōu)化條件下，每個濃度平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。結(jié)果顯示，3個加標濃度下比馬前列素的平均回收率分別為98.6%、101%、99.2%，RSD(n=6)分別為2.4%、2.1%、1.2%，表明該方法的準確度和精密度良好，可滿足檢測要求。

2.7 實際樣品檢測

在優(yōu)化條件下，應(yīng)用本方法對10批市售睫毛增長液化妝品進行測定，其中3批次樣品中檢出比馬前列素，含量為205.6～282.1 μg·g-1，其中含量為282.1 μg·g-1的陽性樣品總離子流圖見圖3。由此可見，目前睫毛增長液化妝品中違規(guī)添加比馬前列素成分的現(xiàn)象較為嚴重，監(jiān)管部門應(yīng)當盡快引起重視。

圖3 典型陽性樣品的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of a typical sample

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定睫毛增長液化妝品中比馬前列素含量的分析方法，該方法簡單快速、靈敏度高、操作性強，滿足睫毛增長液化妝品中比馬前列素的定性和定量分析要求，可為后期開展風(fēng)險監(jiān)測及有效監(jiān)管化妝品的非法添加提供技術(shù)支持。