頂空-氣相色譜法測(cè)定依度沙班原料藥中8 種有機(jī)溶劑

徐艷梅，郭永輝，裴麗娟，蓋成，高燕霞

（1.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊 050011； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院制劑科，石家莊 050031）

依度沙班（edoxyaban）是一種新型Xa 因子抑制劑［1-2］，其特點(diǎn)是起效快，抗凝效果可逆，具有劑量依賴等。2011 年4 月22 日，日本第一三共公司研發(fā)的依度沙班在日本上市，2015 年以來，美國(guó)FDA、歐洲藥品管理局和瑞士藥品管理局相繼批準(zhǔn)依度沙班用于非瓣膜性房顫患者腦卒中及系統(tǒng)性栓塞、急性靜脈栓塞患者深靜脈血栓和肺栓塞的預(yù)防及治療［3］，依度沙班成為繼達(dá)比加群、利伐沙班和阿哌沙班之后又一個(gè)獲得FDA 批準(zhǔn)的新型口服抗凝藥（NOAC）。依度沙班原料藥在合成工藝中使用甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷、四氫呋喃和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，這些溶劑的殘留會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生較大的影響［4-14］，輕則導(dǎo)致皮膚損傷、頭痛、食欲不振、頭昏等，重則產(chǎn)生麻醉現(xiàn)象。因此嚴(yán)格控制原料藥中有機(jī)溶劑的殘留量對(duì)保障患者用藥安全具有重要意義。

依度沙班在國(guó)內(nèi)外藥典中均未收載，查閱文獻(xiàn)未見對(duì)依度沙班殘留溶劑的研究。目前有機(jī)溶劑殘留測(cè)定的主要方法為頂空-氣相色譜法，筆者根據(jù)ICH 的指導(dǎo)原則和《中國(guó)藥典》2015 年版四部氣相色譜法和殘留溶劑的相關(guān)規(guī)定［15-16］，采用頂空-氣相色譜法對(duì)上述8 種有機(jī)溶劑量進(jìn)行了研究。該方法可減少主成分對(duì)氣相色譜的污染和測(cè)定結(jié)果的影響，操作簡(jiǎn)單，精密度好，結(jié)果準(zhǔn)確，可快速檢測(cè)依度沙班原料藥中有機(jī)溶劑殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：7890B 型，美國(guó)安捷倫科技公司；

頂空進(jìn)樣器：7695 型，美國(guó)安捷倫科技公司；

電子天平：XS105 型，瑞士梅特勒-托利多公司；

依度沙班原料藥：批號(hào)分別為161111，161112，161113，石家莊醫(yī)藥科技有限公司；

甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷、四氫呋喃和乙酸乙酯對(duì)照品：純度為100%，天津精細(xì)化工有限公司；

N，N-二甲基甲酰胺：色譜純，美國(guó)默克公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 溶液的配制

混合對(duì)照品溶液：精密稱取甲醇對(duì)照品1 000 mg，乙醇對(duì)照品2 000 mg，乙腈對(duì)照品200 mg，二氯甲烷對(duì)照品300 mg，正己烷對(duì)照品200 mg，三氯甲烷對(duì)照品20 mg，四氫呋喃對(duì)照品200 mg，乙酸乙酯對(duì)照品2 000 mg，置于同一100 mL 容量瓶中，加入50%N，N-二甲基甲酰胺水溶液溶解并定容至標(biāo)線，搖勻，即得。

供試品溶液：精密稱取依度沙班原料藥樣品0.5 g，置于頂空瓶中，精密加入50%N，N-二甲基甲酰胺溶劑5 mL，壓蓋密封，振搖溶解，即得。

空白溶液：取50%N，N-二甲基甲酰胺溶劑5 mL 置于頂空瓶中，壓蓋密封，即得。

1.3 色譜條件

色譜柱：DB-624 毛細(xì)管柱［30 m×0.32 mm，1.8 μm，安捷倫科技(中國(guó))有限公司］；程序升溫：起始溫度40℃，保持5 min，以5℃／min 升溫至150℃保持10 min；進(jìn)樣口溫度：150℃；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器；檢測(cè)器溫度：250℃；載氣：高純氮?dú)?，流量?.0mL／min，分流比為10∶1；頂空溫度：80℃；平衡時(shí)間：30 min；頂空進(jìn)樣體積：1 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

先后考察了HP-5，HP-FFAP，DB-624，DBWAX 型等不同極性的色譜柱，由于醇、烷烴、多環(huán)芳烴、脂類的極性不同，最終選擇中等極性的DB-624型毛細(xì)管柱，各待測(cè)有機(jī)溶劑在DB-624 型毛細(xì)管柱的分離度良好。

2.2 升溫程序的選擇

由于甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯的沸點(diǎn)不同，有的又及其接近，故選擇程序升溫，通過改變初始溫度和升溫速率，以達(dá)到分離度的要求。

2.3 頂空條件的選擇

由于待測(cè)有機(jī)溶劑具有揮發(fā)性，采用頂空進(jìn)樣法可以通過控制頂空瓶的溫度和平衡時(shí)間使各待測(cè)物充分氣化，省去了樣品萃取、濃集等步驟，且可有效避免樣品和水對(duì)進(jìn)樣口及色譜柱的污染，同時(shí)也減小了樣品主成分對(duì)分離測(cè)定的干擾。試驗(yàn)先后進(jìn)行了平衡溫度為60，80，100℃和平衡時(shí)間為20，30，40 min 的交叉試驗(yàn)。結(jié)果表明，在平衡溫度為60℃，平衡時(shí)間為30 min 時(shí)，各待測(cè)物在頂空瓶中能夠達(dá)到汽液平衡，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取1.2 中的混合對(duì)照品溶液，供試品溶液各適量，配制成加標(biāo)溶液按1.3 色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到加標(biāo)色譜圖見圖1。由圖1 可知，在該色譜條件下，8 種有機(jī)溶劑及主成分之間的分離度均大于1.5。

圖1 加標(biāo)色譜圖

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

為了考察8 種有機(jī)溶劑在N，N-二甲基甲酰胺溶液中的穩(wěn)定性，取混合對(duì)照品溶液5 mL 置100 mL 容量瓶中，再精密量取5 mL 置于頂空瓶中，壓蓋密封，按1.3 色譜條件分別在0，1，2，3，6，12 h 進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，結(jié)果列于表1。

表1 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表1 可知，甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于3.2%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性 良好。

2.6 線性關(guān)系、檢測(cè)限與定量限

分別精密量取1.2 混合對(duì)照品溶液1，2，5，10，25 mL 置100 mL 容量瓶中，加50%N，N-二甲基甲酰胺溶液稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，得到系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。再分別精密量取5 mL 置于頂空瓶中，壓蓋密封，按1.3 色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以8 種有機(jī)溶劑的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)。以信噪比S／N=3 時(shí)的濃度作為檢出限，以信噪比S／N=10 時(shí)作為定量限。8 種殘留溶劑的線性關(guān)系、檢出限、定量限列于表2。

表2 8 種殘留溶劑的線性關(guān)系、檢出限、定量限

由表2 可知，8 種有機(jī)溶劑在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)r2不小于0.999 6，方法檢出限均不大于15 μg／mL。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號(hào)：13016）0.5 g，按1.2 方法制備供試品溶液，按1.3 色譜條件重復(fù)測(cè)定6 次，結(jié)果列于表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于3.4%，表明方法具有良好的精密度。

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號(hào)：13016）0.5 g，共9 份，置于頂空瓶中，分別加入混合對(duì)照品溶液0.8，1.0，1.2 mL 各3 份，壓蓋密封。按1.3 色譜條件測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果列于表4。由表4 可知，樣品加標(biāo)回收率為92.41%～101.60%，表明加標(biāo)回收率良好。

2.9 供試品的測(cè)定

取3 批樣品（批號(hào)：110111、110112、110113）適量，按1.2 制備供試品溶液，按1.3 色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各有機(jī)溶劑殘留量。結(jié)果表明，3 批樣品中均只檢出正己烷，殘留量均為0.001%。

3 結(jié)語(yǔ)

建立了頂空-氣相色譜法同時(shí)測(cè)定甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷、四氫呋喃和乙酸乙酯8 種有機(jī)溶劑殘留量的分析方法，該方法操作簡(jiǎn)單快速，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。能夠用于測(cè)定依度沙班原料藥中有機(jī)溶劑的殘留，為制定指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表4