膠原膜/國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬雙相支架修復(fù)山羊大面積骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究*

尉曉蔚 劉閣,2 楊帆 楊佳慧 王本杰 于煒婷 趙德偉**

（1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116001；2.大連交通大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，遼寧大連 116028）

因創(chuàng)傷、壞死、炎癥、退變、腫瘤等引起的骨軟骨聯(lián)合病變是骨科常見(jiàn)疾病，其治療一直缺乏有效手段[1-3]。對(duì)于小面積的骨軟骨損傷，馬賽克成形術(shù)是主要治療方法，但存在取材有限、供區(qū)損傷等問(wèn)題[4]；對(duì)于大面積的骨軟骨缺損，最常用的方法是關(guān)節(jié)置換[5]。但應(yīng)用假體存在感染、松動(dòng)、下沉等并發(fā)癥。組織工程雙相支架替代軟骨和骨層是目前研究的熱點(diǎn)，一般由低強(qiáng)度和生物降解支架組成上層軟骨和高強(qiáng)度材料組成底層骨[6]。

鉭金屬抗腐蝕，對(duì)機(jī)體無(wú)刺激，有很強(qiáng)的延展性和堅(jiān)韌度，是生物適應(yīng)性最好的金屬之一[7,8]。但其熔點(diǎn)接近3000℃，傳統(tǒng)工藝方法很難得到孔隙均勻且開(kāi)孔率高的多孔鉭金屬。美國(guó)捷邁是目前唯一能夠生產(chǎn)多孔鉭金屬的器械公司，其產(chǎn)品大量應(yīng)用于骨科領(lǐng)域[9]，但價(jià)格昂貴，屬于國(guó)際壟斷。本課題組采用多孔碳化硅支架聯(lián)合化學(xué)氣相沉積技術(shù)成功制備了多孔鉭金屬[10]。本研究采用纖維蛋白黏合劑將膠原膜及自主研發(fā)的多孔鉭金屬進(jìn)行界面結(jié)合，并探討其修復(fù)山羊大面積骨軟骨缺損的效果，為大面積骨軟骨聯(lián)合病變的臨床治療提供新的組織工程學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑、材料

普通級(jí)實(shí)驗(yàn)山羊32 只，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，10月齡，均為雄性，體重約15 kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證為SYXK（遼）2018-0005。

按照本課題組建立的方法制備多孔鉭金屬支架[10]。該實(shí)驗(yàn)中制備的多孔鉭金屬為直徑10 mm、高10 mm 的圓柱。可降解醫(yī)用膠原膜購(gòu)于瑞士Geistlich Pharma AG 公司。纖維蛋白黏合劑購(gòu)自廣州倍繡生物技術(shù)有限公司。

1.2 膠原膜/國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬雙相支架的制備

1.3 掃描電鏡觀察及能譜分析

將國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬、膠原膜、膠原膜/國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬雙相支架表面真空噴金固定，置于掃描電鏡下觀察微觀形貌并進(jìn)行能譜微區(qū)點(diǎn)或面的成分譜線分析。

1.4 力學(xué)檢測(cè)

采用萬(wàn)能力學(xué)測(cè)試機(jī)分別測(cè)定膠原膜拉力、壓力，國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬壓力，膠原膜和國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬之間界面的結(jié)合力、剪切力。

1.5 骨軟骨缺損動(dòng)物模型的制備

所有山羊的左后肢用于骨軟骨缺損模型的建立。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后，將術(shù)區(qū)消毒鋪巾，暴露股骨頭，用外徑為10 mm的不帶鋸齒的環(huán)鉆在全層軟骨中央部位鑿孔，造成軟骨缺損，并同時(shí)滴注生理鹽水，防止局部過(guò)熱致周?chē)浌菈乃?；然后用外徑?0 mm的帶鋸齒的環(huán)鉆在軟骨缺損區(qū)正下方鑿孔，深度約為10 mm，制備軟骨下骨缺損。沖洗關(guān)節(jié)腔內(nèi)碎屑，測(cè)量鑿孔直徑為10 mm，深度為12 mm，則骨軟骨聯(lián)合缺損模型制備成功。

1.6 動(dòng)物觀察及分組

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字表法分為單純膠原膜組、單純國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬組、雙相支架組、單純骨軟骨缺損組4組，每組各8只。建模成功后，單純骨軟骨缺損組不做任何治療，而其余3組將不同支架植入骨軟骨缺損中。所有山羊的右后肢作為空白對(duì)照。術(shù)后用生理鹽水徹底沖洗，依次縫合關(guān)節(jié)囊、皮下軟組織以及皮膚。每只動(dòng)物術(shù)后常規(guī)注射青霉素160萬(wàn)U，肌內(nèi)注射，1次/d，治療1周。麻醉恢復(fù)后讓其自由活動(dòng)，后肢不做特殊處理。

1.7 大體觀察及評(píng)分

觀察動(dòng)物整體活動(dòng)情況，對(duì)比觀察左右髖關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍。評(píng)價(jià)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨頭部位骨軟骨缺損的修復(fù)效果。并于術(shù)后第16 周將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死、取材，觀察關(guān)節(jié)有無(wú)腫脹、破潰，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有無(wú)感染或積液。從缺損邊緣修復(fù)情況、軟骨表面平整度、缺損填充、新生軟骨的顏色和透明度等方面分析，并記錄國(guó)際軟骨修復(fù)學(xué)會(huì)評(píng)分（International Cartilage Re?pair Society score,ICRS）[11]。

1.8 病理觀察及定量分析

術(shù)后16 周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，股骨頭標(biāo)本經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定48 h，乙醇梯度脫水，常規(guī)浸潤(rùn)、包埋，再經(jīng)德國(guó)EXAKT 切片機(jī)切片。磨至厚度約20 μm，拋光后行VG染色，觀察多孔鉭金屬周?chē)鹿窃偕约澳z原膜處軟骨形成情況，并于光鏡下觀察。采用改良O'Driscoll 評(píng)分評(píng)價(jià)軟骨修復(fù)情況[12]。應(yīng)用常規(guī)Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算新生成骨面積。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均符合正態(tài)分布，以表示。多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙相支架掃描電鏡觀察及能譜分析結(jié)果

本課題組制備的多孔鉭金屬孔徑為200～500 μm，開(kāi)孔率為75%～85%。掃描電鏡下可見(jiàn)多孔鉭金屬為相互交通的多孔狀三維立體結(jié)構(gòu)（圖2A）。能譜分析結(jié)果顯示，多孔鉭金屬中碳、硅及鉭分別占12.3%、9.5%和78.2%。采用市場(chǎng)化的纖維蛋白黏合劑將膠原膜及自主研發(fā)的多孔鉭金屬進(jìn)行界面結(jié)合，掃描電鏡下顯示結(jié)合面均勻、平滑，黏合牢固（圖2B）；膠原膜內(nèi)可見(jiàn)絲狀膠原分布均勻，結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)（圖2C）。能譜分析結(jié)果顯示，膠原膜由碳、氧和鈣3種元素組成，分別占65.8%、32.7%及1.5%。

2.2 雙相支架材料的力學(xué)性能

為了模擬體內(nèi)的壓力，本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)試了材料與界面之間的抗壓和抗拉能力。膠原膜的平均抗拉強(qiáng)度和抗壓強(qiáng)度分別為3.64 MPa和3.40 MPa。本課題組制備的多孔鉭金屬的平均抗壓強(qiáng)度為43.0 MPa。采用市場(chǎng)化的纖維蛋白黏合劑進(jìn)行界面結(jié)合，測(cè)試結(jié)果顯示界面結(jié)合強(qiáng)度約為0.23 MPa，界面剪切強(qiáng)度約為0.18 MPa。

隨著水利工程實(shí)施主體向基層一線轉(zhuǎn)移，縣（區(qū)）質(zhì)量監(jiān)督工作面臨不少困難和問(wèn)題，特別是在近年的工程質(zhì)量監(jiān)督管理中，發(fā)現(xiàn)的一些問(wèn)題在一定程度上影響工程的質(zhì)量、進(jìn)度和安全，不容忽視，必須予以解決。

2.3 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后大體表現(xiàn)及ICRS評(píng)分比較

單純采用膠原膜修復(fù)骨軟骨缺損時(shí)，由于膠原膜本身機(jī)械強(qiáng)度低，所以植入16 周后取材時(shí)可見(jiàn)材料下陷。材料與周?chē)浌墙M織的整合性差，軟骨發(fā)生明顯退變（圖3A）。單純國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬修復(fù)骨軟骨缺損時(shí)，材料與周?chē)墙M織的整合性好，但是對(duì)于軟骨組織的修復(fù)幾乎沒(méi)有（圖3B）。膠原膜/國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬雙相支架植入16周后取材時(shí)可見(jiàn)手術(shù)部位無(wú)感染、水腫或積液，缺損部位的關(guān)節(jié)面近乎平整，修復(fù)組織與周?chē)浌墙M織結(jié)合緊密，未見(jiàn)退化磨損跡象（圖3C）。單純骨軟骨缺損組幾乎未見(jiàn)自身修復(fù)，同時(shí)軟骨發(fā)生明顯退變（圖3D）。正常關(guān)節(jié)軟骨呈淺藍(lán)白色，半透明，光滑而有光澤（圖3E）。

單純膠原膜組、單純國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬組以及雙相支架組的ICRS 評(píng)分均高于單純骨軟骨缺損組，雙相支架組的ICRS 評(píng)分均高于單純膠原膜組、單純國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而單純膠原膜組與單純國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬組ICRS評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.4 各組術(shù)后病理表現(xiàn)及定量分析結(jié)果比較

膠原膜植入關(guān)節(jié)骨軟骨缺損區(qū)域后形成新生組織。在軟骨缺損位點(diǎn)的邊緣處可見(jiàn)新生的軟骨細(xì)胞，缺損區(qū)可見(jiàn)大量拱狀排列的纖維組織（圖4A）。在單純植入國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬16 周后，多孔鉭的孔隙幾乎全部被新生的類(lèi)骨質(zhì)所填充（圖4B）。雙相支架組的標(biāo)本切片可見(jiàn)新生類(lèi)軟骨樣組織，以扁平細(xì)胞為主，纖維結(jié)構(gòu)疏松，呈層狀排列；而多孔鉭的孔隙幾乎全部被新生的類(lèi)骨質(zhì)所填充，類(lèi)軟骨樣組織與多孔鉭之間無(wú)明顯的界限（圖4C）。單純骨軟骨缺損組造模后16周水平切片顯示膜內(nèi)骨化過(guò)程以及在骨缺損位點(diǎn)的邊緣處有少量的新生骨細(xì)胞，但缺損區(qū)的主要是被大量的纖維結(jié)締組織所填充；軟骨缺損區(qū)凹陷，為薄層纖維組織覆蓋，與修復(fù)組織連接處的關(guān)節(jié)軟骨可見(jiàn)縱行裂隙（圖4D）。正常關(guān)節(jié)軟骨呈白色，半透明，光滑且有光澤（圖4E）。

圖2 掃描電鏡下膠原膜/國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬雙相支架的特征

圖3 不同植入物植入骨軟骨缺損實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16周后股骨頭的大體表現(xiàn)

表1 各組術(shù)后大體評(píng)分及組織學(xué)評(píng)分比較（n=8，）

表1 各組術(shù)后大體評(píng)分及組織學(xué)評(píng)分比較（n=8，）

注：△與單純骨軟骨缺損組比較，P＜0.05；▲與雙相支架組比較，P＜0.05；○與單純膠原膜組、單純骨缺損組比較，P＜0.05

單純膠原膜組、單純國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬組以及雙相支架組的改良O'Driscoll評(píng)分均高于單純骨軟骨缺損組，雙相支架組的改良O'Driscoll評(píng)分均高于單純膠原膜組、單純國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而單純膠原膜組與單純國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬組改良O'Driscoll評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單純國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬組、雙相支架組的新生骨組織均多于單純膠原膜組及單純骨軟骨缺損組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而單純膠原膜組與單純骨軟骨缺損組、單純國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬組與雙相支架組的新生骨組織差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

圖4 不同植入物植入骨軟骨缺損實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16周后股骨頭病理表現(xiàn)（VG染色）

3 討論

臨床上針對(duì)骨軟骨聯(lián)合病變往往只能單純修復(fù)缺損骨。對(duì)于軟骨缺損幾乎沒(méi)有修復(fù)，尤其在骨軟骨缺損較深時(shí)。較大的骨軟骨缺損修復(fù)存在更大的挑戰(zhàn)，目前尚無(wú)“金標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù)存在。軟骨缺損的臨床治療效果均不盡如人意。目前組織工程領(lǐng)域出現(xiàn)了很多材料。由于膠原、硫酸軟骨素及糖胺聚糖都是軟骨的天然組成成分，所以這些材料一直是研究的熱點(diǎn)[13]。Getgood等[14]使用了新的膠原蛋白-糖胺聚糖-鈣磷酸雙相支架可早期修復(fù)外科手術(shù)在山羊中造成的骨軟骨缺損模型。他們發(fā)現(xiàn)生物材料的成分膠原蛋白-糖胺聚糖可以提供更有利于軟骨修復(fù)的環(huán)境。Sanjurjo-Rodríguez等[15]在Ⅰ型膠原/Ⅱ型膠原/肝素支架上培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外模型中，發(fā)現(xiàn)其修復(fù)人類(lèi)軟骨病變總體評(píng)估較其他支架更高。商品化的膠原膜主要應(yīng)用于骨質(zhì)增高之后及支持軟骨組織形成，比如牙槽重建或者腭裂修補(bǔ)術(shù)等[16,17]。但是關(guān)于將這種膠原膜用在大型動(dòng)物體內(nèi)修復(fù)大面積軟骨缺損的報(bào)道幾乎沒(méi)有。本組體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膠原膜可以促進(jìn)山羊軟骨新生，或許未來(lái)可以應(yīng)用在大面積軟骨缺損后修復(fù)的臨床領(lǐng)域。

眾所周知，理想的人工骨材料應(yīng)與松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)相似，具有良好的生物相容性和多孔相通性，為支持血管和神經(jīng)的生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送提供空間，誘導(dǎo)骨長(zhǎng)入[18-20]。多孔支架的孔隙率和孔徑大小是決定植入成功與否的重要因素[21]。研究發(fā)現(xiàn)，孔徑為50～400 μm 的多孔材料最有利于人體的新骨生長(zhǎng)[22]。本研究制備的多孔鉭金屬孔徑為200～500 μm，開(kāi)孔率為75%～85%，孔徑大小與松質(zhì)骨十分接近。擁有足夠的機(jī)械強(qiáng)度的同時(shí)，彈性模量介于皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨的彈性模量之間，這使材料植入后的應(yīng)力阻擋作用幾乎可以忽略，從而有利于骨骼重塑形。Stiehler 等[23]發(fā)現(xiàn)人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在鉭片上有很好的骨誘導(dǎo)特性。另外有研究發(fā)現(xiàn)實(shí)心鉭對(duì)人類(lèi)成骨細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)及功能分化有利[24]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，本組制備的多孔鉭金屬孔隙率高達(dá)80%以上，孔徑大小與松質(zhì)骨十分接近。本組制作的以多孔碳為支架的多孔鉭植入物和宿主機(jī)體之間產(chǎn)生一個(gè)穩(wěn)定而理想的連接與整合[25-27]。體內(nèi)命運(yùn)是最終形成骨軟骨重要的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。Mrosek等[28]發(fā)現(xiàn)多孔鉭金屬?gòu)?fù)合骨膜可以促進(jìn)骨小梁滲入軟骨下骨。本組體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，植入16周后，雙相支架成功修復(fù)了幾乎半個(gè)股骨頭的骨軟骨缺損。證實(shí)這種雙相支架對(duì)于修復(fù)山羊負(fù)重區(qū)大面積骨軟骨缺損較為有效。

骨軟骨聯(lián)合缺損包含關(guān)節(jié)軟骨損傷以及軟骨下骨的損傷。為了修復(fù)骨軟骨缺損，軟骨、骨以及兩者之間的界面必須均被考慮到[29]。如何將兩相支架進(jìn)行固定成為生物材料修復(fù)骨軟骨缺損關(guān)鍵性的挑戰(zhàn)。臨床結(jié)果證明縫合和膠合固定兩種方法比較有效。使用可吸收縫合線進(jìn)行縫合被證明是可行的，但是在負(fù)重區(qū)該方法效果不好[30]。組織膠，如纖維蛋白封閉劑和氰基丙烯酸酯膠，已被證明在支架固定中有效。因此，這種方法被推薦用于多相支架在大缺陷中的固定。本實(shí)驗(yàn)采用商品化的纖維蛋白黏合劑將膠原膜及自主研發(fā)的多孔鉭金屬進(jìn)行界面結(jié)合，結(jié)果顯示結(jié)合面均勻、平滑，黏合牢固，具有較好的界面結(jié)合強(qiáng)度和剪切強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)證明，纖維蛋白黏合劑可以用于負(fù)重區(qū)大面積缺損時(shí)的骨與軟骨界面的結(jié)合。

機(jī)械性人工關(guān)節(jié)的應(yīng)用現(xiàn)狀需要改進(jìn)。在實(shí)驗(yàn)室形成仿生關(guān)節(jié)一直是骨組織工程的前沿性發(fā)展方向。本研究對(duì)于在負(fù)重區(qū)的大面積骨軟骨缺損的成功修復(fù)顯示了臨床轉(zhuǎn)化的潛能，為大面積骨軟骨聯(lián)合病變的臨床治療提供新的組織工程策略。未來(lái)應(yīng)評(píng)估膠原膜/國(guó)產(chǎn)多孔鉭金屬雙相支架在大動(dòng)物負(fù)重區(qū)生理功能及機(jī)械性能更長(zhǎng)時(shí)間隨訪結(jié)果。