華北地區(qū)水產(chǎn)用光合細(xì)菌液體制劑的優(yōu)勢(shì)菌屬分析

文/張洪玉 王海波 夏磊 焦麗亭 趙明軍

為了解目前水產(chǎn)用光合細(xì)菌液體制劑優(yōu)勢(shì)菌屬的實(shí)際情況，從華北地區(qū)養(yǎng)殖戶和水產(chǎn)動(dòng)保產(chǎn)品銷售商處采集了12種典型菌劑，運(yùn)用16S高通量測(cè)序分析菌群組成，去除非光合細(xì)菌數(shù)據(jù)，進(jìn)而統(tǒng)計(jì)光合細(xì)菌的百分構(gòu)成比。結(jié)果顯示，水產(chǎn)用光合細(xì)菌液體制劑中最常見的菌屬是紫硫細(xì)菌的外硫紅螺菌，而不是紫非硫細(xì)菌的紅假單胞菌。生產(chǎn)廠家、管理機(jī)構(gòu)和研究人員應(yīng)根據(jù)光合細(xì)菌制劑菌種的實(shí)際情況開展相應(yīng)的工作。

光合細(xì)菌是一類能進(jìn)行不產(chǎn)氧光合作用的微生物的總稱，其較新的分類和命名參見《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第二版。光合細(xì)菌制劑是水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的益生菌制劑之一，通常使用的菌種是紫非硫細(xì)菌（purple nonsulfur bacteria，PNSB）中的沼澤紅假單胞菌（rhodopseudomonas palustris）。原農(nóng)業(yè)部公布的《飼料添加劑品種目錄（2013）》中，光合細(xì)菌菌種僅有沼澤紅假單胞菌?，F(xiàn)行有效的兩個(gè)光合細(xì)菌菌劑標(biāo)準(zhǔn)NY 527-2002和SN/T 3542-2013也只適用于沼澤紅假單胞菌或以其為代表的PNSB。對(duì)于光合細(xì)菌固定化技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)和在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用的研究也主要集中在以沼澤紅假單胞菌為代表的PNSB上。

但是，我們?cè)诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，實(shí)際銷售和使用的光合細(xì)菌產(chǎn)品最常檢出的菌種并非紅假單胞菌。為明確水產(chǎn)用光合細(xì)菌液體制劑中的菌種情況，我們開展了對(duì)光合細(xì)菌產(chǎn)品菌種的檢測(cè)和分析工作，以期為光合細(xì)菌制劑的生產(chǎn)、管理和研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

從華北地區(qū)養(yǎng)殖戶和水產(chǎn)動(dòng)保產(chǎn)品銷售商處采集典型的光合細(xì)菌產(chǎn)品12個(gè)，編號(hào)P1～P12。其中，僅3個(gè)產(chǎn)品（P3，P5和P12）標(biāo)識(shí)了菌種名稱，為沼澤紅假單胞菌。12個(gè)菌劑來自12個(gè)不同廠家，廠家地址分布情況為：北京市3個(gè)（P1，P9和P10），河南省3個(gè)（P4，P6和P7），江蘇省2個(gè)（P3和P5），廣東省2個(gè)（P8和P11），山東省1個(gè)（P2），湖南省1個(gè)（P12）。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.高通量測(cè)序分析菌群結(jié)構(gòu)

產(chǎn)品搖勻開封后，取1mL菌液，離心收集菌體，干冰運(yùn)輸，由生工生物工程（上海）股份有限公司提取DNA并進(jìn)行16S V3～V4區(qū)擴(kuò)增和高通量測(cè)序，所用引物為通用引物341F和805R。

2.產(chǎn)品中不同光合細(xì)菌構(gòu)成比分析

以高通量測(cè)序結(jié)果為原始資料。選取每個(gè)菌劑豐度前11的菌屬，查閱《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第二版和相關(guān)文獻(xiàn)，12個(gè)菌劑中共有9個(gè)屬的光合細(xì)菌，分別是：紅假單胞菌（rhodopseudomonas），外硫紅螺菌（ectothiorhodospira），rhodobacter，thioflavicoccus，rhodovulum，rubribacterium，ectothiorhodosinus，allochromatium和thiorhodococcus。在原始分類學(xué)報(bào)告中檢索每個(gè)產(chǎn)品這9個(gè)屬光合細(xì)菌占總菌數(shù)的比例，以總光合細(xì)菌數(shù)量為100%，重新計(jì)算光合細(xì)菌菌屬的百分構(gòu)成比。

二、結(jié)果

以12個(gè)菌劑的高通量測(cè)序結(jié)果為原始資料，排除非光合細(xì)菌的數(shù)據(jù)，計(jì)算每個(gè)菌劑中光合細(xì)菌的百分構(gòu)成比（表1）。結(jié)果顯示，菌劑中優(yōu)勢(shì)菌屬為紅假單胞菌的僅占25%，為外硫紅螺菌的占58.3%，為rhodobacter和thiorhodococcus的各占8.3%。分析12個(gè)菌劑中含量在1%以上的菌屬，紅假單胞菌和外硫紅螺菌分別在33.3%和83.8%的菌劑中含量超過1%?？梢姡鷦┲凶畛Ｒ姷木鷮偈亲狭蚣?xì)菌（purple sulfur bacteria，PSB）的外硫紅螺菌，而不是PNSB的紅假單胞菌。

表1 菌劑中光合細(xì)菌菌屬的百分構(gòu)成比

三、討論

（一）水產(chǎn)用液體光合細(xì)菌制劑的抽樣

從華北地區(qū)養(yǎng)殖戶和銷售商處采集典型的光合細(xì)菌產(chǎn)品12個(gè)，覆蓋了河北、天津、北京主要養(yǎng)殖區(qū)，包括海水養(yǎng)殖及淡水池塘養(yǎng)殖。雖然我們盡量選擇了有代表性的菌劑產(chǎn)品進(jìn)行了抽樣檢測(cè)，但仍有必要進(jìn)一步增加樣本數(shù)量、擴(kuò)大采樣區(qū)域以減小得出錯(cuò)誤結(jié)論的可能性。

（二）16S擴(kuò)增子高通量測(cè)序研究菌劑菌群結(jié)構(gòu)

盡管光合細(xì)菌的生產(chǎn)工藝較為簡(jiǎn)單，但相較芽孢菌和乳酸菌，光合細(xì)菌的純培養(yǎng)和活菌計(jì)數(shù)技術(shù)還是較為困難，特別是在活菌數(shù)不高的情況?，F(xiàn)行有效的兩個(gè)光合細(xì)菌菌劑標(biāo)準(zhǔn)NY 527-2002和SN/T 3542-2013采用的是基于培養(yǎng)的計(jì)數(shù)方法，且只適用于沼澤紅假單胞菌或以其為代表的PNSB。較之傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，基于PCR的高通量測(cè)序更適合研究菌劑的菌群結(jié)構(gòu)。使用通用引物可以有效地檢出絕大部分種類的原核生物，避免了培養(yǎng)法的選擇性帶來的檢測(cè)不出的可能。且基于PCR的方法不區(qū)分死菌和活菌，即使活菌數(shù)較低，只要死菌的DNA沒有嚴(yán)重降解，就可以被檢出，能夠更好地反應(yīng)出菌劑中真正的優(yōu)勢(shì)菌群。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的普及，測(cè)序速度不斷增加、成本則不斷下降，且該方法無需繁瑣的培養(yǎng)操作，大大節(jié)約了實(shí)驗(yàn)人員的時(shí)間。

（三）光合細(xì)菌制劑的優(yōu)勢(shì)菌屬

《飼料添加劑品種目錄（2013）》的光合細(xì)菌僅沼澤紅假單胞菌一種，光合細(xì)菌菌劑標(biāo)準(zhǔn)NY 527-2002和SN/T 3542-2013也僅適用于沼澤紅假單胞菌或以其為代表的PNSB。對(duì)于光合細(xì)菌固定化技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)和在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用的研究也主要集中在以沼澤紅假單胞菌為代表的PNSB上。而我們的研究結(jié)果顯示，目前華北地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖使用的液體光合細(xì)菌菌劑的優(yōu)勢(shì)菌屬是PSB的外硫紅螺菌。PSB和PNSB是兩群差異較大、進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的光合細(xì)菌群，分別位于γ變形菌綱和α、β變形菌綱。兩群細(xì)菌在硫化物耐受程度、有機(jī)物利用能力、氧氣耐受及利用能力、嗜鹽性等方面存在較大差異。隸屬于PSB的外硫紅螺菌的多數(shù)種進(jìn)行厭氧光能自養(yǎng)或利用有限的幾種有機(jī)物進(jìn)行光能異養(yǎng)、嗜鹽、嗜堿、不需要生長(zhǎng)因子，而屬于PNSB的紅假單胞菌則傾向于厭氧光能異養(yǎng)或微需氧到有氧化能異養(yǎng)、喜接近中性的淡水、部分種屬需要生長(zhǎng)因子。鑒于二者在系統(tǒng)發(fā)育和生理上存在較大區(qū)別，而目前光合細(xì)菌制劑的優(yōu)勢(shì)菌屬已不再是紅假單胞菌，而是外硫紅螺菌，研究人員應(yīng)該更多的關(guān)注該菌屬的培養(yǎng)、檢測(cè)手段和功能研究，以適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)的需要。同時(shí)，生產(chǎn)廠家應(yīng)注重產(chǎn)品菌種的鑒定、嚴(yán)把產(chǎn)品質(zhì)量關(guān)。此外，管理部門則應(yīng)結(jié)合實(shí)際規(guī)范光合細(xì)菌制劑的菌種、出臺(tái)配套的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以適應(yīng)不斷變化的微生物制劑市場(chǎng)。

綜上所述，目前華北地區(qū)水產(chǎn)用光合細(xì)菌液體制劑中最常見的菌屬是PSB的外硫紅螺菌，而不是PNSB的紅假單胞菌。生產(chǎn)廠家、管理機(jī)構(gòu)和研究人員應(yīng)根據(jù)光合細(xì)菌制劑菌種的實(shí)際情況開展相應(yīng)的工作。