竹葉花椒的石蠟切片方法研究

陳舒憶 唐藝 莫我躍 趙應(yīng)梅 陸雅麗

摘 要

目的：用石蠟切片法對(duì)竹葉花椒的顯微組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為竹葉花椒的生藥學(xué)鑒定和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。方法：以石蠟為包埋劑，通過(guò)浸泡、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、貼片等，制備竹葉花椒的石蠟切片，并進(jìn)行顯微觀察。結(jié)果：竹葉花椒顯微組織結(jié)構(gòu)明顯，具有色素塊、油室、草酸鈣簇晶、薄壁細(xì)胞等顯微特征。結(jié)論：該方法可得到染色清晰、組織結(jié)構(gòu)完整的竹葉花椒的石蠟切片，可作為竹葉花椒生藥學(xué)鑒定和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的重要方法。

關(guān)鍵詞

竹葉花椒;石蠟切片;生藥學(xué)鑒定;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

中圖分類(lèi)號(hào)： TS264.3;O657.72 ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.16.080

竹葉花椒（Pericarpium Zanthoxyli Armati）是蕓香科植物花椒屬（Rutaceae zanthox ylum）竹葉花椒（Zanthoxylum armatum DC.）的干燥成熟果皮[1]，又名竹葉椒、狗椒、崖椒等。自古就是西南地區(qū)常用的中藥材和香料，有麻刺感和辛辣味，具有溫中理氣，祛風(fēng)除濕，活血止痛等功效[2，3]。現(xiàn)有的栽培品種如“九葉青”、“頂壇花椒”等，均為竹葉花椒。研究表明，竹葉花椒的抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化、殺蟲(chóng)、抑菌等現(xiàn)代藥理作用與其含有的揮發(fā)性、生物堿、木脂素以及黃酮類(lèi)成分有關(guān)[4，5]。

竹葉花椒干燥果皮直徑為4～5mm，較難進(jìn)行徒手切片，而石蠟切片能夠清晰完整的研究其組織結(jié)構(gòu)，并能長(zhǎng)期保存。通過(guò)對(duì)竹葉花椒橫切面的顯微特征研究，為其生藥學(xué)鑒定和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和儀器

1）材料：新鮮竹葉花椒，采集于貴州貞豐、貴州遵義、貴州凱里等地。

2）儀器設(shè)備：Leica DM2500光學(xué)生物顯微鏡;Leica RM2245半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī);天津泰斯特202-3AB電熱恒溫干燥箱。

3）試劑試藥：切片石蠟（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，熔點(diǎn)51℃～55℃），無(wú)水乙醇、95%乙醇、冰醋酸、甲醛、二甲苯、番紅、固綠等均為分析純。

2 方法

2.1 取樣與固定

挑選形態(tài)完好的新鮮竹葉花椒，將其椒目與果皮剝離，將果皮一切為二，浸入70% FAA固定液（70%的乙醇90ml，冰醋酸5ml，37%甲醛5ml）中固定至少24小時(shí)。

2.2 脫水與透明

經(jīng)固定后的竹葉花椒依次在不同濃度的乙醇中逐級(jí)脫水，乙醇濃度按順序依次為70%、80%、90%、95%、100%，各級(jí)停留1小時(shí)，最后的無(wú)水乙醇應(yīng)至少更換兩次以便于去除水分。脫水后先用無(wú)水乙醇-二甲苯（1：1）浸泡1小時(shí);再用二甲苯浸泡1小時(shí)，反復(fù)2次以除盡乙醇。

2.3 滲蠟與包埋

用石蠟逐步替換透明劑，滲透到果皮組織中。倒出部分浸泡竹葉花椒的二甲苯，加入少許石蠟，置于65℃恒溫箱中，待石蠟熔化后浸蠟。每隔30分鐘倒出原有石蠟，加入新石蠟，反復(fù)3次，置換成純石蠟后在恒溫箱中放置6小時(shí)，使石蠟充分浸入樣品中。將竹葉花椒樣品放入切片模具中，倒入已熔化的石蠟，迅速冷卻凝固。

2.4 切片與貼片

將模具固定在切片機(jī)上，調(diào)整切片厚度進(jìn)行切片，切下的薄片連成蠟帶。在載玻片上滴加蒸餾水，將切好的蠟片在載玻片上展開(kāi)，利用水的張力可使蠟片伸展平直，待完全展平后，可將切片位置撥正，待水分烘干后蠟片會(huì)粘貼于載玻片上，再置50℃烘箱中烘干。

2.5 脫蠟、染色與封片

將載玻片放入二甲苯中至石蠟完全溶解，而后用番紅-固綠二重染色法進(jìn)行染色，依次放入二甲苯→二甲苯→50%二甲苯（二甲苯：乙醇=1：1）→無(wú)水乙醇→90%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→60%乙醇→番紅染色→60%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→固綠染色→90%乙醇→無(wú)水乙醇→無(wú)水乙醇→50%二甲苯→二甲苯→二甲苯→封片，每級(jí)二甲苯和乙醇的停留時(shí)間為3分鐘，番紅中停留1小時(shí)，固綠中染色2分鐘[6，7]。染色后的載玻片滴加中性樹(shù)脂封藏劑，放上蓋玻片，烘干后即得永久切片。

3 結(jié)果

顯微組織結(jié)構(gòu)特征[8]：竹葉花椒果皮切面為具疣狀突起的圓環(huán)形。外果皮為1列扁平細(xì)胞，外披角質(zhì)層，其下有1～3列下皮細(xì)胞，內(nèi)含色素塊;中果皮多為薄壁細(xì)胞，可見(jiàn)油室及草酸簇晶，并有少量的方晶及圓形淀粉粒，維管束散在，油室圓形或橢圓形（直徑0.5～1mm）;內(nèi)果皮為切向延長(zhǎng)的薄壁細(xì)胞。如圖1所示。

4 討論

石蠟切片法是植物組織鑒定的常用方法，其優(yōu)點(diǎn)可應(yīng)用于大部分藥材，能把樣品切成均勻、連續(xù)的薄片，觀察植物組織較為完整清晰，并能永久保存，缺點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜煩瑣，制作切片的周期較長(zhǎng)，不能用于快速鑒別。在竹葉花椒的石蠟切片制作過(guò)程中，由于果皮硬度較大，溶液不易滲入，新鮮的竹葉花椒能制作出效果更為良好的石蠟切片。在染色劑的染色時(shí)間上，番紅不易染色，至少需要停留1小時(shí)，如有需要可放置更長(zhǎng)時(shí)間，而固綠染色較快，最好不要超過(guò)3分鐘，否則，切片染色效果不佳。本文對(duì)竹葉花椒石蠟切片的研究較為深入，通過(guò)一系列操作，可得到組織完整，細(xì)胞界限清楚的植物組織，為竹葉花椒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]湖南省食品藥品監(jiān)督管理局.湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2009年版）[M].湖南：湖南科技出版社，2010.

[2]陳茜.竹葉花椒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2019.

[3]程友斌，王慶林，楊茹.竹葉椒的研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥，2011，15（1）：11-13.

[4]唐小鳳.竹葉椒的化學(xué)成分研究[D].蘭州：蘭州理工大學(xué)，2016.

[5]樊丹青，劉友平，陳鴻平.花椒本草考證[J].中藥與臨床，2013，4（6）：59-61.

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[7]曹蔚，薛美玲，謝艷華，等.椒目種皮的石蠟切片制備方法及顯微鑒別研究[J].陜西中醫(yī)，2012，33（3）：352-354.

[8]熊泉波，施大文.花椒及其同類(lèi)品的形態(tài)組織學(xué)研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1991，26（12）： 938-947.