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    辛伐他汀抑制高糖損傷乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-p38 絲裂原活化蛋白激酶通路抑制心肌細(xì)胞凋亡

    2020-07-30 02:26:18孫強(qiáng)尉希清張洪生胡玲愛(ài)宋秉春張延春張金國(guó)
    中國(guó)循環(huán)雜志 2020年7期
    關(guān)鍵詞:乳鼠氧化酶辛伐他汀

    孫強(qiáng),尉希清,張洪生,胡玲愛(ài),宋秉春,張延春,張金國(guó)

    絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信號(hào)從細(xì)胞膜向細(xì)胞核傳遞的重要中介,在維持細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及凋亡等一系列行為和功能中發(fā)揮重要作用。近來(lái)研究[1-2]表明,高糖刺激能使氧化應(yīng)激增強(qiáng),生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子表達(dá)增加,而這些變化可激活MAPK 家族,使其轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng),參與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生。已有研究[3]表明,辛伐他汀對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化具有保護(hù)作用,但其具體作用機(jī)制、對(duì)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶-p38MAPK 通路的影響,目前尚少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立高糖誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷模型,觀察辛伐他汀對(duì)高糖損傷乳鼠心肌細(xì)胞NADPH 氧化酶-p38MAPK 信號(hào)通路及心肌細(xì)胞凋亡的影響,探討辛伐他汀對(duì)高糖損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:新生1~3d 齡SD 大鼠,由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)大鼠的使用嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)倫理?xiàng)l例。

    藥品及主要試劑:胎牛血清、改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM 培養(yǎng)基)(Gibco 公司,美國(guó));辛伐他?。╯imvastatin)原粉(默沙東公司,美國(guó));牛胰蛋白酶、二甲基亞楓(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒(Sigma 公司,美國(guó));D-葡萄糖(巴斯夫化工有限公司,天津);免疫沉淀(IP)裂解液、BCA法蛋白定量試劑盒和半胱天冬氨酸蛋白激酶-3(Caspase-3)試劑盒(西唐生物科技有限公司,上海);乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(建成生物工程研究所,南京);PCR 引物(上海生工生物工程有限公司,上海);RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR 試劑盒(Fermentas公司,美國(guó));Western blot 試劑盒(KPL 公司,美國(guó));抗鼠3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因內(nèi)參(Millipore 公司,美國(guó));抗兔多克隆p38MAPK 抗體;末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(Cell Signaling 公司,美國(guó));細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL)試劑盒和抗鼠α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)單克隆抗體(博士德,武漢)。

    實(shí)驗(yàn)分組:待培養(yǎng)72 h 心肌細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定,搏動(dòng)良好后按隨機(jī)化原則分組并加入相應(yīng)的干預(yù)藥物,將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為五組:(1)用含有20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h,不加任何刺激藥物,為對(duì)照組;(2)含有20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中加入終濃度為25 mmol/L 的葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)72 h,為高濃度葡萄糖刺激組(高糖組);(3)三組不同濃度的辛伐他汀干預(yù)組即含有20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中加入終濃度為25 mmol/L 的葡萄糖及終濃度分別為10-7、10-6、10-5mol/L(M)的辛伐他汀繼續(xù)培養(yǎng)72 h,分別為高糖+10-7M 辛伐他汀組、高糖+10-6M 辛伐他汀組、高糖+10-5M 辛伐他汀組。以上各組心肌細(xì)胞每個(gè)檢測(cè)指標(biāo)均設(shè)置六個(gè)復(fù)孔。

    MTT 比色法測(cè)定心肌細(xì)胞活力:參照劉會(huì)等[4]的方法,用MTT 比色法測(cè)定心肌細(xì)胞活力,各組細(xì)胞活力=(各濃度組OD值/對(duì)照組OD值)×100%與之比較。

    培養(yǎng)液內(nèi)LDH 活力及SOD 活力測(cè)定:嚴(yán)格按試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH 活力和SOD 活力。

    逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)NADPH 氧化酶亞基p22phox、p47phoxmRNA 表達(dá):引物序列如下:p22phox 引物序列:正向引物:5'-CTCTATTGTTGCAGGAGTGC-3',反向引物:5'-TCACACGACCTCATCTGTCAG-3',基因片段長(zhǎng)度457bp;p47phox 引物序列:正向引物:5'-GCTCACCGAGTACTTCAACA-3',反向引物:5'-GCCTTCTGCAGATACATG GA-3',基因片段長(zhǎng)度570bp;β-actin 引物序列:正向引物:5'-CACGATGGAGGGG CCGGACTCATC-3',反向引物:5'-TAAAGACCTC TATGCCAACACAGT-3',基因片段長(zhǎng)度241bp。

    Western Blot 檢測(cè)各組心肌細(xì)胞p38MAPK 蛋白表達(dá):用BCA 法[5]進(jìn)行蛋白定量,應(yīng)用1D 凝膠定量軟件(BIO-RAD Quantity One) 4.6.2 軟件對(duì)Western 條帶進(jìn)行半定量分析,以目的條帶光密度/GAPDH 光密度作為表達(dá)強(qiáng)度的定量指標(biāo),計(jì)算各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

    乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中Caspase-3 濃度測(cè)定:Caspase-3 的活化是細(xì)胞凋亡的最終共同途徑,可以反映凋亡發(fā)生的程度。采用ABC-Elisa 法測(cè)定培養(yǎng)液中Caspase-3 濃度,嚴(yán)格按Caspase-3 的試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作,用芬蘭Thermo 公司Mμltiskan MK3酶標(biāo)儀測(cè)定,單位μmol/L。

    TUNEL 免疫熒光染色檢測(cè)各組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡情況:按試劑盒說(shuō)明書(shū)通過(guò)免疫熒光染色測(cè)各組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù),細(xì)胞核被4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染成藍(lán)色,凋亡細(xì)胞被染成綠色。

    2 結(jié)果

    心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:培養(yǎng)72 h 后,臺(tái)盼藍(lán)染色隨機(jī)取3 個(gè)視野觀察,細(xì)胞存活率分別為98.4 %、97.6% 和97.2%。用α-actin 抗體檢測(cè)證明心肌細(xì)胞純度較高(圖1)。對(duì)照組心肌細(xì)胞成簇生長(zhǎng),呈梭形、星形或不規(guī)則三角形,細(xì)胞伸出偽足,核呈卵圓形并居中,搏動(dòng)規(guī)律有力,細(xì)胞搏動(dòng)頻率為60~120 次/min;高糖組心肌細(xì)胞皺縮變圓,偽足減少,細(xì)胞搏動(dòng)頻率增快;三組不同濃度的辛伐他汀干預(yù)組心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)較好,細(xì)胞形態(tài)明顯好于高糖組,且貼壁細(xì)胞多于高糖組;高糖+10-5M 辛伐他汀組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞存活率要好于高糖+10-7M 辛伐他汀組,細(xì)胞的搏動(dòng)頻率明顯慢于高糖組,搏動(dòng)有力。隨著辛伐他汀濃度的增加,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)愈好,搏動(dòng)頻率愈慢。培養(yǎng)的各組心肌細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖2。

    辛伐他汀對(duì)高糖刺激的心肌細(xì)胞活力、LDH 活力及SOD 活力的影響(表1):與對(duì)照組比較,高糖組、高糖+10-7M 辛伐他汀組、高糖+10-6M 辛伐他汀組心肌細(xì)胞活力及SOD 活力明顯降低,LDH 活力明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01);高糖+10-5M 辛伐他汀組心肌細(xì)胞活力、SOD 活力及LDH活力與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組比較,三組不同濃度的辛伐他汀干預(yù)組心肌細(xì)胞活力及SOD 活力明顯升高,LDH 活力明顯降低(P<0.05),且呈濃度依賴性(P<0.05)。

    圖1 大鼠原代心肌細(xì)胞α-actin 免疫熒光鑒定(×20)

    圖2 培養(yǎng)的各組乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)圖(×40)

    表1 各組乳鼠心肌細(xì)胞活力、LDH 活力及SOD 活力的比較 (,n=6)

    表1 各組乳鼠心肌細(xì)胞活力、LDH 活力及SOD 活力的比較 (,n=6)

    注:心肌細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值 ×100%(吸光度通過(guò)MTT 法測(cè)得) 。M 表示mol/L,LDH:乳酸脫氫酶,SOD:超氧化物歧化酶。與對(duì)照組比較*P<0.01;與高糖組比較△P<0.05;與高糖+10-7M 辛伐他汀組比較▲P<0.05;與高糖+10-6M 辛伐他汀組比較#P<0.05

    辛伐他汀對(duì)高糖刺激乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響:通過(guò)TUNEL 染色檢測(cè)辛伐他汀對(duì)高糖刺激乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響,與對(duì)照組相比,高糖組TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞(綠色熒光)顯著增多,辛伐他汀干預(yù)后TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞(綠色熒光)顯著減少,且呈劑量依賴性(圖3)。

    辛伐他汀對(duì)高糖刺激時(shí)心肌細(xì)胞p38MAPK 蛋白表達(dá)的影響(圖4):與對(duì)照組比較,高糖組、高糖+10-7M 辛伐他汀組、高糖+10-6M 辛伐他汀組p38MAPK 蛋白表達(dá)顯著升高(P均<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中高糖組p38MAPK 蛋白表達(dá)水平達(dá)對(duì)照組的2.6 倍;高糖+10-5M 辛伐他汀組p38MAPK 蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組比較,三組不同濃度的辛伐他汀干預(yù)組p38MAPK 蛋白表達(dá)顯著下調(diào),抑制率分別為12.3%、23.1%、61.5%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且呈濃度依賴性(P<0.05)。

    辛伐他汀對(duì)高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中Caspase-3 濃度的影響(表2):與對(duì)照組比較,高糖組,高糖+10-7M 辛伐他汀組,高糖+10-6M 辛伐他汀組Caspase-3 濃度顯著升高(P均<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,高糖+10-5M 辛伐他汀組Caspase-3 濃度與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組比較,三組不同濃度的辛伐他汀干預(yù)組Caspase-3 濃度顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且呈濃度依賴性(P<0.05)。

    辛伐他汀對(duì)高糖刺激時(shí)心肌細(xì)胞NADPH 氧化酶p22phox、p47phox mRNA 表達(dá)的影響(圖5):與對(duì)照組比較,高糖組、高糖+10-7M 辛伐他汀組、高糖+10-6M 辛伐他汀組NADPH 氧化酶p22phox、p47phoxmRNA 表達(dá)顯著上調(diào)(均為P<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高糖+10-5M 辛伐他汀組NADPH 氧化酶p22phox、p47phoxmRNA 表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組比較,三組不同濃度的辛伐他汀干預(yù)組NADPH 氧化酶p22phox、p47phoxmRNA 表達(dá)顯著下調(diào),抑制率分別為21.7%、33.2%、52.2%及14.9%、34.6%、46.6%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且呈濃度依賴性(P<0.05)。

    圖3 TUNEL 染色檢測(cè)各組乳鼠心肌細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù) (×10)

    圖4 Western blot 分析各組乳鼠心肌細(xì)胞p38MAPK 蛋白表達(dá)的免疫印跡圖

    圖5 辛伐他汀對(duì)高糖刺激時(shí)各組乳鼠心肌細(xì)胞NADPH 氧化酶p22phox、p47phox mRNA 表達(dá)的影響

    表2 高糖刺激心肌細(xì)胞后辛伐他汀對(duì)各組乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中Caspase-3 濃度的影響(μmol/L,n=6)

    3 討論

    糖尿病病變過(guò)程中的并發(fā)癥,尤其是心臟方面的并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制以及治療已引起廣泛關(guān)注,成為研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用高濃度葡萄糖刺激原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞活力明顯下降,培養(yǎng)液中LDH 活力明顯增高,SOD 活力明顯降低,表明高濃度葡萄糖引起心肌細(xì)胞發(fā)生損傷。與國(guó)內(nèi)研究[2,6]結(jié)果一致。應(yīng)用辛伐他汀干預(yù)后,心肌細(xì)胞活力及SOD 活力明顯升高,LDH 活力明顯降低,辛伐他汀抑制了高糖對(duì)心肌細(xì)胞的氧化損傷。

    既往研究表明,糖尿病及其并發(fā)癥 (心血管并發(fā)癥,糖尿病腎病等)伴隨著細(xì)胞內(nèi)NADPH 氧化酶途徑激活,從而發(fā)生氧化應(yīng)激[7],p38MAPK 可能在與心肌損傷和心肌重構(gòu)過(guò)程有關(guān)的心臟病變時(shí)激活[8]。本研究結(jié)果表明,高糖刺激使NADPH 氧化酶亞基mRNA 表達(dá)上調(diào),p38MAPK 蛋白表達(dá)增高,Caspase-3 表達(dá)增高,凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多,而辛伐他汀干預(yù)呈濃度依賴性地使NADPH 氧化酶mRNA表達(dá)降低,p38MAPK 表達(dá)降低,Caspase-3 濃度降低,凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少?;A(chǔ)和臨床資料已經(jīng)表明他汀類藥物能夠通過(guò)減輕NADPH 氧化酶源性的活性氧的產(chǎn)生抑制心肌細(xì)胞肥大并改善心功能。周超杰等[9]研究表明,激活的JNK 信號(hào)通路參與了STZ 誘導(dǎo)的糖尿病心肌病損傷過(guò)程,辛伐他汀能夠緩解糖尿病心肌損傷。呂莎莎等[10]研究表明,辛伐他汀降低2 型糖尿病大鼠心肌Toll 樣受體4 表達(dá),均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。孫靜等[11]研究結(jié)果顯示缺血后適應(yīng)通過(guò)抑制心肌p38MAPK 的磷酸化而減少再灌注過(guò)程中血小板-白細(xì)胞聚集體的表達(dá),進(jìn)一步減輕缺血再灌注損傷,與本研究通路一致。Riad 等研究表明,糖尿病大鼠p38MAPK 表達(dá)增高,而在心臟特異性表達(dá)p38MAPK 負(fù)變株的轉(zhuǎn)基因糖尿病大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)和功能明顯改善,p38MAPK 激活是糖尿病心肌病心肌重構(gòu)必要的通路[8],抑制p38MAPK可以改善鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的心功能和內(nèi)皮細(xì)胞功能。

    氧化應(yīng)激引起心肌細(xì)胞的凋亡和壞死在心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用,因?yàn)樾募〖?xì)胞幾乎不具有再生能力,因此凋亡增加引起心肌細(xì)胞減少成為糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。Caspase-3 是凋亡關(guān)鍵效應(yīng)酶,是絕大多數(shù)凋亡機(jī)制的必經(jīng)共同途徑,一旦Caspase-3 活化,則凋亡不可逆轉(zhuǎn),因此常測(cè)定組織Caspase-3 活性反映凋亡程度。本研究行TUNEL 染色結(jié)果顯示高糖組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加,測(cè)定培養(yǎng)液中Caspase-3 濃度表明高糖引起了明顯的心肌細(xì)胞凋亡,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這一點(diǎn)與Andrea 等在糖尿病患者的心室肌標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果一致,該研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者心肌細(xì)胞的凋亡是非糖尿病患者的85 倍,而壞死只有3~4 倍。以往的研究證實(shí)在糖尿病患者及STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌內(nèi)均發(fā)現(xiàn)增多的凋亡細(xì)胞[12];在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,給予高糖刺激后,細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯增加[13];Ghosh 等[14]也在STZ 大鼠心肌中發(fā)現(xiàn)Caspase-3 活性增高并伴有心臟收縮舒張功能不全;Ricci 等[15]研究表明,以25 mmol/L 濃度的高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞凋亡明顯增多,均與本研究結(jié)果一致。李凡璐[16]研究表明,辛伐他汀抑制糖尿病大鼠心肌細(xì)胞p53 和凋亡調(diào)控基因(BAX)表達(dá)、增加抗凋亡基因(BCL-2)的表達(dá),從而抑制心肌細(xì)胞凋亡;Al-Rasheed 等[17]研究表明,辛伐他汀能夠減輕糖尿病大鼠心肌氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),預(yù)防糖尿病大鼠心臟組織學(xué)改變和膠原沉積。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明辛伐他汀治療后通過(guò)抑制NADPH 氧化酶-p38MAPK 通路降低心肌細(xì)胞Caspase-3 表達(dá),凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,從而抑制心肌細(xì)胞凋亡,對(duì)高糖損傷的乳鼠心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

    綜上所述,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明高糖-NADPH氧化酶-p38MAPK 通路是高糖損傷心肌細(xì)胞的重要機(jī)制,并發(fā)現(xiàn)辛伐他汀通過(guò)抑制NADPH 氧化酶活性降低p38MAPK 蛋白表達(dá),抑制心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果不僅為他汀類藥物與糖尿病氧化應(yīng)激之間的關(guān)系拓寬了認(rèn)識(shí)的視野,而且將為利用他汀類藥物作為防治糖尿病慢性并發(fā)癥的藥物臨床應(yīng)用提供依據(jù)。但是本研究是在細(xì)胞水平的研究,而體內(nèi)存在著龐大的物質(zhì)聯(lián)系,他汀類藥物在體內(nèi)條件下的多效性作用和細(xì)胞代謝的相互關(guān)系以及對(duì)糖尿病心肌病的影響還有待于進(jìn)一步研究和探索。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突

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