胚胎期及出生后不同年齡段小鼠心肌細胞體外分離方法及優(yōu)化

李燕，馮杰，聶宇，王玉瑤

心血管病是威脅人類健康的第一殺手[1]。心肌細胞作為心臟研究的焦點，長期以來被用作心臟生理學(xué)和病理學(xué)的研究工具[2]。雖然商品化的心臟細胞系，如HL-1 細胞的獲取及操作更為方便[3]，但體外分離的原代心肌細胞在結(jié)構(gòu)和功能上與心臟的生理及病理機制具有更好的相關(guān)性。因此，掌握心肌細胞體外分離技術(shù)至關(guān)重要。

隨著年齡增長，心肌細胞的形態(tài)及功能均會發(fā)生很大的變化。在胚胎期及出生后7 d 內(nèi)，心肌細胞具有增殖能力，隨后這種自我增殖能力喪失[4]。因此，分離不同發(fā)育階段（胚胎期至成年期等）的心肌細胞可為再生醫(yī)學(xué)以及臨床治療提供強有力的支撐條件。

針對胚胎期或某一特定年齡段小鼠的心肌細胞體外分離方法已多較有相關(guān)報道[5-6]。但目前鮮有研究系統(tǒng)性、比較性地分析胚胎期及出生后不同年齡段小鼠心肌細胞的體外分離方法。本研究將系統(tǒng)性、比較性地分析胚胎期及出生后不同年齡段小鼠心肌細胞體外分離的各種方法，并對其進行條件優(yōu)化，以期得到不同年齡段小鼠心肌細胞分離的最佳方法，從而獲得純度高、活性好且形態(tài)佳的心肌細胞。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

不同胎齡及出生后年齡的無特定病原體級C57BL/6 小鼠（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司）56 只，包括懷孕14.5 d（E14.5）胚胎期小鼠（n=6）、新生1 d 齡（P1）小鼠（n=20）、出生后4 d（P4）小鼠（n=12）、出生后7 d（P7）小鼠（n=12）、成年小鼠（出生后56 d，P56，n=6）。

1.2 心肌細胞體外分離方法

1.2.1 胰酶消化法

將E14.5 的C57BL/6 雌鼠6 只斷頸處死，剖腹取出胚胎，體式顯微鏡（蔡司Stemi 305，德國）下取出胚胎小鼠心臟，去除心房組織后放入0.25%含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶（Gibco 公司，美國）中，37℃消化心臟，每隔3～5 min 輕彈1 次，彈3 次后用含10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）（Gibco 公司）終止消化，100 μm 濾網(wǎng)過濾，300×g 離心5 min，去上清，用含10%FBS 的DMEM 重懸細胞；運用差速貼壁法37℃靜置90 min，上清即為心肌細胞懸液，可用于后續(xù)細胞培養(yǎng)實驗。

1.2.2 新生鼠心臟解離試劑盒法（Gentle MACS 法）

將P1 C57BL/6 小鼠20 只斷頸處死，開胸取出心臟，去除兩個心房及結(jié)締組織后，利用Neonatal Heart Dissociation Kit（Miltenyi 公 司，德 國） 及Gentle MACS Octo Dissociator 儀器（Miltenyi 公司，德國）消化心臟（含酶A：12.5 μl、酶P：62.5 μl、酶D：100 μl、緩沖液Y：25 μl、緩沖液X：23 000 μl）；程序結(jié)束后立即用含10% FBS 的DMEM 終止消化，100 μm 濾網(wǎng)過濾，300×g 離心5 min，去上清；輕彈細胞后加入紅細胞裂解液（碧云天公司，上海）裂解紅細胞，數(shù)分鐘后用磷酸鹽緩沖液（PBS）終止紅細胞裂解過程，300×g 離心5 min，去上清，用含10% FBS 的DMEM 重懸細胞；運用差速貼壁法37℃靜置90 min，上清即為心肌細胞懸液，可用于后續(xù)細胞培養(yǎng)實驗。

1.2.3 Langendorff 灌流法Langendorff 法分離心肌細胞步驟簡述如下：

（1）灌流系統(tǒng)的準(zhǔn)備：提前開啟灌流裝置，開啟加溫器（固定在37℃左右），用去離子超純水或蒸餾水循環(huán)，確保整個灌流裝置沒有氣泡，以免堵塞血管，造成心肌壞死。同時，在循環(huán)時測灌流滴灌出口的溫度，保持在37℃左右。待心肌灌流前20～30 min，換用新鮮灌注緩沖液進行循環(huán)。

（2）取小鼠心臟：6 只P56 C57BL/6 小鼠麻醉前15 min 將0.2 ml 肝素（1 000 U）進行腹腔注射作抗凝準(zhǔn)備；按0.18 ml/10 g 的劑量，給小鼠腹腔注射三溴乙醇溶液進行麻醉處理；麻醉起效后，將小鼠固定在解剖臺上。開胸，迅速找到心臟主動脈，左手持鑷子將主動脈夾住，右手用剪刀靠上部剪下心臟；將剪下的心臟迅速放入預(yù)冷的灌注緩沖液中，立刻將心臟掛在灌流系統(tǒng)上。用灌注緩沖液灌流3～5 min，灌流速度約4～5 ml/min。

（3） 心肌組織的酶解：將膠原酶緩沖液接入灌流裝置，約10 ml 膠原酶緩沖液進入灌流裝置時開始計時，同時觀察心臟心肌的柔軟程度，最初心臟逐漸變硬、膨大、變白，之后慢慢變軟、透明，用手隨時感覺心臟的變軟程度，大約40 min 時，剪下，于3 ml 膠原酶緩沖液（循環(huán)灌流時用過的）中，顯微鑷撕碎心室組織至 1 mm3大小，吸管反復(fù)吹打至無明顯團塊；培養(yǎng)皿中加入5 ml 終止緩沖液終止消化，吹打1 min，過濾至50 ml 離心管；室溫靜置20 min 后去上清，輕彈細胞，用灌注緩沖液重懸，低速離心或自然沉降后即得心肌細胞懸液。

1.2.4 非Langendorff 灌流法

取P4、P7 的C57BL/6 小鼠各6 只、P56 的C57BL/6 小鼠3 只，三溴乙醇溶液（0.18 ml/10 g） 麻醉，將小鼠仰臥位固定，開腹后撥開腹腔腸管，剪斷下腔靜脈和腹主動脈排空血液；開胸，將1 ml EDTA 緩沖液（含氯化鈉130 mmol、氯化鉀5 mmol、磷酸二氫鈉0.5 mmol、4-羥乙基哌嗪乙磺酸10 mmol、葡萄糖10 mmol、二乙酰一肟10 mmol、?；撬?0 mmol、EDTA 5 mmol；pH=7.8，試劑均購自美國Sigma 公司）注入右心室；游離升主動脈，止血夾夾閉（勿傷及主動脈根部）。眼科剪取下心臟后置于含10 ml EDTA 的培養(yǎng)皿中；左心室注射1 ml EDTA 緩沖液后轉(zhuǎn)入含10 ml 灌注緩沖液（含1 mmol 氯化鎂的EDTA 緩沖液，不含EDTA）的培養(yǎng)皿；再次向左心室注射1 ml 灌注緩沖液后轉(zhuǎn)入含 10 ml 膠原酶緩沖液的培養(yǎng)皿；左心室再注射3～5 ml 膠原酶緩沖液（酶成分及終濃度：膠原酶Ⅱ0.5 mg/ml；膠原酶Ⅳ0.5 mg/ml；蛋白酶ⅩⅣ0.05 mg/ml），使心臟呈蒼白色，質(zhì)軟。剪除心房及大血管組織，將心室轉(zhuǎn)入含 1 ml 膠原酶緩沖液的培養(yǎng)皿；顯微鑷撕碎心室組織至1 mm3大小，吸管反復(fù)輕輕吹打至無明顯團塊后加入1.5 ml 終止緩沖液（含5% FBS 的灌注緩沖液）終止消化，輕輕吹打1 min，過濾至50 ml 離心管；20×g 離心5 min，棄上清，輕彈細胞，用灌注緩沖液重懸，低速離心或自然沉降后即得心肌細胞懸液。

1.3 心肌細胞大小及形態(tài)學(xué)檢測

熒光顯微鏡（蔡司Axio Observer D1，德國）明場狀態(tài)下成像檢測心肌細胞大小，在20 倍放大倍數(shù)下選取3 個不同的視野測量心肌細胞大小，每個視野測量10 個心肌細胞并取平均值。使用Count Star 儀器（睿鈺生物科技有限公司，上海）檢測心肌細胞形態(tài)，細胞透亮的即為狀態(tài)良好的心肌細胞。

1.4 心肌細胞免疫熒光染色

取細胞懸液涂片，4%多聚甲醛固定20 min，PBS-吐溫20 （PBST） 洗2 遍，PBS 洗3 遍；用含0.3%聚乙二醇辛基苯基醚-X 100（Triton-X 100）的山羊血清封閉1 h；一抗稀釋液稀釋抗α 輔肌動蛋白（α-actinin）一抗抗體（Abcam 公司，美國）后，滴加到細胞表面，4℃過夜；常溫復(fù)溫1 h；PBST 洗2 遍，PBS 洗3 遍；二抗室溫孵育1 h，PBST 洗2 遍，PBS洗3 遍；用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片劑封片；激光共聚焦顯微鏡（蔡司LSM800，德國） 成像。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 用胰酶消化法分離得到的胚胎期小鼠心肌細胞存活率及形態(tài)

胚胎期小鼠心肌細胞存活能力較強，傳統(tǒng)胰酶消化法即可獲得存活率較高的心肌細胞。我們?nèi)?0 個E14.5 小鼠心室組織加入400 μl 含EDTA的0.25%胰酶消化液中，15 min 后組織塊基本消化完全。消化結(jié)束后用Count Star 儀器進行細胞計數(shù)并計算細胞濃度及存活率，同時觀察細胞形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰酶消化法可得到存活率約94%的心肌細胞，細胞透亮的即為狀態(tài)良好的心肌細胞（圖1A）；熒光顯微鏡明場下觀察結(jié)果進一步確證細胞形態(tài)良好（圖1B）。將心肌細胞懸液利用差速貼壁法進行純化，得到較純的心肌細胞，培養(yǎng)24 h后用心肌細胞標(biāo)志物α-actinin 進行免疫熒光染色，用DAPI 標(biāo)記細胞核，利用激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示細胞具備心肌細胞典型形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖1C）。

2.2 用心臟解離試劑盒法分離得到的新生小鼠心肌細胞存活率及形態(tài)

將P1 小鼠（n=20）的心肌細胞用Gentle MACS法按照試劑盒說明書進行分離（此方法適用于P1～P3小鼠心肌細胞分離）。此方法得到的心肌細胞存活率可達97%以上（圖2A），且心肌細胞形態(tài)良好（圖2B、2C），細胞長徑為（40.5 ± 10.2）μm，細胞短徑為（14.0 ± 0.5） μm。

圖1 用胰酶消化法分離得到的胚胎期小鼠心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.3 用心臟解離試劑盒法和非Langendorff 灌流法分離得到的出生后4 d 和7 d 小鼠心肌細胞存活率和形態(tài)

出生后3 d 以上及成年小鼠心肌細胞均可用Langendorff 灌流法進行分離。本實驗發(fā)現(xiàn)，P4、P7小鼠心臟較小，主動脈較細且極易斷裂，不易將主動脈固定在注射器針頭頭部，故不適用Langendorff灌流法分離。因此，本實施首先運用Gentle MACS 法分離了P4、P7 小鼠心肌細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心肌細胞存活率極低，鏡下觀察，幾乎無桿狀的心肌細胞（圖3A、4A）。我們隨即進一步用2016年文獻報道的一種心肌細胞新分離方法——非Langendorff 灌流法對P4、P7 小鼠心肌細胞進行分離，發(fā)現(xiàn)得到的心肌細胞存活率可達70%～80%，細胞涂片后在熒光顯微鏡明場下觀察及免疫熒光染色后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細胞形態(tài)良好，桿狀細胞較多（圖3B～3D、圖4B～4D）；P4小鼠心肌細胞長徑為（56.9 ± 4.3）μm，細胞短徑為（12.3 ± 5.6） μm；P7小鼠心肌細胞長徑為（60.0 ± 4.0）μm，細胞短徑為（15.8 ± 3.2）μm。

2.4 用Langendorff 灌流法和非Langendorff 灌流法分離得到的成年小鼠心肌細胞存活率和形態(tài)

本實驗同時用傳統(tǒng)Langendorff 灌流法和非Langendorff 灌流法分離P56 小鼠的心肌細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種分離方法均可得到存活率較高的桿狀心肌細胞，且桿狀率均在70%～80%之間，細胞存活率維持在70%左右（圖5）。P56 小鼠心肌細胞長徑為（70.2± 10.9）μm，細胞短徑為（23.7 ± 6.4）μm。

圖3 用心臟解離試劑盒法和非Langendorff 灌流法分離得到的出生后4 d 小鼠心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖4 用心臟解離試劑盒法和非Langendorff 灌流法分離得到的出生后7 d 小鼠心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖5 用Langendorff 灌流法和非Langendorff 灌流法分離得到的成年小鼠心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

3 討論

胎期期及出生后不同年齡段小鼠原代心肌細胞的體外分離已成為心血管研究的基本方法和手段之一，對于研究心肌細胞的電生理學(xué)、信號傳導(dǎo)、藥物測試以及單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)有著重要意義[7-15]。目前已有較為成熟的心肌細胞體外分離方法，但對于胚胎期及出生后不同年齡段小鼠尚少有系統(tǒng)性的研究。因此，研究者需查閱大量文獻，即便按照文獻步驟進行分離也易出現(xiàn)大量未知錯誤，重復(fù)性較差，并且需深入探討諸多影響因素。本實驗對不同年齡段小鼠心肌細胞體外分離的方法進行了系統(tǒng)性探索及優(yōu)化，得到了不同時期小鼠心肌細胞分離的最優(yōu)方法，獲得了活性高且狀態(tài)好的心肌細胞，且心肌細胞大小與文獻報道相符[16]，能夠滿足心血管病發(fā)生、發(fā)展的多種生理生化實驗及心臟組織工程學(xué)研究的要求。

根據(jù)已有文獻報道以及本實驗結(jié)果提示，胚胎期小鼠心肌細胞的體外分離方法為胰酶消化法，可得到存活率為85%以上的心肌細胞。該法所需胰酶體積及消化時間需根據(jù)心臟大小及心臟個數(shù)而定。一般來說，對于E14.5 小鼠來說，消化10 個心臟大約需400 μl 胰酶，37℃消化兩次，每隔5 min 輕彈一次，即可獲得存活率高的心肌細胞。對于新生小鼠（出生后1～3 d），心肌細胞的體外分離方法優(yōu)先選擇Gentle MACS 法，可獲得活性約97%的心肌細胞。Gentle MACS 法中約20 個心臟用一個體系的酶量（2.5 ml），心臟較多時只需相應(yīng)增加酶量即可。此外，在分離程序結(jié)束后應(yīng)立即用預(yù)熱的含10%FBS 的DMEM 終止消化，否則會因消化過度而影響心肌細胞存活。在每次離心結(jié)束后，應(yīng)輕彈細胞，力度不宜過大，以免細胞破碎。

與Gentle MACS 法相比，出生后4 d 和7 d 的小鼠心肌細胞體外分離可優(yōu)先選擇非Langendorff 灌流法，分得的心肌細胞存活率在70%～80%之間。用非Langendorff 灌流法分離心肌細胞時，應(yīng)嚴加把控注射酶的速度，速度過快會導(dǎo)致細胞斷裂，桿狀細胞率降低。此外，應(yīng)用37℃預(yù)熱好的酶液進行注射，以更好的模擬體內(nèi)環(huán)境。P4、P7 小鼠可用低速離心的方法將心肌細胞沉淀，而P56 小鼠因心肌細胞體積較大且易斷裂，應(yīng)用自然沉降的方法進行細胞沉降，以去除非心肌細胞。

目前，Langendorff 灌流法分離成年心肌細胞方法已較為成熟，但是其影響因素較多，包括灌流系統(tǒng)的穩(wěn)定性、灌流液的溫度、酶的選擇、濃度及消化時間及操作者的熟練程度等諸多細節(jié)均可能影響心肌細胞的狀態(tài)[17-18]。本實驗對緩沖液的各種成分間的配比進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)如果在消化液中加入蛋白酶會在灌流過程中產(chǎn)生大量氣泡，故最好不加蛋白酶。此外，應(yīng)嚴格把控灌注緩沖液及膠原酶緩沖液pH值的穩(wěn)定性，pH值發(fā)生改變會在很大程度上影響心肌細胞的活性。尤為重要的是，在整個灌流過程中應(yīng)嚴格避免氣泡進入心臟組織中。相反，非Langendorff 灌流法較為簡便，易于操作，無需特定實驗器材，只需注意注射酶液的速度，即可得到存活率較高的桿狀心肌細胞。

總之，本實驗系統(tǒng)研究了胚胎期及出生后不同年齡段小鼠心肌細胞的體外分離方法并進行了優(yōu)化，得到的最優(yōu)分離方法獲得的心肌細胞純度高、活性好、形態(tài)佳，且這些方法操作簡便有效、重復(fù)性強，為心肌細胞的電生理學(xué)、信號傳導(dǎo)、藥物測試以及單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)等諸多研究的開展提供了重要的基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突