瘢痕疙瘩中微小RNA-34b的表達(dá)及與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β₁的相關(guān)性

林簡(jiǎn) 劉曉紅 王榮坤 李濤 李娜 陳惠娟

[摘要]目的：檢測(cè)瘢痕疙瘩中微小RNA-34b（miR-34b）的表達(dá)，分析其與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的相關(guān)性。方法：收集42例瘢痕疙瘩術(shù)后組織作為觀察組，收集42例增生性瘢痕術(shù)后組織作為對(duì)照組，收集正常皮膚組織42例作為正常對(duì)照組。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)三組中miR-34b的表達(dá)，應(yīng)用免疫組化和Western Blot法檢測(cè)觀察組中TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果：觀察組中miR-34b的表達(dá)明顯低于對(duì)照組和正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。觀察組中miR-34b的表達(dá)在有無(wú)家族史及不同病變高度的分組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而在不同性別、年齡、病程的分組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。相關(guān)分析顯示miR-34b與TGF-β1呈負(fù)相關(guān)性。結(jié)論：瘢痕疙瘩中miR-34b低表達(dá)，與家族史及病變?cè)錾母叨认嚓P(guān)。miR-34b與TGF-β1具有協(xié)同負(fù)向作用。

[關(guān)鍵詞]瘢痕疙瘩;miR-34b;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;相關(guān)性;增生性瘢痕

[中圖分類號(hào)]R619+.6? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2020）07-0093-03

Abstract： Objective? To detect the expression of microRNA-34b （miR-34b） in keloid， analyze its correlation with transforming growth factor-β1（TGF-β1）. Methods? 42 cases of keloid were collected as the observation group. 42 cases of hypertrophic scar were collected as the control group. 42 cases of normal skin were collected as the normal control group. The expression of miR-34b was detected by real-time fluorescent quantitative PCR， and TGF-β1 was detected by immunohistochemistry and Western Blot method. Results? Expression of miR-34b was significantly lower in the observation group than that in the control group and the normal control group， the difference is statistically significant（P<0.05）. The expression of miR-34b was statistically significant in family history and different lesion hight（P<0.05）， but there was no significant difference in gender， age and course of disease（P>0.05）. Correlation analysis showed that miR-34b was negatively correlated with TGF-β1. Conclusion? Lower expression of miR-34b is related to family history and lesion height. MiR-34b and TGF-β1 have synergistic negative effects.

Key words： keloid; miR-34b; TGF-β1; correlation; hypertrophic scar

瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中形成的病變，主要為成纖維細(xì)胞異常增殖、膠原過(guò)量沉積引起的纖維組織過(guò)度增生[1]。臨床上因瘢痕攣縮引起的功能異常也較為常見(jiàn)。目前瘢痕疙瘩發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制不明確。有研究顯示高表達(dá)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用，其常通過(guò)SMAD、MAPK和PI3K等通路發(fā)揮作用[2]。近年來(lái)有學(xué)者關(guān)注到微小RNA（miRNA）可能與病理性瘢痕的形成有關(guān)。miRNA是一種非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核動(dòng)物體內(nèi)，與其他基因的非編碼區(qū)域互補(bǔ)，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)[3]。借鑒腫瘤學(xué)中的篩選方法，選擇與侵襲相關(guān)的miR-34b進(jìn)行研究，并應(yīng)用TargetScan和RNA22數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到TGF-β1可能是miR-34b的靶因子。基于此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前瞻性研究，觀察miR-34b在瘢痕疙瘩中的表達(dá)意義，分析其與TGF-β1的相關(guān)性，以期為研究病理性瘢痕的發(fā)生發(fā)展提供幫助。

1? 資料和方法

1.1 臨床資料：選擇筆者醫(yī)院2018年1月-2019年6月確診為瘢痕疙瘩并行手術(shù)治療的患者42例作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①腫塊隆起于皮膚表面，質(zhì)硬，表面光滑發(fā)亮，界限欠規(guī)則，1年內(nèi)無(wú)自然消退跡象;②病變超出原始損傷邊緣，向周?chē)＝M織發(fā)生浸潤(rùn)，蟹足狀生長(zhǎng);③具有持續(xù)性生長(zhǎng)、發(fā)紅、痛癢等癥狀，無(wú)自愈傾向，不能自行消退;④病理學(xué)證實(shí)瘢痕組織內(nèi)有膠原及基質(zhì)成分的大量沉積，成纖維細(xì)胞很多，并有分裂像。其中男22例，女20例，年齡18～36歲，平均為（24.0±4.9）歲。選擇同期在筆者醫(yī)院確診為增生性瘢痕并行手術(shù)治療的患者42例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：損傷因素明確、瘢痕色澤紅、質(zhì)硬，高出皮膚，瘢痕的增殖不超過(guò)損傷范圍。其中男20例，女22例，年齡19～42歲，平均為（26.7±4.2）歲。選擇同期因體表皮下良性腫物切除術(shù)時(shí)切取的正常皮膚組織42例作為正常對(duì)照組，其中男21例，女21例，年齡18～36歲，平均為（23.9±4.0）歲。均留取術(shù)后的新鮮組織（-80℃凍存）及石蠟包埋組織。三組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬簽定知情同意書(shū)。

1.2 樣本量評(píng)估：應(yīng)用兩樣本均數(shù)比較的評(píng)估方法：即n1=n2=2[（uα+uβ）/δ/σ]2+1/4uα2，按預(yù)實(shí)驗(yàn)中miR-34b的表達(dá)并查閱文獻(xiàn)，擬正常皮膚組織中的表達(dá)量為2.2，瘢痕疙瘩中的表達(dá)量為1.1，二者的差值是1.1，如果σ=1.1，δ/σ=0.9，α=0.05，計(jì)算n1=n2≈42例。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)miR-34b的表達(dá)，檢測(cè)基于新鮮標(biāo)本。miR-34b引物上游：5'-ATCGGCCCAAAGTGGTG-3'，下游：5'-ACAAACTGGACTCAGCTT-3'。以U6為內(nèi)參，上游：5'-GGAACGAGAAAGATTAGC-3'下游：5'-TTGGAATTCACGAAATTCCG-3'。引物由蘇州睿贏生物技術(shù)公司合成。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反應(yīng)程序：95℃ 5min，1個(gè)循環(huán);95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，15個(gè)循環(huán);93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s。共40個(gè)循環(huán)。60℃時(shí)采集信號(hào)，記錄Ct值，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因。ΔΔCt=[Ct目的基因（未知樣品）-CtGAPDH（未知樣品）]-[Ct目的基因（校正樣品）-CtGAPDH（校正樣品）]。

1.3.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)：瘢痕疙瘩中TGF-β1的表達(dá)應(yīng)用免疫組化SP法。試劑購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司。常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋后，切取4μm切片。先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇TGF-β1為1：150的濃度用于正式實(shí)驗(yàn)，行DAB顯色。嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟操作，做好質(zhì)控工作。結(jié)果由病理醫(yī)師應(yīng)用盲法評(píng)定。TGF-β1的陽(yáng)性部位是細(xì)胞質(zhì)，以淺黃到棕褐色定為陽(yáng)性。著色強(qiáng)度：以無(wú)、淺黃、黃、棕褐色分別計(jì)為0分、1分、2分、3分、4分。隨機(jī)選擇3個(gè)400倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取陽(yáng)性率的平均值，以陽(yáng)性率<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別計(jì)為0分、1分、2分、3分、4分，兩者相加為最終評(píng)分，總分0～7分。以≥3分為陽(yáng)性，以<3分為陰性，計(jì)算陽(yáng)性率。

1.3.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)：瘢痕疙瘩中TGF-β1的半定量表達(dá)應(yīng)用Western Blot檢測(cè)。嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行蛋白提取、蛋白濃度測(cè)定、蛋白變性、加樣、電泳、電轉(zhuǎn)膜、免疫雜交后，取出膜后加入超敏發(fā)光液，發(fā)光時(shí)間3min。X膠片盒曝光2min，顯影25s。應(yīng)用Image J分析，以TGF-β1與GAPDH的比值作為相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SAS 6.12軟件進(jìn)行分析，率的比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，定量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用方差分析（SNK法行兩兩比較），應(yīng)用Spearman相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 三組中miR-34b表達(dá)比較：觀察組中miR-34b的表達(dá)明顯低于對(duì)照組和正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1，見(jiàn)圖1～2。

2.2 觀察組不同臨床特征中miR-34b表達(dá)比較：觀察組中miR-34b的表達(dá)在有無(wú)家族史及不同病變高度的分組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而在不同性別、年齡及病程的分組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 miR-34b與TGF-β1的相關(guān)性：免疫組化檢測(cè)瘢痕疙瘩中TGF-β1表達(dá)的評(píng)分為0～7分，相關(guān)分析顯示瘢痕疙瘩中miR-34b和TGF-β1具有負(fù)相關(guān)性（r=-0.53，P=0.018）。見(jiàn)圖3～4。Western Blot檢測(cè)瘢痕疙瘩中TGF-β1的表達(dá)范圍是1.2～8.1，相關(guān)分析顯示瘢痕疙瘩中miR-34b和TGF-β1具有負(fù)相關(guān)性（r=-0.49，P=0.026）。見(jiàn)圖5～6。

3? 討論

miRNA在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，是一類長(zhǎng)度為22bp的內(nèi)源性非編碼RNA，其能對(duì)染色體和遺傳因素進(jìn)行有效的調(diào)控，對(duì)發(fā)育的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控[4-5]。miRNA是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子[6]。miR-34b與腫瘤的侵襲性生長(zhǎng)有關(guān)，有研究認(rèn)為瘢痕疙瘩為結(jié)締組織腫瘤，具有向周?chē)＝M織浸潤(rùn)的作用[7-8]，因此本實(shí)驗(yàn)在選擇miRNA因子時(shí)參考病變具有的侵襲性生長(zhǎng)的生物學(xué)行為，亦參考了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選到miR-34b可能是與間質(zhì)異常增殖和間質(zhì)細(xì)胞侵襲生長(zhǎng)相關(guān)的因子。有研究認(rèn)為前miR-34b具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)細(xì)胞核及細(xì)胞漿內(nèi)的處理成為成熟的miR-34b[9]。成熟的miR-34b長(zhǎng)度約為21～22個(gè)核苷酸，有6～7個(gè)相同的核苷酸種子序列，種子序列為miRNA與靶mRNA結(jié)合的綁定單位，通過(guò)與mRNA 3-UTR的互補(bǔ)進(jìn)而調(diào)節(jié)下游因子，發(fā)揮生物學(xué)作用[10]。MiR-34b的靶基因較多，主要是與間質(zhì)細(xì)胞形成相關(guān)的因子，如TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和Ⅳ型膠原等[11]。TGF-β1是目前認(rèn)為與瘢痕形成相關(guān)的重要因子，其高表達(dá)對(duì)促進(jìn)纖維母細(xì)胞增殖，刺激膠原的合成，誘導(dǎo)纖維連接蛋白的產(chǎn)生有重要作用[12]。研究顯示TGF-β1更多是受基因調(diào)控發(fā)揮生物學(xué)作用的[13]。

本研究結(jié)果顯示瘢痕疙瘩中miR-34b的表達(dá)明顯下降，提示miR-34b異常表達(dá)是病變形成的重要促進(jìn)因子。本研究發(fā)現(xiàn)miR-34b與TGF-β1呈負(fù)相關(guān)性，且經(jīng)免疫組化結(jié)果和Western Blot結(jié)果證實(shí)，提示二者具有明確的負(fù)向協(xié)同作用。TGF-β1是一種分泌型活性多肽，在瘢痕疙瘩的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，尤其是對(duì)成纖維細(xì)胞的增生，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過(guò)量沉積有明顯作用，膠原纖維排列紊亂也是TGF-β1調(diào)節(jié)的結(jié)果。TGF-β1高表達(dá)時(shí)可以引起MMP-9表達(dá)的下調(diào)，對(duì)基質(zhì)的降解作用減弱，細(xì)胞外基質(zhì)和IV型膠原的合成增高[14]。TGF-β1可能是miR-34b下游的靶基因，但是本研究尚不足以證實(shí)miR-34b與TGF-β1的靶向關(guān)系，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)行瘢痕細(xì)胞系的構(gòu)建，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等證實(shí)二者的關(guān)系。本研究顯示miR-34b的表達(dá)在有無(wú)家族史及不同病變高度的分組中差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-34b低表達(dá)預(yù)示著遺傳傾向及較高的增殖特征，也預(yù)示著較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。miR-34b低表達(dá)引起纖維細(xì)胞繁殖加快，對(duì)局部組織的浸潤(rùn)和侵襲增多。miR-34b可能是促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要因子[15]。生物信息學(xué)顯示miR-34b與MMP-9的3'非翻譯區(qū)有一個(gè)保守的結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)MMP-9可能是miR-34b的靶基因，miR-34b在瘢痕中的作用可能與MMP-9有關(guān)，這與本研究的結(jié)論相仿，主要是TGF-β1可以調(diào)控MMP-9在膠原形成中的表達(dá)。miR-34b的正常表達(dá)狀態(tài)是維持上皮和間質(zhì)形態(tài)的重要因子。研究中未發(fā)現(xiàn)miR-34b的表達(dá)與病程的關(guān)系，這顯示出miR-34b低表達(dá)狀態(tài)對(duì)瘢痕形成可能不具有持續(xù)性的作用。miR-34b可能具有瘢痕形成中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用，使纖維細(xì)胞的凋亡受到抑制，增殖程度改變[16]。但是我筆者推測(cè)miR-34b在調(diào)節(jié)間充質(zhì)的干細(xì)胞多向分化中的作用不大。

總之，瘢痕疙瘩中miR-34b低表達(dá)，與家族史及病變?cè)錾母叨认嚓P(guān)。miR-34b與TGF-β1具有協(xié)同負(fù)向作用。

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[收稿日期]2019-12-10

本文引用格式：林簡(jiǎn)，劉曉紅，王榮坤，等.瘢痕疙瘩中微小RNA-34b的表達(dá)及與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的相關(guān)性[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2020，29（7）：93-96.