2015-2019年兒童呼吸道感染嗜血桿菌分離檢出及耐藥性變遷分析

趙智凝，張 偉，張小龍，王小艷（中國人民解放軍空軍第九八六醫(yī)院，西安 710054）

嗜血桿菌（Haemophilus）是一群無動力、無芽孢的革蘭陰性短桿菌或球桿菌，常常引起人類急性咽炎、喉炎、氣管炎和肺炎等化膿感染及嚴(yán)重的繼發(fā)感染。兒童由于鼻和鼻腔相對短小、鼻淚管和咽鼓管短等生理特點(diǎn)，且免疫功能尚未完善，因此兒童更容易被該菌屬病原菌所侵襲，產(chǎn)生相應(yīng)癥狀。多項(xiàng)研究顯示嗜血桿菌感染是導(dǎo)致兒童社區(qū)獲得性肺炎的常見原因[1-3]。近年來，隨著臨床上抗生素的大量使用，導(dǎo)致該菌屬細(xì)菌的耐藥率不斷升高[4]，增加了治療的難度，且該菌屬細(xì)菌的耐藥機(jī)制復(fù)雜，使得臨床治療更加棘手。因此，嗜血桿菌的臨床分布和耐藥性的研究對臨床治療具有非常重要的意義。為了深入了解嗜血桿菌在呼吸道感染患兒中的檢出情況及耐藥現(xiàn)狀，本文就2015～2019年本院門診及住院患兒臨床標(biāo)本中分離到的嗜血桿菌的臨床分布特征及藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 以更好地指導(dǎo)臨床合理用藥。

1 材料和方法

1.1 研究對象 2015年1月～2019年12月期間到兒科門診就醫(yī)或住院患兒4 575 例送檢標(biāo)本中共分離出嗜血桿菌233 例，女性118 例，男性115 例。各年齡段分布特征為0 ～1 歲5 例，1 ～3 歲72 例，3 ～5 歲61 例，5 ～8 歲48 例，8 ～12 歲42 例，≥12 歲5 例，平均年齡5.42 ± 2.93 歲?；純荷睇}水漱口后留取晨痰于無菌痰杯中或生理鹽水清潔口腔后用無菌咽拭子采集咽喉部標(biāo)本送檢。同一患兒選取第一次送檢標(biāo)本排除其余重復(fù)標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑 哥倫比亞血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板購于鄭州安圖生物工程有限公司。藥敏紙片購于溫州康泰生物有限公司。鑒定采用法國生物梅里埃公司VITEK-2 compact 全自動微生物鑒定儀及配套的嗜血桿菌（NH）鑒定卡。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)及鑒定：取哥倫比亞血瓊脂平皿和巧克力平皿接種患兒痰標(biāo)本或咽拭子標(biāo)本，同時涂片后行革蘭染色鏡檢，選取高倍視野下見到白細(xì)胞吞噬革蘭陰性短桿菌或球桿菌標(biāo)本的病原菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定及藥敏試驗(yàn)。

1.3.2 體外藥敏試驗(yàn)：對臨床標(biāo)本中分離出來的嗜血桿菌在巧克力瓊脂平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，同時于哥倫比亞血瓊脂平板做生長對照實(shí)驗(yàn)。選取青霉素類的氨芐西林，β-內(nèi)酰胺類復(fù)合制劑的氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢菌素類的頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟，單環(huán)β-內(nèi)酰胺類的氨曲南，碳青霉烯類的亞胺培南、美羅培南，大環(huán)內(nèi)脂類的克拉霉素、阿奇霉素，四環(huán)素類的四環(huán)素，氟喹諾酮類的左氧氟沙星、環(huán)丙沙星，磺胺類的復(fù)方新諾明、利福平及氯霉素20 種抗生素，藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法在巧克力平皿上進(jìn)行。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)藥物敏感性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)文件及每年更新內(nèi)容中嗜血桿菌藥物敏感性試驗(yàn)及折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.3.3 β- 內(nèi)酰胺酶測定：采用頭孢硝噻吩（Nitrocefin）紙片法進(jìn)行測定。β-內(nèi)酰胺酶判定陽性為10 min 內(nèi)紙片變紅，否則為陰性。陰性對照采用大腸埃希菌ATCC25922，陽性對照為大腸埃希菌ATCC35218。

1.3.4 質(zhì)控菌株：質(zhì)控菌株為流感嗜血桿菌ATCC49766 和ATCC49247。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用WHONET 5. 6 軟件進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 嗜血桿菌檢出率 2015～2019年233 株嗜血桿菌屬細(xì)菌培養(yǎng)陽性檢出率分別為2.7%，4.3%，4.9%，5.8% 和6.9%，總檢出率為5.1%（233/4 575）。嗜血桿菌的檢出率由2015年的23 株（2.7%）到2019年的80 株(6.9%)，呈現(xiàn)逐年上升趨勢。

2.2 嗜血桿菌的構(gòu)成比 見表1。從2015 ～2019年，嗜血桿菌屬細(xì)菌檢出以副流感嗜血桿菌（51.1%）和流感嗜血桿菌（36.9%）為主，其他檢出菌包括溶血嗜血桿菌（6.4%）、惰性嗜血桿菌(3.0%)、嗜沫嗜血桿菌(2.6%)，逐年比例雖有波動，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 兒童痰培養(yǎng)嗜血桿菌的檢出率[n（%）]

2.3 流感嗜血和副流感嗜血桿菌的耐藥情況 見表2。流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥率最高達(dá)到75%、復(fù)方新諾明64.3%，接下來是四環(huán)素和阿莫西林/克拉維酸，耐藥率為42.9%,以上抗生素已不適宜臨床經(jīng)驗(yàn)用藥；而頭孢哌酮/舒巴坦及第三、四代頭孢菌素，左氧氟沙星，亞胺培南和阿奇霉素耐藥率均低于18%，可以用于流感嗜血桿菌感染患兒的治療。副流感嗜血桿菌對氨芐西林、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星和阿莫西林/克拉維酸的耐藥率均超過50%，分別為76.2%，71.4%，54.8%和50%。此外，副流感嗜血桿菌對氨芐西林/舒巴坦、四環(huán)素、克拉霉素、氯霉素、頭孢呋辛、氨曲南和美羅培南的耐藥率超過30%；對頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、阿奇霉素、利福平敏感率均高于80%，可作為臨床治療藥物。

表2 流感嗜血桿菌與副流感嗜血桿菌對常用抗生素耐藥情況統(tǒng)計（%）

2.4 嗜血桿菌耐藥機(jī)制 見表3。86 株流感嗜血桿菌β-內(nèi)酰胺酶2015～2019年陽性率分別為33.3%，36.4%，43.8%，45.5%，50.0%， 總 陽 性率44.2%( 38/86)。119 株副流感嗜血桿菌β-內(nèi)酰胺酶2015～2019年陽性率分別為28.6%，35.7%，40.0%，48.3%和54.8%，總陽性率45.4%( 54/119)。β-內(nèi)酰胺酶測定總陽性率為44.9%（92/205），且陽性率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。β-內(nèi)酰胺酶測定陽性株全部對氨芐西林耐藥，β-內(nèi)酰胺酶陰性株中氨芐西林耐藥率為22.0%。

表3 嗜血桿菌β-內(nèi)酰胺酶及氨芐西林的耐藥情況[n（%）]

3 討論

嗜血桿菌屬細(xì)菌寄生在人和多種動物的黏膜，在人體內(nèi)主要寄生在咽喉及口腔黏膜，少見于消化道和生殖道，屬苛養(yǎng)性細(xì)菌，對營養(yǎng)要求嚴(yán)格。從臨床標(biāo)本中分離出的新鮮菌株多呈球桿狀、雙球狀或短鏈狀，陳舊培養(yǎng)物中的菌株呈長桿狀或長絲狀等多形性。呼吸道標(biāo)本中的嗜血桿菌在初代培養(yǎng)時，受到革蘭陽性細(xì)菌的抑制（營養(yǎng)競爭及菌素作用）菌落細(xì)小不易與其他細(xì)菌相互區(qū)別，這是造成嗜血桿菌分離率低的直接原因。在巧克力培養(yǎng)基中加入萬古霉素可抑制了革蘭陽性細(xì)菌的生長，增加對嗜血桿菌的選擇性，菌落較大易于識別，從而大大提高了嗜血桿菌的分離率，這對臨床嗜血桿菌的分離非常重要。嗜血桿菌屬細(xì)菌常常引發(fā)原發(fā)性和繼發(fā)性感染，包括肺炎、腦膜炎、中耳炎[5]等。從2015年1月～2019年12月我院兒科門診及住院患兒臨床標(biāo)本中共分離出嗜血桿菌屬細(xì)菌233 株，由逐年檢出率可見呈明顯的上升趨勢。從檢出比例來看，我院兒科患者感染以副流感嗜血桿菌為主，其次是流感嗜血桿菌，其后依次是溶血嗜血桿菌、嗜沫嗜血桿菌和惰性嗜血桿菌。

本研究發(fā)現(xiàn)嗜血桿菌屬細(xì)菌以流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌為例，對20 種抗生素耐藥率均有逐年增高的趨勢，其中流感嗜血桿菌對氨芐西林和復(fù)方新諾明、四環(huán)素及阿莫西林/克拉維酸耐藥率較高，這與李志浩等[6]的研究結(jié)果一致；對頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、阿奇霉素和左氧氟沙星耐藥率比較低，可供臨床用藥參考。副流感嗜血桿菌對氨芐西林、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星和阿莫西林/克拉維酸的耐藥率均超過50%，上述抗生素已不適宜經(jīng)驗(yàn)用藥。雖然第三、四代頭孢菌素的敏感率都在80%以上，但從逐年耐藥率數(shù)據(jù)可見，敏感率在逐年下降，因此該類藥物在臨床應(yīng)用應(yīng)該謹(jǐn)慎，以避免耐藥率的進(jìn)一步上升。近年來，嗜血桿菌的產(chǎn)酶率在不斷上升，本研究中發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌的β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)酶率隨著細(xì)菌檢出率的逐年增高也在不斷增高，流感嗜血桿菌由2015年的33.3%到2019年的50%，副流感嗜血桿菌則由2015年的28.6%到2019年的54.8%，直接導(dǎo)致該菌屬細(xì)菌對氨芐西林的耐藥率不斷上升，已達(dá)到或超過75%。對氨芐西林的耐藥率上升與β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)酶率上升具有一致性，說明我院兒科檢出的嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。近年來，在嗜血桿菌產(chǎn)酶率不斷增高的同時，β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥流感嗜血桿菌（β-lactamase-negative ampicillin-resistant Haemophilus influenzae, BLNAR）的檢出率也在增高，給臨床治療帶來困難。在本研究中BLNAR 檢出率為25.6%( 22 /86)，β-內(nèi)酰胺酶陰性耐氨芐西林副流感嗜血桿菌檢出率為19.3%( 23 /119)，這已經(jīng)明顯高于蔡淑梅等[7]2015年報道的數(shù)據(jù)，可見嗜血桿菌屬細(xì)菌的耐藥形勢越來越嚴(yán)峻。

流感嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，主要是被細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶分解而失活[8]。其中由質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM-1 型酶較多見，而ROB-1型酶較為少見[9]。BLNAR 的耐藥機(jī)制主要是由于細(xì)菌細(xì)胞膜表面的青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）發(fā)生點(diǎn)突變或基因重組[10]，導(dǎo)致對β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力降低而引起耐藥。另外，細(xì)菌外膜孔蛋白數(shù)量和特性的改變導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性下降[11]，藥物無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用也會產(chǎn)生耐藥，這種耐藥可與β-內(nèi)酰胺酶協(xié)同作用，并具有多重耐藥性。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)基因突變在嗜血桿菌對多種抗生素的耐藥中起到重要作用，如基因acrR 編碼的外排泵AcrAB 對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制中具有重要作用[12]；floA 基因突變引起流感嗜血桿菌對甲氧芐氨嘧啶的耐藥性[13]，而對磺胺的耐藥性是由染色體編碼在SulA 類似物中的基因突變引起[14]；tet（B）基因編碼的外排泵系統(tǒng)及產(chǎn)生核糖體保護(hù)蛋白或染色體突變導(dǎo)致外膜通透性下降與四環(huán)素的耐藥機(jī)制密切相關(guān)[15]；cat 基因編碼的質(zhì)粒介導(dǎo)的氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶引起嗜血桿菌對氯霉素的耐藥[16]等等。

綜上所述，流感嗜血桿菌仍是兒童呼吸道感染的主要致病菌，各個地區(qū)其檢出率和耐藥率均呈逐年升高趨勢，因此必須在全國范圍內(nèi)提高對嗜血桿菌的分離培養(yǎng)、鑒定和藥敏的重視，根據(jù)藥敏試驗(yàn)的數(shù)據(jù)有針對性地合理應(yīng)用抗生素才是減緩細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵。