基于QuEChERS方法的鴨蛋獸藥殘留快速檢測方法的構(gòu)建

張珊，李述剛，黃小波，韓玲鈺，周彬，褚上*

1. 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，菲利普斯親水膠體研究中心（武漢 430068）；2. 長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院（長沙 410004）

我國是鴨蛋生產(chǎn)大國和消費(fèi)大國，且湖北省地處長江中下游，江河縱橫，湖泊星羅棋布，水資源豐富，是著名的水禽生產(chǎn)大省。為防止禽類疫病發(fā)生，獸藥被廣泛應(yīng)用于家畜飼養(yǎng)系統(tǒng)，用于治療不同的疾病以及促進(jìn)動(dòng)物生長[1-2]。由于經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，養(yǎng)殖戶往往濫用各種抗生素，鴨蛋中獸藥殘留超標(biāo)的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[3-4]。獸藥是現(xiàn)代畜牧業(yè)中不可缺少的重要組成部分，如鴨蛋獸藥殘留是指鴨在應(yīng)用獸藥（包括藥物添加劑）后，蓄積或儲(chǔ)存在細(xì)胞、組織或器官內(nèi)，或進(jìn)入鴨蛋中的藥物原型及其有毒理學(xué)意義的代謝物和藥物雜質(zhì)。獸藥和農(nóng)藥等有機(jī)污染物具有持久性，而且有一定致癌性和誘導(dǎo)有機(jī)體突變的性質(zhì)，所以備受民眾的關(guān)注。在這種形勢(shì)下，建立快速、靈敏的鴨蛋藥物殘留檢測方法對(duì)于保護(hù)人類健康、促進(jìn)蛋鴨養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有極其重要的意義。

近年來，在獸殘檢測的相關(guān)文獻(xiàn)中，前處理方法主要有固-液萃取法[5]、固相萃取法[6]、基質(zhì)固相分散技術(shù)[7]和QuEChERS[8]等，檢測技術(shù)有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法[9]。QuEChERS方法是近年來發(fā)展起來的樣品前處理技術(shù)，具有快速、簡易、環(huán)保、價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)具備了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的樣品具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、分離能力強(qiáng)以及能提供分子量和結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前檢測獸藥殘留的重要手段[10]。此次試驗(yàn)采用QuEChERS法處理樣品，同時(shí)測定蛋類樣品中4種大環(huán)內(nèi)酯類和4種喹諾酮類獸藥，與其他方法相比，此次試驗(yàn)所建方法操作更為簡單、快速，適用于蛋類樣品中獸藥殘留的高通量快速分析[11]。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

新鮮散養(yǎng)鴨蛋（市售）；Bond Elut dSPE Enhanced Matrix Removal（EMR）-Lipid（產(chǎn)品號(hào)5982-1010）；Bond Elut EMR-Lipid Polish Pouch，anhydrous MgSO4only（產(chǎn)品號(hào)5982-0102）。

水（質(zhì)譜醇）、乙腈（質(zhì)譜醇、色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（質(zhì)譜醇、色譜純）、醋酸銨（分析純）、二甲亞砜（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品、環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品、洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品、紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品、替米考星標(biāo)準(zhǔn)品、吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品、泰樂霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于98%）：德國Ehrenstorfer Gmb H公司；5%甲酸乙腈溶液、200 mmol/L醋酸銨水溶液、5 mmol/L醋酸銨水溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent-6460三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：安捷倫（美國）科技有限公司；1290在線過濾器：安捷倫（美國）科技有限公司；TGL-16M離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；DXF-02C100 g均質(zhì)機(jī)（廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司）；TYXHII旋渦振蕩儀（上海左樂儀器設(shè)備有限公司）；NDK-12W氮吹儀（冠森生物科技有限公司）；DXF-02C100 g均質(zhì)機(jī)（廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司）；TS-1200超聲波儀：天實(shí)中美（北京）科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

精確稱取5 g（精確至0.01 g）鴨蛋液，放入離心管（50 mL）中，參照添加相應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，先加入10.0 mL的5%甲酸乙腈提取液，再加入2粒陶瓷均質(zhì)子，渦旋（2 000 r/min）混勻5 min，然后離心5 min（4 000 r/min）。移取3.0 mL的5 mmol/L醋酸銨水溶液到15 mL EMR-Lipid dSPE管中，快速振搖并渦旋2 min（2 000 r/min），再移取7.0 mL離心后上層提取液到經(jīng)過活化SPE管中，快速振搖并渦旋2 min（2 000 r/min），再離心5 min（4 000 r/min）。將上層清液全部轉(zhuǎn)移到50.0 mL離心管里，再加入EMR polish粉包和2粒陶瓷均質(zhì)子，快速劇烈振搖并渦旋2 min（2 000 r/min），再離心5 min（4 000 r/min）。移取2 mL上層乙腈液至玻璃試管中，加入0.050 mL DMSO，在40 ℃下氮?dú)鉂饪s至剩余液體約0.050 mL（～35 min），向試管中加入0.950 mL 15%乙腈-水溶液，渦旋振蕩10 s（2 000 r/min），超聲10 s，渦旋1 min（2 000 r/min），將復(fù)溶液倒入1.5 mL離心管中，離心2 min（10 000 r/min），移取上層液至進(jìn)樣小瓶中，待分析。

1.3.2 UHPLC-MS/MS條件

流動(dòng)相A，0.2%甲酸-水；流動(dòng)相B，0.2%甲酸-乙腈；色譜柱，ZORBAX Eclipse plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm；P.N.：959759-302）；進(jìn)樣體積15 μL，柱溫控制40 ℃，流速0.5 mL/min，運(yùn)行時(shí)間26 min，后運(yùn)行時(shí)間4 min。其他設(shè)備中，洗液針為95%乙腈-水，洗針時(shí)間至少15 s。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

表2 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的保留時(shí)間與質(zhì)譜條件

表3 喹諾酮類抗生素的保留時(shí)間和色譜-質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 方法學(xué)驗(yàn)證

以加標(biāo)空白潔蛋樣品為分析對(duì)象，考察該方法的基質(zhì)效應(yīng)、加標(biāo)回收率、精密度、線性范圍、LOD和LOQ等指標(biāo)[13]。

利用提取后再添加的方法來評(píng)判樣品組分對(duì)檢測結(jié)果的影響，分別在空白提取液與純?nèi)軇┲刑砑拥葷舛鹊姆治鑫铮O(shè)置5個(gè)濃度水平[14]，分別為1，10，20，50和100 μg/kg，同時(shí)檢測離子的響應(yīng)強(qiáng)度，然后算出二者的相對(duì)比值，以評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)法進(jìn)行定量分析，設(shè)置5個(gè)濃度水平（1，10，20，50和100 μg/kg）。采用目標(biāo)化合物的峰面積與樣品濃度這兩組數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以相關(guān)系數(shù)（R2）評(píng)價(jià)方法的線性范圍。

以不含目標(biāo)化合物的空白潔蛋樣品為檢測對(duì)象，利用標(biāo)準(zhǔn)添加法，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。設(shè)置3個(gè)濃度的添加水平，進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算方法的準(zhǔn)確度與精密度。

采用逐步減少空白樣品中的獸藥標(biāo)準(zhǔn)品添加量來評(píng)價(jià)方法的檢出限與定量限，按信噪比（S/N）的3倍計(jì)算方法檢出限（LOD），按信噪比（S/N）的10倍來計(jì)算其定量限（LOQ）[15,17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)法進(jìn)行定量分析，設(shè)置5個(gè)濃度水平（1，10，20，50和100 μg/kg）。采用目標(biāo)化合物的峰面積與其濃度的線性關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。結(jié)果表明，該方法顯示出良好的線性關(guān)系，各種抗生素的線性方程見表4，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99（說明獸藥峰面積與其濃度存在良好的線性關(guān)系），該方法可用于檢測鴨蛋中的獸藥殘留。

2.2 方法的檢出限與定量限

結(jié)果顯示，在1～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)R2均保持在大于0.99，表明該方法具有優(yōu)良的線性關(guān)系。原料蛋中大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類化合物的檢出限為0.010～0.174 μg/kg，定量限為0.034～0.576 μg/kg，結(jié)果見表4。

表4 部分獸藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.3 方法的回收率與精密度

選擇經(jīng)檢測不含待測目標(biāo)獸藥殘留的空白鴨蛋作為樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度[18]。采用高、中、低三個(gè)濃度添加水平（5，50和100 μg/kg）的4種喹諾酮類化合物和4種大環(huán)內(nèi)酯類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行分析，重復(fù)測定5次，計(jì)算其回收率和精密度[19]。結(jié)果顯示，4種喹諾酮類化合物和4種大環(huán)內(nèi)酯類化合物的加標(biāo)回收率均在70%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜10%（個(gè)別除外）。因此，該方法可以達(dá)到分析實(shí)際樣品所要求的準(zhǔn)確度和精密度。

2.4 實(shí)際樣品的檢測分析

為了驗(yàn)證該方法在實(shí)際樣品中檢測的效果，采集12個(gè)市售新鮮原料蛋樣品，采用該方法對(duì)其獸藥殘留量進(jìn)行檢測，結(jié)果如表6所示。部分產(chǎn)地蛋品中均不同程度被檢測出大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類獸藥，但均在國家獸藥限量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)[20]，同樣也對(duì)人體健康存在著風(fēng)險(xiǎn)。因此，國家和人們應(yīng)該重視起像蛋品等動(dòng)物源性食品的安全問題。

表5 鴨蛋樣品加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

表6 樣品檢測結(jié)果 μg/kg

3 結(jié)論

由于鴨蛋液具有較好的乳化性，且其提取物中含有大量的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，這為分析鴨蛋中藥物殘留帶來很多困難，造成回收試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定的情況。目前國內(nèi)外對(duì)鴨蛋中的大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類藥物的分析方法還尚不完善。此次試驗(yàn)建立了一種基于QuEChERS結(jié)合UHPLC-MS/MS檢測原料鴨蛋中的獸藥殘留新方法，該方法可同時(shí)檢測蛋中大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類等抗生素的獸藥殘留量。該方法具有簡便快捷、節(jié)省試劑、高回收率等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有比較好的靈敏度和重現(xiàn)性，檢出限也低于歐盟規(guī)定的最大殘留量，比較適用于動(dòng)物源性食品中常用大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類藥物的定量和確認(rèn)分析。

該方法的建立，雖然在技術(shù)層面做到了一定的完善和提高，但食品安全工作更有賴于管理層面的嚴(yán)格把關(guān)以及從業(yè)人員的高度自覺和自律。不僅需要在藥物生產(chǎn)、注冊(cè)及流通使用等重點(diǎn)環(huán)節(jié)做好把關(guān)和管理的工作，更需要加強(qiáng)從業(yè)人員自身的法律意識(shí)和技術(shù)技能，同時(shí)需要做好整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈的法律科普與宣傳力度，以實(shí)現(xiàn)動(dòng)物源食品安全的不斷提升，保障產(chǎn)業(yè)良性健康發(fā)展。