金槍魚(yú)骨膠原多肽螯合鈣的制備

周小敏，鄭萬(wàn)源，李澄

浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司（舟山 316000）

金槍魚(yú)為鱸形目（Pereiformes）鯖科（Scombridae），屬大洋洄游魚(yú)類[1]，是世界重要遠(yuǎn)洋捕撈對(duì)象，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)[2]，金槍魚(yú)年捕獲量超6×106t[3]。我國(guó)金槍魚(yú)捕撈量也逐年上升，已形成較為完整的加工產(chǎn)業(yè)鏈。

金槍魚(yú)加工過(guò)程會(huì)產(chǎn)生超總質(zhì)量10%的魚(yú)骨，這類資源通常被丟棄，既浪費(fèi)寶貴資源，又污染環(huán)境。魚(yú)骨富含鈣和膠原蛋白[4]，且同陸生動(dòng)物相比，這類膠原蛋白生物活性更強(qiáng)、抗原性更弱，賦予其良好的生物相容性，可廣泛用于美容、燒傷燙傷等醫(yī)療領(lǐng)域[5-8]。

缺鈣是人類共同的營(yíng)養(yǎng)疾病，在亞洲地區(qū)尤為突出[9-10]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外鈣補(bǔ)充劑包括無(wú)機(jī)鈣和有機(jī)鈣。這兩種鈣源普遍存在吸收率低、易引發(fā)受體機(jī)體紊亂等問(wèn)題[11-13]。而隨著營(yíng)養(yǎng)學(xué)的進(jìn)步，關(guān)于鈣的吸收出現(xiàn)了新的理論[14]，諸多研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)存在獨(dú)特的生物肽轉(zhuǎn)運(yùn)體系，能夠完整吸收金屬和肽的螯合物。在這一理論指導(dǎo)下，諸多學(xué)者通過(guò)螯合技術(shù)制備了鈣螯合肽，在給機(jī)體補(bǔ)充蛋白的同時(shí)，也實(shí)現(xiàn)了礦物元素的高效吸收[15]，給這類副產(chǎn)物的高值化利用提供了借鑒。

研究通過(guò)將下腳料魚(yú)骨經(jīng)酶解脫肉后堿法去脂，干燥成粉；經(jīng)酶解后其酶解液與氯化鈣進(jìn)行螯合制備螯合鈣，通過(guò)正交試驗(yàn)等手段確定金槍魚(yú)骨的最佳酶解工藝和螯合工藝，為金槍魚(yú)骨這類副產(chǎn)物的高值化利用提供借鑒，同時(shí)有望開(kāi)發(fā)一款新型的鈣補(bǔ)充劑。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚(yú)骨由浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司提供；Gly-Gly-Tyr-Arg（Sigma公司）；氫氧化鈉等均為分析純，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上海公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（安捷倫）；ELX808酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰）；Nicolet6700傅里葉紅外光譜（美國(guó)Thermo Nicolet公司）；原子吸收光譜儀（日本島津）；高分辨場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（Tecnai G2 F20S-TWIN，美國(guó)FEI）；納米粒度表面電位分析儀（Nano-ZS90，Malvern英國(guó)馬爾文儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金槍魚(yú)骨粉的制備工藝

將500 g金槍魚(yú)骨下腳料掰開(kāi)成3～4節(jié)的小段，加入10倍體積水，隨后加入1‰胰蛋白酶+1‰風(fēng)味蛋白酶于55 ℃水浴鍋中酶解2 h（攪拌器500 r/min），

滅酶活后用清水將魚(yú)骨沖洗干凈，加入魚(yú)骨量5%的NaOH，于40 ℃水浴中浸泡2 h，清水洗凈后烘干打粉即制得魚(yú)骨粉（過(guò)40目篩）。

1.3.2 金槍魚(yú)骨膠原多肽制備工藝（參見(jiàn)圖1）

圖1 金槍魚(yú)骨膠原多肽制備工藝圖

1.3.3 膠原多肽濃度的測(cè)定[16]

精確量取2.5 mL樣品，加入2.5 mL 10 g/100 mL的三氯乙酸（TCA）后振蕩混合，靜置10 min，離心15 min（4 000 r/min），取上清液至50 mL容量瓶中，以5% TCA定容；量取6.0 mL該溶液于試管中，加入4.0 mL配制好的雙縮脲溶液，混合振蕩后靜置10 min，2 000 r/min離心10 min，取上清液并測(cè)定上清液OD值（540 nm），對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定多肽含量。同時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 螯合試驗(yàn)流程（參見(jiàn)圖2）

圖2 螯合試驗(yàn)流程圖

式中：mb和ma分別表示反應(yīng)前后體系中鈣的質(zhì)量，mg。

1.3.5 膠原多肽分子量的測(cè)定[17]

色譜條件：色譜柱TsK gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流動(dòng)相為乙腈-水-三氟乙酸（30∶70∶0.1，體積比）。

樣品制備：以乙腈為溶劑配制濃度為5.00 mg/mL的樣品，樣品進(jìn)樣前用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾。

標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清蛋白（Mr66430）、RNase A（Mr13700）、抑肽酶（Mr6500）、維生素B12（Mr1355）、慶大霉素（Mr576），將標(biāo)準(zhǔn)品配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種物質(zhì)含量均為5.00 mg/mL。

1.3.6 傅里葉紅外光譜（FT-IR）分析

紅外光譜分析的掃描波長(zhǎng)范圍為4 000～500 cm-1，所得數(shù)據(jù)利用Origin 7.0軟件進(jìn)行處理。

1.3.7 螯合肽投射電鏡表征分析

樣品先進(jìn)行真空冷凍干燥，而后取適量樣品溶解于乙醇中并超聲處理10 min，后用滴管取適量樣品上樣于銅網(wǎng)，待乙醇揮發(fā)后，用透射電鏡對(duì)螯合肽進(jìn)行觀測(cè)并拍照。

1.3.8 螯合肽粒度分析

用純水為溶劑，溶解適量樣品后，利用表面電位分析儀測(cè)定懸浮樣品粒度。

2 結(jié)果與討論

2.1 金槍魚(yú)骨膠原多肽制備最佳酶解條件的確定

金槍魚(yú)骨粉酶解單因素試驗(yàn)的基本條件為料液比1∶3（g/mL）、起始pH 7.0、酶解溫度55 ℃、試驗(yàn)用酶添加比例1∶1、酶解時(shí)長(zhǎng)4 h。各試驗(yàn)因素水平分別為：pH 6.0，6.5，7.0，7.5和8.0；溫度45，50，55，60和65 ℃；酶制劑的復(fù)合比（某蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶質(zhì)量比）1∶3，1∶2，1∶1，2∶1和3∶1。每個(gè)水平重復(fù)2次，結(jié)果取平均值。

2.1.1 水解酶類的確定

表1是不同酶制劑對(duì)骨粉的水解結(jié)果。從表1中可知，胰蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶復(fù)合水解所得的膠原多肽濃度最高且分子量小于4 000 Da膠原多肽占比最大，故綜合選擇第1組即胰蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶（FM）復(fù)合水解金槍魚(yú)骨粉制備骨膠原多肽。

2.1.2 水解起始pH的確定

選用胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶質(zhì)量比1∶1進(jìn)行酶解，繼續(xù)后續(xù)試驗(yàn)，改變起始pH，測(cè)定膠原多肽濃度。

如表2所示，膠原多肽的濃度同pH呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)pH為7.0～7.5時(shí)，膠原多肽濃度最高，而后膠原多肽濃度隨pH增大反而降低。這是由于在較高和較低的pH下，生物活性酶的分子構(gòu)象發(fā)生變化，其催化活性降低[18]；在生物酶的最佳pH條件下，酶的化學(xué)反應(yīng)速度達(dá)到頂峰，反之，pH距離其最佳pH越遠(yuǎn)，催化活性越低。因此選擇pH為7進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

表2 酶解pH對(duì)多肽濃度的影響

2.1.3 胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合比的確定

將胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行表3所示的比例進(jìn)行復(fù)合酶解，測(cè)定膠原多肽濃度。如表3所示，胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)配比2∶1時(shí)，多肽濃度最高，隨著風(fēng)味蛋白酶比例增多，多肽濃度降低，因此選擇復(fù)配比2∶1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表3 生物酶比例對(duì)多肽濃度的影響

2.1.4 酶解溫度的確定

不同酶解溫度得到的膠原多肽濃度也不同，分別在表4所示溫度下進(jìn)行酶解，測(cè)定膠原多肽濃度。

如表4所示，隨著溫度的升高，膠原多肽濃度隨之升高，60 ℃時(shí)多肽濃度最高，這是因?yàn)闇囟纫彩怯绊懨富钚缘闹匾蛩?，溫度過(guò)高同樣會(huì)影響酶的空間構(gòu)象，進(jìn)而影響酶的生物催化能力，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成酶的失活。因此選擇60 ℃進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

綜上所述，金槍魚(yú)骨粉酶解的最適條件為：料液比1∶3（g/mL）、起始pH 7.0、酶解溫度60 ℃、2種酶復(fù)配比2∶1、酶解時(shí)間4 h。

2.2 最佳螯合條件的確定

骨膠原多肽與氯化鈣螯合的單因素試驗(yàn)的基本條件為：溫度50 ℃、螯合時(shí)間40 min、pH 6.0、膠原蛋白與氯化鈣質(zhì)量比1∶1。改變其中1個(gè)條件，固定其他條件以分析各單因素對(duì)螯合率的影響。各因素水平為：溫度40，45，50，55和60 ℃；螯合時(shí)間30，40，50和60 min；pH 5.0，5.5，6.0，6.5和7.0；質(zhì)量比3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3。每個(gè)水平重復(fù)2次，結(jié)果取平均值。

2.2.1 螯合溫度對(duì)螯合率的影響

螯合率結(jié)果如表5所示。螯合率同溫度呈較為典型的峰狀，以55 ℃為反應(yīng)峰值，低于該溫度時(shí)，螯合率隨溫度上升而增加，高于該溫度時(shí)，螯合率隨溫度增加而降低，表明溫度過(guò)高不利于螯合物的形成。由此確定55 ℃為最適螯合溫度。

表4 酶解溫度對(duì)多肽濃度的影響

表5 螯合溫度對(duì)螯合率的影響

2.2.2 螯合時(shí)間對(duì)螯合率的影響

改變螯合時(shí)間，測(cè)定螯合率，結(jié)果如表6所示。螯合率隨螯合時(shí)間增加而增加，當(dāng)40 min后螯合率達(dá)到最大且保持穩(wěn)定，表明40 min為最佳螯合時(shí)間。有研究表明：反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而會(huì)導(dǎo)致螯合物釋放礦物元素，發(fā)生解螯合效應(yīng)[22-23]，故螯合時(shí)間不應(yīng)過(guò)長(zhǎng)。由此確定反應(yīng)時(shí)間為40 min。

表6 螯合時(shí)間對(duì)螯合率的影響

2.2.3 起始pH對(duì)螯合率的影響

反應(yīng)起始pH對(duì)螯合率的影響如表7所示。隨著pH的增加，螯合率也隨之增加，在pH為6.0時(shí)螯合率達(dá)到最大，隨后螯合率反而下降。這是由于在pH較低條件下，氫離子同鈣離子存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，搶奪供電基團(tuán)，阻礙螯合肽形成[24]，反之，當(dāng)pH較高時(shí)，溶液中羥基基團(tuán)又會(huì)形成不溶的氫氧化鈣[25]。由此確定pH 6.0為最適pH。

2.2.4 肽鈣比對(duì)螯合率的影響

螯合反應(yīng)所加入的膠原多肽與氯化鈣質(zhì)量比對(duì)螯合率有顯著影響。如表8所示，隨著肽鈣比的增加，螯合率也隨之增加，當(dāng)肽鈣比為1∶1時(shí)螯合率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加肽鈣比，螯合率不再增加。這是由于配位比對(duì)螯合率影響較為顯著，不合適的料液比使得螯合物的供體數(shù)量不平衡，造成原料浪費(fèi)，增加成本。由此確定1∶1為最適螯合比例。

表7 起始pH對(duì)螯合率的影響

表8 不同肽鈣比對(duì)螯合率的影響

2.3 螯合肽的透射電鏡結(jié)果

圖3是金槍魚(yú)骨膠原螯合肽在不同倍數(shù)下的透射電鏡圖。從圖3中可知，大多數(shù)螯合肽雖個(gè)體較?。ㄎ⒚准?jí)別），但能清晰分辨。此外，研究還發(fā)現(xiàn)螯合肽的微結(jié)構(gòu)同其分子量相關(guān)（圖4），分子量過(guò)大則難以順利螯合。這可能是由于部分活性肽存在側(cè)鏈，對(duì)螯合具有一定的阻礙效應(yīng)，使得活性肽無(wú)法順利螯合鈣離子。

2.4 螯合肽的粒度分析

圖5是金槍魚(yú)骨膠原螯合肽的粒徑和數(shù)量的關(guān)系。在最佳螯合工藝條件下制備的螯合肽的粒徑分布范圍較窄，大部分螯合肽直徑均低于1 μm，其中90%以上的螯合肽粒徑分布范圍為0.5～0.7 μm；螯合物粒徑是其能否被吸收的關(guān)鍵。研究制備的螯合肽顆粒為微米級(jí)，不僅粒度小，而且具有較強(qiáng)乳化潛力，可完美融入各種食品體系中，賦予其優(yōu)良的加工特性，為其在食品加工中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖3 金槍魚(yú)骨膠原螯合肽在不同倍數(shù)下的透射電鏡圖（分子量約4 000 Da）

圖4 金槍魚(yú)骨膠原螯合肽在不同倍數(shù)下的透射電鏡圖（分子量約10 000 Da）

圖5 螯合肽粒徑與數(shù)量的關(guān)系

3 結(jié)論

結(jié)果顯示，金槍魚(yú)骨粉最佳酶解條件為：胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合比2∶1、pH 7.0、溫度60 ℃。此時(shí)酶解魚(yú)骨粉所得的膠原多肽含量最高。最佳螯合條件為：pH 6.0、螯合溫度55 ℃、螯合時(shí)間40 min、膠原多肽與氯化鈣質(zhì)量比1∶1。此時(shí)螯合率最高，膠原多肽利用率也最高；此條件下制備的金槍魚(yú)骨膠原螯合肽呈均勻的顆粒狀分布，粒徑分布范圍0.5～0.7 μm，賦予其良好的食品加工特性。