誘導痰細胞分類檢查技術及應用

陳華萍 王 子 李 瑾 徐 智 李 琦 王關嵩 張君國

誘導痰細胞分類檢查在我國已有10余年的發(fā)展，在疾病的診斷、治療和預后中均發(fā)揮了重要的作用。但目前，由于其操作流程在國際上尚無統(tǒng)一標準，阻礙了該項目廣泛的開展，一定程度上也限制了該技術的發(fā)展。因此，本文結合自己的工作經驗，從方法學的角度對該項技術的檢測方法、應用等方面進行詳細的闡述，以期為后續(xù)開展的單位提供參考。

一、概述

誘導痰細胞分類，即通過高滲鹽水霧化誘導患者咳痰，并檢測痰中各類細胞，嗜酸性粒細胞(Eos)、中性粒細胞(Neu)、淋巴細胞(Lym)、單核-巨噬細胞(Mac)百分比。既往的研究表明，自然咳痰和誘導痰兩者結果并無統(tǒng)計學差異，所以痰誘導過程針對不能自然咳出痰的患者[1]。在我們前期的研究中已證實誘導痰細胞檢查結果與FeNO值呈正相關(r=0.701)，表明二者在臨床診治中可以相互驗證[2]。

二、誘導痰細胞分類檢查的操作方法

1.檢查所用器材和試劑包括：光學顯微鏡、電熱恒溫水浴鍋、烤片機、離心機、電子天平、瑞氏-姬姆薩染液。

2.操作流程：誘導痰細胞分類雖在國內不同醫(yī)院采用的方法均有不同，導致參考值間會出現(xiàn)一些差異，但總體趨勢一致，均能反應患者痰中的真實水平。我院采用瑞氏-姬姆薩復合染液染色方法，有操作過程簡潔，染色時間短，使患者盡早拿到結果的優(yōu)點。具體操作步驟如下：(1)利用3%～5%的高滲鹽水對不能咳出痰液的患者進行霧化誘導咳痰；(2)待患者咳出痰液后，挑取粘稠或有痰栓的部分于4 ml的EP管內進行稱量，然后加入0.1% DTT于4 ml刻度線；(3)將盛有痰液的EP放置于37 ℃的水浴鍋內進行消化，期間不間斷搖勻EP；(4)待痰液完全消化后，吸取10 μl痰細胞懸液充池于牛鮑計數(shù)板內，靜止3～5 min，鏡下計算計數(shù)板四個角內16個大方格中細胞的平均值；(5)將剩余細胞懸液進行離心，2 000 r/min，5 min，離心后直接涂片；(6)將涂片烤干后進行瑞氏-姬姆薩染色3 min，沖洗染液后烤干涂片；(7)油鏡下計數(shù)各類200個白細胞，并計算各類白細胞所占的百分比，流程見圖1。

圖1 誘導痰細胞檢查操作流程

3.注意事項

(1)對于霧化時間已延長但仍不能誘導出痰的患者，建議放棄此次檢查，以免引起患者氣道高反應；(2)為確保納入檢查的痰標本合格，重量以大于0.5 g為宜，若痰質量較好(粘稠)，稍小于0.5 g亦可；(3)痰消化時間以小于30 min為宜，消化期間不斷搖勻使消化完全；(4)染色時，將A與B液加入后混勻，時間夏季適當縮短，冬季適當延長，延長時間控制在2 min以內；(5)染色液儲存需密封，否則空氣中CO2會影響染液pH值，最終將會影響染色效果。

三、誘導痰細胞分類檢查的細胞形態(tài)

痰中的細胞形態(tài)跟血液中的細胞形態(tài)相似，判斷標準也相同，但是痰中細胞體積個體差異較大，且形態(tài)結構并無血液中那么清晰，所以辨認時需格外注意。

圖2 誘導痰細胞鏡下細胞形態(tài)(A：100×，BCD：1 000×)；注：Eos：嗜酸性粒細胞；Neu：中性粒細胞；Lym：淋巴細胞；Mac：巨噬細胞

2.嗜酸性粒細胞：細胞呈圓形，直徑13～15 μm，大小胞質內充滿粗大、均勻的紅色顆粒，由于細胞漿內大量嗜酸性顆粒的覆蓋，常導致細胞核染色較淺，核結構不清，同時嗜酸性粒細胞亦容易破碎，常分散于細胞核周圍，見圖2B。

3.中性粒細胞：中性粒細胞呈圓形，直徑10～12 μm，胞質常染為淡紅色，細胞質內顆粒較?。患毎顺史秩~狀，以三葉多見，見圖2C。

4.淋巴細胞：淋巴細胞呈圓形，直徑6～9 μm，細胞質量很少，細胞質內無顆粒；細胞核染為藍色，由于胞質較少鏡下形似裸核，見圖2D。

5.巨噬細胞：巨噬細胞源自于單核細胞系統(tǒng)，細胞呈圓形，體積其他相對較大，且體積差異亦較大。細胞質含量豐富，具有較強的吞噬功能，多數(shù)細胞胞質內含有大量的吞噬顆粒，故細胞質染色較深；細胞核相對較大，且大小不一，核內結構不清，見圖2E。

6.常見疾病誘導痰細胞分類圖像

四、誘導痰細胞分類檢查的參考值，見圖3

圖3 常見疾病誘導痰檢測(400×)；注：A：正常；B：嗜酸性細胞性胸膜炎；C：哮喘；D：COPD

目前，該檢查國內外尚無統(tǒng)一的參考值，但國內外研究結果相似，痰中非上皮細胞主要以中性粒細胞和吞噬細胞為主，其次為淋巴細胞和嗜酸性粒細胞。在我國不同城市相繼建立了本地區(qū)的正常范圍，我們前期也建立了重慶地區(qū)參考值[3]，結果見表2。

表2 重慶地區(qū)誘導痰細胞檢查參考值

五、誘導痰細胞分類檢查的應用

誘導痰細胞分類可評價機體嗜酸性細胞炎癥和中性細胞炎癥，特別是在肺部疾病的診治中其敏感性和特異性高于血液中細胞分類，其在呼吸系統(tǒng)常見疾病中的應用如下。

1.在支氣管哮喘中的應用：目前哮喘的診斷主要依據患者的臨床表現(xiàn)、體征，結合患者肺功能檢查進行確診，誘導痰細胞檢查尚未作為哮喘診斷的常規(guī)項目，但已知多數(shù)支氣管哮喘(哮喘)患者誘導痰中嗜酸性粒細胞比例增高[4]，且與哮喘癥狀相關，在我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，哮喘患者中83.7%的患者誘導痰中嗜酸性粒細胞比例升高[5]，故當患者肺功能檢查不能完全配合時，可參考誘導痰細胞檢查結果進行輔助診斷。在哮喘患者抗炎治療后其誘導痰中嗜酸粒細胞比例顯著減少，與氣道阻塞和氣道高反應性成正相關，且比血清中ECP能更準確和靈敏地反映哮喘患者的氣道炎癥水平，因此誘導痰細胞檢查是評價哮喘氣道炎癥的重要指標[6]。研究證實對于誘導痰中嗜酸性粒細胞百分比>3%的患者，對激素治療反應較好，臨床癥狀會得到很好地控制，肺功能也會很快得到改善[7-8]。因此，誘導痰細胞分類檢查可對哮喘患者治療過程中氣道炎癥動態(tài)變化進行檢測，幫助判斷治療效果和調整治療方案，并對進行長期優(yōu)化管理和預后進行評估。在我們前期研究還發(fā)現(xiàn)，在一部分哮喘患者經吸入激素治療以后，誘導痰中嗜酸性粒細胞顯著減少，同時其細胞表型發(fā)生了變化，這表明誘導痰細胞分類既可作為激素治療反應性的敏感指標，還可為哮喘的機制研究提供新的方向[9]。

誘導痰細胞分類除了可以輔助診斷哮喘和指導治療哮喘外，還可對哮喘進行細胞分型。目前，根據誘導痰中嗜酸性粒細胞增高與否，可先將哮喘分為四種炎癥表型：嗜酸性粒細胞型(單純嗜酸性粒細胞百分比≥1%)、中性粒細胞型(中性粒細胞百分比≥61%)、混合細胞型(嗜酸性粒細胞百分比≥1%且中性粒細胞百分比≥61%)、寡細胞型(嗜酸性粒細胞百分比<1%且中性粒細胞百分比<61%)[10-11]。不同的炎性表型相應的治療策略亦有差異，如嗜酸性粒細胞型多為典型哮喘，對激素治療較敏感；中性粒細胞型患者常合并呼吸道感染等因素，對激素的治療反應較差；混合細胞型多見于難治性哮喘或哮喘嚴重發(fā)作者，病情相對較重；寡細胞型多見于病情輕微的哮喘患者，如間歇狀態(tài)哮喘或哮喘得到良好控制者，因此可以根據誘導痰細胞分類，選擇相應的治療方案[12-13]。

2.在COPD中的應用：COPD患者誘導痰中以中性粒細胞性炎癥為主，既往研究表明COPD患者氣道中中性粒細胞浸潤程度達到70%以上，且患者氣道阻塞其嚴重程度與痰中性粒細胞的百分比成正比[14]。但約20%～40%的COPD患者仍存在嗜酸性粒細胞性炎癥，這與COPD患者發(fā)生急性加重嚴重程度、頻率、病死率密切相關，所以誘導痰也是判斷COPD氣道炎癥類型的重要工具[15-19]。此外，誘導痰細胞計數(shù)在COPD治療上也有一定幫助，研究顯示COPD患者痰中浸潤Eos，對糖皮質激素有較好的反應性，提示可用激素治療改善癥狀[20]；若痰中主要浸潤中性粒細胞，提示患者有感染，可采用抗菌治療[21]。

3.在慢性咳嗽中的應用：在我國慢性咳嗽主要分為五類：上氣道咳嗽綜合征(up-airway cough syndrome, UACS)、咳嗽變異性哮喘(cough variance asthma, CVA)、嗜酸性粒細胞性支氣管炎(eosinophil bronchitis, EB)、胃食管反流性咳嗽(gastroesophageal reflux cough, GERC)、變應性咳嗽(atopic cough, AC)，誘導痰細胞分類檢查在慢性咳嗽的診斷和治療中均有重要的作用[22]。在2015版《咳嗽的診斷與治療指南》中，已將該檢查已作為慢性咳嗽的常規(guī)檢查方法。CVA時，嗜酸粒細胞浸潤為其關鍵特征之一，較FeNO和血清ECP能更靈敏、直接、客觀地反映氣道炎癥狀態(tài)[23]。文獻報道，CVA中近90%的患者痰中嗜酸性粒細胞顯著的增高，這與我們既往的研究結果相一致[5,24-25]，對CVA具有一定輔助診斷作用。在CVA的治療上，可依據誘導痰檢查判斷CVA患者是否應該接受激素治療、治療劑量如何，為CVA的早期治療提供的治療方向。在EB時，由于缺乏特征性臨床改變，氣道嗜酸性粒細胞炎癥為其主要特征，故痰中嗜酸性粒細胞增高為其主要診斷依據，即當排除其他慢性咳嗽，若痰中嗜酸性粒細胞百分比>2.5%，可診斷為EB[26]。

4.其他疾?。撼松鲜龀Ｒ姷臍獾姥装Y性疾病以外，誘導痰細胞分類在其他肺部疾病中，也有指導意義。在慢性阻塞性肺疾病-支氣管哮喘重疊綜合征(ACOS)中，患者氣道炎癥主要由中性粒細胞和嗜酸性粒細胞介導，痰中性粒細胞與嗜酸性粒細胞比例均明顯增高，研究表明誘導痰細胞分類計數(shù)對其診斷的特異性達80%，故誘導痰細胞分類檢查可輔助ACOS的診斷[27-28]。在間質性肺疾病(interstitial lung disease, ILD)中，支氣管肺泡灌液(bronchoalveolar lavage, BALF)在ILD臨床診治中有較廣泛的應用，但由于其具有極大的創(chuàng)傷性一定程度上限制了其應用，而誘導痰與BALF具有較好的相關性，因此，誘導痰細胞分類也可為ILD的發(fā)病機制、臨床診斷、活動性評估以及預后判斷等方面提供重要價值[29]。變應性鼻炎時，嗜酸性粒細胞通過釋放炎癥介質抑制自身凋亡，同時活化血管內皮細胞，進而促進炎癥細胞趨化和移行，參與變應性鼻炎氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展，可見，誘導痰細胞分類檢查也可用來評價變應性鼻炎的氣道炎癥和氣道高反應情況[30]。近來研究顯示，在社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia, CAP)時，嗜酸性粒細胞可參與機體對細菌感染的免疫反應，CAP患者肺炎鏈球菌水平與痰中嗜酸性粒細胞百分比呈明顯的負相關，認為痰中嗜酸性粒細胞在呼吸道感染高危人群中具有重要的預測價值[31-32]。