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    循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中不同濾料生物掛膜水處理效果及微生物群落分析

    2020-07-24 09:49:12章霞徐志進柳敏海李偉業(yè)殷小龍
    大連海洋大學(xué)學(xué)報 2020年4期
    關(guān)鍵詞:電氣石濾料菌門

    章霞,徐志進,柳敏海,李偉業(yè),殷小龍

    (浙江省舟山市水產(chǎn)研究所,浙江 舟山 316000)

    近年來,中國工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖發(fā)展迅猛,其中,生物濾料是循環(huán)水水處理設(shè)施的重要組成部分[1-2]。生物濾料按形態(tài)分可分為顆粒濾料和纖維濾料[3];按材質(zhì)可分為天然生物濾料、有機高分子濾料、無機濾料和納米材料等[4-5];按密度可分為浮性濾料、沉性濾料和懸浮性濾料等[6-7]。濾料性質(zhì)是影響生物掛膜、水處理效果和系統(tǒng)微生物多樣性的重要原因。研究表明,高通量測序技術(shù)的發(fā)展可更深入分析濾料系統(tǒng)對微生物的多樣性影響[8-9]。張海耿等[10]研究發(fā)現(xiàn),在濾器正常運行時,上層區(qū)域的優(yōu)勢細(xì)菌主要有厭氧繩菌科、硝化螺旋菌屬、暖繩菌科、黃桿菌科和紅桿菌科,底層區(qū)域的優(yōu)勢細(xì)菌主要有微絲菌屬、硝化螺旋菌屬、Defluviimonas屬、Muricauda屬等;陳重軍等[11]研究表明,厭氧氨氧化反應(yīng)器中脫氮微生物多樣性較為豐富,變形菌門Proteobacteria占11.66%~20.28%,浮霉菌門Planctomycetes占2.18%~7.94%,硝化螺旋菌門Nitrospirae占0.19%~6.30%,可見各個運行條件下系統(tǒng)中的微生物多樣性存在差異。聚苯乙烯泡沫濾珠(EPS)、聚乙烯環(huán)(PE)具有質(zhì)量輕、比表面積大、吸附能力強、不易破碎的特點[12-13],電氣石(Tourmaline)具有吸附水中雜質(zhì)、降低COD、調(diào)節(jié)水pH和氧化還原電位的特點[14]。目前,這3種濾料均已應(yīng)用于造紙廠污水、化工廠排放水或水產(chǎn)養(yǎng)殖循環(huán)水等水處理中。本研究中,采用電氣石球、聚乙烯環(huán)、聚苯乙烯泡沫濾珠3種濾料開展了模擬水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水掛膜和水處理效果的研究,并結(jié)合掛膜后水體中微生物多樣性的變化,研究了不同濾料系統(tǒng)中的微生物功能特點,旨在為工廠化水產(chǎn)養(yǎng)殖的水處理提供技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    生物濾料設(shè)聚乙烯環(huán)(PE)、聚苯乙烯泡沫濾珠(EPS)和電氣石球組(T),每組用PVC桶組裝成各3套簡易的循環(huán)水系統(tǒng),上部為40 L的濾料桶(直徑25 cm,高81.6 cm),其中裝有20 L濾料,下部為蓄水桶(直徑100 cm,高70 cm),盛放水體400 L,通過水泵(流量2600 L/h)實現(xiàn)下進水上出水循環(huán),其中濾料與水體體積的比為1∶20。濾料圖和水處理裝置如圖1、圖2所示。

    圖1 不同濾料Fig.1 Different filter materials used in the experiment

    圖2 試驗運行示意圖Fig.2 Operation schematic diagram in the trial

    1.2 方法

    1.2.2 掛膜濾料電鏡觀察 取掛膜好的濾料進行叔丁醇脫水固定、真空冷凍機干燥,噴金后采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本Hitachi s4800型)觀察PE的側(cè)切面及EPS、電氣石球表面。

    1.2.3 掛膜成功后水體和濾料表面微生物多樣性檢測

    (1)水中微生物取樣。掛膜成功后,從每個桶各取水樣2 L,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,每組混合為1個樣本,樣本分別記為聚乙烯環(huán)水體(PEw)、泡沫濾珠水體(EPSw)和電氣石球水體(Tw)。

    (2)濾料表面微生物取樣。掛膜成功后,從每個桶取約50 mL待檢測生物膜填料,用PBS緩沖液(0.1 mol/L)清洗3遍去除生物膜表面附著雜質(zhì),再將填料置于50 mL離心管中,加入25 mL PBS緩沖液(0.1 mol/L)和適量550 ℃下灼燒2 h后的細(xì)砂(粒徑<420 μm),蓋好蓋后將離心管在渦旋振蕩器中旋轉(zhuǎn)振蕩5 min(務(wù)必使細(xì)砂與填料達(dá)到充分接觸的狀態(tài)),此過程中細(xì)砂與填料表面的碰撞與摩擦可以刮下填料細(xì)微結(jié)構(gòu)部分的生物膜,略沉淀,用0.22 μm濾膜過濾并取出填料,每組混合為1個樣本。樣本名稱分別記為聚乙烯環(huán)(PE)、泡沫濾珠(EPS)、電氣石球(T)。

    (3)DNA提取及擴增測序分析。采用DNeasy PowerSoil Kit(50) (MoBio)提取DNA,并采用引物進行16S rDNA V4高可變區(qū)的PCR擴增。本試驗中采用帶GC夾細(xì)菌通用引物341 F(5′CCTACGGGAGGCAGCAG 3′)和534 R(5′ ATTACCGCGGCTGCTGG 3′)進行細(xì)菌基因組DNA的擴增,GC-clamp序列為CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGGG,擴增片段為細(xì)菌16S rDNA的V3~V4可變區(qū)。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為:10×LAPCR buffer(mg2+plus)5 μL,10 mmol/L dNTP 4 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL,50 ng/μL模板DNA 2.0 μL,滅菌去離子水36.5 μL。采用降落PCR模式 touchdown-PCR,反應(yīng)程序為:94 ℃下預(yù)變性5 min,94 ℃下循環(huán)變性30 s,65 ℃下退火復(fù)性30 s,72 ℃下延伸90 s,每個退火溫度降0.5 ℃,共進行20個循環(huán),在此退火溫度下再進行15個循環(huán),最終在72 ℃下延伸5 min,用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

    (4)測序數(shù)據(jù)。由 Illumina Miseq 測序先獲得原始雙端測序數(shù)據(jù),再經(jīng)過去雜、拼接、嵌合體序列處理后獲得較為優(yōu)質(zhì)的序列 valid tags,最后進行OTU分類、系統(tǒng)發(fā)育樹、Alpha 及 Beta 多樣性等分析。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和差異顯著性檢驗,顯著性水平設(shè)為0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同濾料組的掛膜情況

    從圖3可見:在48 d的掛膜過程中,3個濾料組的氨氮濃度呈先升高后降低的趨勢;EPS和PE組在16 d時氨氮濃度開始下降,T組在20 d時氨氮濃度開始下降,3組濾料氨氮濃度下降速率依次為T組>EPS組>PE組,且T組氨氮消除時間比EPS組早4 d,比PE組早8 d。

    圖3 3個水處理組中氨氮含量的變化Fig.3 Changes in ammonia-nitrogen concentration in 3 water treatment groups

    從圖4可見:在12 d內(nèi),各組亞硝酸鹽濃度維持穩(wěn)定;在16~24 d內(nèi),EPS組和PE組的亞硝酸鹽濃度呈逐漸上升的趨勢,在24 d后開始下降;而T組在16~20 d內(nèi)逐漸上升,20 d后開始下降;待亞硝酸鹽濃度下降至最低時,T組所需的時間比EPS組早4 d,比PE組早8 d。

    圖4 3個水處理組中亞硝酸鹽含量的變化Fig.4 Changes in nitrite concentration in 3 water treatment groups

    2.2 掛膜后濾料的電鏡觀察

    在系統(tǒng)運行48 d后,隨機取PE、EPS及T組的生物填料進行電鏡掃描(圖5),結(jié)果顯示:PE在2萬倍顯微鏡下觀察,表面有球菌和桿菌附著;EPS在3萬倍顯微鏡下觀察,表面有大量球菌;電氣石球在1萬倍顯微鏡下觀察,表面有大量球菌和桿狀細(xì)菌??梢?,3種材料均實現(xiàn)了生物掛膜。

    注:M為球狀細(xì)菌;R為桿狀細(xì)菌Note:M, micrococcus; R, rod-shaped bacteria圖5 3種濾料成熟掛膜后的電鏡圖Fig.5 Electronic microscopic image of 3 kinds of filter materials after mature membrane hanging

    2.3 不同濾料組的水處理能力

    2.3.1 不同濾料組的氨氮去除能力 從表1可見:3組濾料中氨氮去除率在前6 h略有降低,在6~12 h時,氨氮有所升高,在12 h后,氨氮去除率開始下降;在18 h時EPS組氨氮的去除率顯著高于其他兩組(P<0.05);T組在30 h時氨氮去除率達(dá)90.80%,PE組在42 h時氨氮去除率達(dá)90.75%,EPS組在54 h時氨氮去除率達(dá)92.23%??梢?,T組的去除效率高于PE組和EPS組;在54~66 h時,T組、PE組的氨氮去除率顯著高于EPS、T組(P<0.05),84~96 h時,各組間的氨氮去除率均無顯著性差異(P>0.05)。

    表1 3種濾料不同時間段氨氮的去除率

    2.3.2 不同濾料組的亞硝酸鹽去除能力 從表2可見:3組濾料中亞硝酸鹽去除率隨時間延長呈現(xiàn)增長趨勢,并在48 h后趨于平衡;在48 h內(nèi),T組的亞硝酸鹽去除率高于PE組(除6 h外),而PE組又高于EPS組;在42 h時,T組的亞硝酸鹽去除率為99.39%,顯著高于PE組和EPS組(P<0.05);在48~96 h后,T組的亞硝酸鹽去除率高于其他兩組(P>0.05),且均維持在99.18%以上。

    表2 3種濾料不同時間段亞硝酸鹽的去除率

    2.4 不同濾料組掛膜成熟后水體和濾料表面微生物多樣性分析

    2.4.1 不同濾料組細(xì)菌豐度及多樣性分析 從表3可見:3組循環(huán)系統(tǒng)水體中和濾料表面的微生物原始序列和有效序列差異不大,通過比較3組樣品的Chao指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)發(fā)現(xiàn),PE組水體中微生物豐富度和群落多樣性均高于其他兩組,EPS組濾料表面的微生物豐富度高于其他兩組,而PE組濾料表面的微生物群落多樣性則高于其他兩組。

    表3 3組水循環(huán)系統(tǒng)中細(xì)菌豐度情況Tab.3 Bacterial abundance in 3 groups of water circulation systems

    2.4.2 樣本的Alpha多樣性指數(shù)分析和物種間相似性分析 從Rank Abundance曲線可以看出樣品所含物種的豐富程度和均勻程度,曲線在橫軸上的長度越寬表示物種組成越豐富,而在縱軸上跨度越小、曲線越平坦表示物種組成均勻程度越高。從圖6可見,水體中PEw的微生物物種組成相比EPSw和Tw較為豐富和均勻,而濾料EPS表面的微生物物種組成相比PE和T濾料較為豐富和均勻。根據(jù)OTU注釋結(jié)果,繪制3個樣本的微生物物種間相似性的雙層聚類圖(Heatmap),包括樣本間聚類關(guān)系樹和物種OTU豐度相似性樹。從圖7可以看出,無論水體中還是濾料表面的微生物組成均為EPS組和T組的相似性較高。

    圖6 3組濾料運行系統(tǒng)細(xì)菌的豐富程度比較Fig.6 Comparison of the abundance of bacteria in 3 filter medium operation systems

    2.4.3 3組濾料運行系統(tǒng)水體細(xì)菌在門、屬分類層面的分布規(guī)律 3組循環(huán)水處理中水體和濾料表面微生物在門分類層面的分布規(guī)律如表4所示,無論水中還是濾料表面,PE組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性較EPS組和T組更為豐富,且豐富度排列前5的細(xì)菌門類大致相同,分別為變形菌門、厚壁菌門、

    表4 3組循環(huán)系統(tǒng)水中及濾料表面細(xì)菌(門)的群落組成相對百分比

    擬桿菌門、放線菌門、硝化螺旋菌門,各組中細(xì)菌豐富度排列順序和種類略有差異。PEw按照菌類豐富度排列前5的分別為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、硝化螺旋菌門;EPSw中分別為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、TM6、放線菌門;Tw中分別為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、Gracilibacteria、硝化螺旋菌門。其中,水體中EPSw和Tw的變形菌門占比均高于PEw,而厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和硝化螺旋菌門占比相較PEw則少;水體中PEw的微生物中存在厚壁菌門、梭桿菌門、芽單胞菌門和Cloacimonetes,而EPSw、Tw中則未檢測到。濾料中,PE中按照菌類豐富度排列前5的分別為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門;EPS中分別為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門、放線菌門;T中分別為變形菌門、硝化螺旋菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門。其中,PE中厚壁菌門、放線菌門占比較其他兩組高;T中硝化螺旋菌門占比高于EPS和PE;EPS、T中變形菌門遠(yuǎn)高于PE。

    注:A為濾料上的微生物;B為水體中的微生物

    從表5可見:水體中細(xì)菌豐富度屬類差異也較大,其中,PEw中按照豐富度排列前5的分別為遠(yuǎn)洋桿菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬、油螺旋菌屬、OM43_clade;EPSw中分別為遠(yuǎn)洋桿菌屬、OM43_clade、油螺旋菌屬、NS5_marine_group、醋桿菌屬;Tw中分別為遠(yuǎn)洋桿菌屬、油螺旋菌屬、OM43_clade、中溫黃桿菌屬和貝塔變形菌屬。

    表5 3組循環(huán)系統(tǒng)水中細(xì)菌(屬)的群落組成相對百分比

    從表6可見:濾料中,PE表面生物膜按照豐富度排列前5的分別為Symbiobacterium、Mobilitalea、尿素芽孢桿菌屬、瘤胃梭菌屬、擬桿菌屬;EPS表面排列前5的分別為貝塔變形菌屬、亞硝化單胞菌屬、硝化螺旋菌屬、Owenweeksia、擬桿菌屬;T表面排列前5的分別為貝塔變形菌屬、亞硝化單胞菌屬、硝化螺旋菌屬、擬桿菌屬、糞桿菌屬。

    表6 3組循環(huán)系統(tǒng)濾料表面細(xì)菌(屬)的群落組成相對百分比

    3 討論

    3.1 不同濾料對掛膜和水處理效果的影響

    生物濾池是循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的核心,對其的研究主要包括生物濾料的選擇[15]、培養(yǎng)[16]、運行條件[17-18]及環(huán)境因子[19]等技術(shù)環(huán)節(jié)。本研究中就濾料的選擇進行了研究,結(jié)果表明,在48 d的掛膜期間,電氣石球組氨氮和亞硝酸鹽消除時間比聚苯乙烯泡沫濾珠組早4 d,比聚乙烯環(huán)組早8 d,可見電氣石球的掛膜速率較聚乙烯環(huán)和聚苯乙烯泡沫濾珠快,這可能是因為電氣石球表面的孔隙、孔洞等有利于生物的附著、固定,且對附著物也有屏障保護作用,水力剪切沖刷作用較少,有利于微生物代謝過程中的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳質(zhì)過程。李義菲等[20]研究表明,電氣石能夠提高氮的去除率,且表現(xiàn)出較好的耐負(fù)荷沖擊能力。韓雅紅等[21]研究表明,電氣石顆粒能夠縮短序批式反應(yīng)器(SBR)的啟動時間,并可快速恢復(fù)反硝化菌、硝化菌、PAOs 及 DPAOs代謝能力。

    此外,本研究中還發(fā)現(xiàn),水處理試驗48 h內(nèi),電氣石球組的氨氮、亞硝酸鹽去除效率高于聚乙烯環(huán)組,而聚乙烯環(huán)組又高于聚苯乙烯泡沫濾珠組,這可能與濾料本身的材質(zhì)特性有關(guān)。Tan等[22]研究表明,添加了電氣石的序批式反應(yīng)器SBR1生物群落相較于未添加電氣石的SBR2更加穩(wěn)定,且隨著氮加載率的升高,SBR1的氨氮去除率和總氮去除率高于SBR2。另有研究表明,電氣石球能調(diào)節(jié)初始pH值為3~10的不同鹽度的海水趨向弱堿性,催化降解有機物,使蒸餾水核磁共振半高幅寬變窄,降低了水分子締合度,具有促進細(xì)菌、細(xì)胞生長和代謝的功能[23-24]。可見,在水處理時間和生物膜穩(wěn)定性上,電氣石的性能均優(yōu)于有機高分子材料(PE、EPS),這使得電氣石球廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水處理工程將成為可能。

    3.2 不同濾料對系統(tǒng)中微生物多樣性的影響

    目前,已有眾多學(xué)者圍繞生物濾池中微生物菌群的組成開展了研究[25-26],旨在了解各個運行條件下的菌群組成及變化規(guī)律。本研究結(jié)果表明,在3組系統(tǒng)中,無論水體還是濾料表面均為聚乙烯環(huán)組微生物群落多樣性高于其他兩組,這說明不同濾料可能因為材質(zhì)、耐沖刷能力、水力特性等性質(zhì)差異造成水環(huán)境中微生物菌群的不一致[27]。而3組系統(tǒng)的水體和濾料表面豐富度排列前5的細(xì)菌門類大致相同,豐富度較高的分別為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和硝化螺旋菌門,這與黃志濤等[9]的研究結(jié)果一致,變形菌門和硝化螺旋菌門均具有重要的脫氮功能。電氣石球組水體中變形桿菌門明顯高于聚乙烯環(huán)組,而濾料中變形桿菌門和硝化螺旋菌門明顯高于聚乙烯環(huán)組和聚苯乙烯泡沫濾珠組,這可能是造成3組系統(tǒng)均具備優(yōu)異水處理能力且電氣石球組水處理效果較其他兩組更佳的原因。另在本研究的水處理效果試驗過程中,3組濾料系統(tǒng)的氨氮去除率在72 h后均能達(dá)到98%以上,亞硝酸鹽的去除率在54 h后均能達(dá)到99%以上,水處理效果皆顯著,且在48 h內(nèi),電氣石球組的氨氮、亞硝酸鹽去除效率均高于其他兩組。在微生物多樣性分析結(jié)果中,3種濾料表面的亞硝化單胞菌屬和硝化螺旋菌屬占比依次為電氣石>聚苯乙烯泡沫濾珠>聚乙烯,與水處理效果相符,這表明海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水處理中,細(xì)菌Nitrosomonas和Nitrospira起主要的硝化作用[28-29],而電氣石可降低亞硝酸鹽氧化菌的相對豐度,提高污水系統(tǒng)中氮的去除率[30]。

    此外本研究中還發(fā)現(xiàn),水體中和濾料表面中的優(yōu)勢菌屬在3組中各不相同,聚乙烯環(huán)組水體擬桿菌屬、乳酸桿菌屬、糞便桿菌屬、亞硝化單胞菌屬占比均高于其他兩組,而濾料中聚乙烯環(huán)組貝塔變形菌屬、亞硝化單胞菌屬均未被檢測到,硝化螺旋菌屬也明顯低于聚苯乙烯泡沫濾珠組和電氣石球組,推測聚乙烯環(huán)組水處理優(yōu)勢菌主要集中的水體中,而聚苯乙烯泡沫濾珠組和電氣石球組水處理優(yōu)勢菌主要集中在濾料表面,更深入和科學(xué)的研究還有待繼續(xù)。

    4 結(jié)論

    (1)不同的濾料對生物掛膜和水處理效果均有顯著的影響。在本試驗中,電氣石球組的掛膜時間短于聚苯乙烯泡沫濾珠組,而聚苯乙烯泡沫濾珠組掛膜時間又短于聚乙烯環(huán)。

    (2)在水處理效果試驗中,48 h內(nèi),氨氮、亞硝酸鹽去除效率依次為電氣石球>聚乙烯環(huán)>聚苯乙烯泡沫濾珠。

    (3)微生物多樣性分析顯示,電氣石球組的水體中變形桿菌門明顯高于聚乙烯環(huán)水體,濾料中變形桿菌門和硝化螺旋菌門顯著高于聚乙烯環(huán)和聚苯乙烯泡沫濾珠。

    (4)生物濾料的處理效果一般綜合其生物膜的掛膜時間長短、水處理效果及濾料上生物膜生長的優(yōu)劣等指標(biāo)進行評價。由此可見,電氣石球作為濾料的處理效果明顯優(yōu)于聚乙烯環(huán)和聚苯乙烯泡沫濾珠。

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