水稻Ossp1基因的亞細(xì)胞定位及其干旱條件下的表達(dá)

騰海艷

摘要：sp1基因是葉綠體蛋白質(zhì)輸入調(diào)控的關(guān)鍵基因，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析、Real time PCR分析、瞬時(shí)表達(dá)分析等方法，對(duì)sp1在水稻中的同源基因Ossp1進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)、組織表達(dá)和干旱響應(yīng)性分析以及亞細(xì)胞定位分析。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，水稻Ossp1基因位于7號(hào)染色體，基因登錄號(hào)為Os07g0647800，序列全長(zhǎng)1 032 bp，SP1蛋白由343個(gè)氨基酸殘基組成，信號(hào)肽序列位于氮端，蛋白質(zhì)分子中有2個(gè)跨膜區(qū)域。Real time PCR分析結(jié)果顯示，Ossp1在水稻葉片中表達(dá)量最高，其次為葉鞘，根中最低，此外，Ossp1在葉片中的表達(dá)具有明顯的干旱響應(yīng)性，受到干旱脅迫誘導(dǎo)后，表達(dá)量顯著提高。采用瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，SP1蛋白定位于水稻葉綠體。上述結(jié)果顯示了Ossp1基因與水稻葉綠體及干旱脅迫響應(yīng)的關(guān)系，為Ossp1基因功能的深入研究提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻;Ossp1基因;亞細(xì)胞定位;干旱脅迫;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）03-0529-06

Subcellular localization and expression under drought conditions of rice Ossp1 gene

TENG Hai-yan

（School of Chemistry and Bioengineering， Yichun University， Yichun 336000， China）

Abstract：The? sp1 is a key gene for the regulation of chloroplast protein import， and Ossp1 is the homologous gene of sp1 in rice. In this study， the structure and function prediction， tissue expression， drought-responsiveness analysis and subcellular localization analysis of Ossp1 were carried out by bioinformatics analysis， realtime PCR analysis and transient expression analysis. The results of bioinformatics analysis showed that Ossp1 was located on chromosome 7（gene accession number： Os07g0647800）， and the sequence was 1 032 bp in length. The SP1 protein was composed of 343 amino acid residues， the signal peptide was located at the N-terminus， and there were two transmembrane regions. The results of real time PCR analysis showed that the expression level of Ossp1 was highest in rice leaves， followed by leaf sheaths， and lowest in roots. In addition， the expression of Ossp1 could be significantly induced by drought stress， showed obvious drought responsiveness. Subcellular localization analysis of SP1 protein was performed by transient expression assay， and the results indicated that the SP1 protein was localized in rice chloroplasts. The above results show the relationship between gene Ossp 1 and rice chloroplast and drought responsiveness， and provide the basis for further research on the function of gene Ossp 1.

Key words：rice;Ossp1;subcellular localization; drought stress;gene expression

植物葉綠體含有大約3 000種蛋白質(zhì)，其中絕大部分由核基因編碼，少數(shù)由葉綠體自身基因組編碼。核基因編碼的葉綠體蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)合成后，經(jīng)葉綠體外膜和內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TOC（Translocon of the outer membrane of chloroplasts）和TIC（Translocon of the inner membrane of chloroplasts）轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體內(nèi)發(fā)揮功能[1-2]。研究結(jié)果[3-4]表明，擬南芥是通過(guò)控制外膜TOC蛋白的降解進(jìn)行葉綠體蛋白輸入調(diào)控的，降解由SP1（Suppressor of ppi1 locus1）、SP2（Suppressor of ppi1 locus2）及CDC48（Cell division cycle 48）蛋白協(xié)作完成，其中，SP1蛋白負(fù)責(zé)催化TOC發(fā)生泛肽化，再由SP2和CDC48介導(dǎo)泛肽化的蛋白質(zhì)由葉綠體外膜回到細(xì)胞質(zhì)，被細(xì)胞質(zhì)中的泛肽-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-proteasome system，UPS）降解，這個(gè)對(duì)TOC蛋白進(jìn)行識(shí)別、泛肽化和降解的機(jī)制稱為葉綠體相關(guān)蛋白降解（Chloroplast-associated protein degradation，CHLORAD）[4]。CHLORAD機(jī)制不僅參與正常生長(zhǎng)條件下的葉綠體蛋白輸入調(diào)控，還與植物的脅迫響應(yīng)有關(guān)。在氧化脅迫條件下，擬南芥通過(guò)提高sp1基因表達(dá)促進(jìn)TOC蛋白降解，從而降低葉綠體蛋白輸入量，減慢葉綠體內(nèi)光反應(yīng)速率和氧氣生成，避免加劇氧化脅迫[5-6]。在擬南芥中過(guò)表達(dá)sp1后，植物的抗逆能力相比野生型明顯增強(qiáng)，而相同條件下的sp1突變體則表現(xiàn)出發(fā)育滯后，抗逆性下降等表型，TOC等蛋白質(zhì)的含量變化與SP1含量也表現(xiàn)出直接相關(guān)性，表明SP1是蛋白質(zhì)由細(xì)胞質(zhì)向葉綠體輸入的重要調(diào)節(jié)因子，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)[4，7]。

sp1在水稻中的同源基因目前尚未見報(bào)道。水稻是中國(guó)最重要的糧食作物之一，也是單子葉植物研究的模式植物，本研究選擇sp1在水稻中的同源基因（命名為Ossp1）作為研究對(duì)象，通過(guò)生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)、干旱響應(yīng)性分析和亞細(xì)胞定位，確定Ossp1基因在水稻基因組的序列信息、組織表達(dá)和干旱響應(yīng)特性及SP1蛋白的亞細(xì)胞定位情況，以期為后續(xù)深入研究該基因的功能和闡明水稻葉綠體蛋白的輸入調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所用水稻（Oryza sativa L.）品種為粳稻品種中花11，試驗(yàn)材料種植于宜春學(xué)院苗圃溫室，常規(guī)管理。

1.2水稻sp1基因（Ossp1）及其編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

參照擬南芥（Arabidopsis thaliana）的sp1基因（AT1G63900）編碼序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列，在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站通過(guò)BLAST功能查找其在水稻基因組中的同源序列。通過(guò)DNAMAN軟件進(jìn)行水稻和擬南芥SP1蛋白氨基酸序列同源性分析。利用SignalP軟件進(jìn)行水稻SP1蛋白信號(hào)肽位置分析，TMHMM軟件進(jìn)行跨膜區(qū)位置預(yù)測(cè)，SOPMA軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.3RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和Ossp1克隆

正常生長(zhǎng)21 d的土培水稻苗，取倒數(shù)第二片葉，平行取樣3份，混合后快速放入液氮中，然后置于-80 ℃冰箱保存，經(jīng)Magen試劑盒提取總RNA，Vazyme反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄后，cDNA產(chǎn)物作為模板，根據(jù)Ossp1的上下游序列設(shè)計(jì)引物（Ossp1-F：5′-ATGTTGATCCCATGGGGCGG-3′，Ossp1-R：5′-TCAATGGCGGAAAGTTCTC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠回收目的條帶，并將回收產(chǎn)物連接至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定后，送生物公司測(cè)序。

1.4水稻植株的栽培和干旱處理

用于組織表達(dá)分析的中花11野生型水稻幼苗，木村營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)至三葉一心，沖洗掉根部營(yíng)養(yǎng)液成分，吸水紙吸干多余水分，每株分別剪下倒數(shù)第二片葉片、葉鞘、根，用于RNA提取和組織表達(dá)分析。

用于干旱處理的中花11野生型水稻幼苗，木村營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)至至一葉一心，栽種于砂土基質(zhì)（砂與水稻種植用土各一半，施加適量尿素）中繼續(xù)生長(zhǎng)至三葉一心（從發(fā)芽起共約21 d），停止供水，開始進(jìn)行干旱處理，至所有葉片完全卷起和葉片全卷后16 h各取樣1次，每次3株，每株剪下倒數(shù)第二片葉后快速放入液氮中，然后置于-80 ℃冰箱保存，用于RNA提取和干旱響應(yīng)性分析。

1.5Real time PCR分析

葉片、葉鞘和根樣品按方法1.3的方法進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物用ddH2O稀釋10倍，作為模板，以O(shè)sActin1（基因登錄號(hào)：Os03g07181000）作為內(nèi)參基因，以未經(jīng)干旱處理的樣品作為對(duì)照，進(jìn)行目的基因的Real-time PCR擴(kuò)增，數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct法[8]，Excel軟件和Sigma Plot軟件進(jìn)行分析和作圖。Real time PCR反應(yīng)體系（10 μl）：2×SYBR mix（TaKaRa） 50 μl，cDNA 10 μl，F(xiàn)、R引物各05 μl，ddH2O 30 μl。Real time PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。Real time PCR擴(kuò)增使用引物：Ossp1-1210-F：5′-ACTTTCCGCCATTGACA-3′;Ossp1-1379-R：5′-TGCTTCGGCGCAATAC-3′;OsActin1-F：5′-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3′;OsActin1-R：5′-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3′。

1.6Ossp1-gfp瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建

以帶有Ossp1編碼序列的pMD-18T載體為模板，擴(kuò)增不含終止密碼子TGA的Ossp1編碼序列（擴(kuò)增引物及酶切位點(diǎn)：Ossp1-Spe I-F：5′-TGACACTAGTATGTTGATCCCATGGGGC-3′;Ossp1-Hind-R：5′-TCAGAAGCTTTAGGCGGAAAGTTCTCAC-3′），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用回收試劑盒回收DNA片段，限制性酶切后，將Ossp1序列連入到pOX載體的35S啟動(dòng)子和gfp序列之間，構(gòu)建p35S-sp1-gfp-nos表達(dá)框。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株，經(jīng)菌液PCR和核酸序列測(cè)定獲得陽(yáng)性克隆。

1.7原生質(zhì)體的分離和瞬時(shí)表達(dá)分析

水稻葉鞘細(xì)胞原生質(zhì)體的分離：取生長(zhǎng)7 d狀態(tài)良好的水稻苗，按Zhang等[9]的方法制備原生質(zhì)體。帶有p35S-sp1-gfp-nos表達(dá)框的質(zhì)粒20 μl（總質(zhì)量10 μg以上），采用PEG介導(dǎo)法[9]轉(zhuǎn)入新鮮制備的水稻原生質(zhì)體，同時(shí)轉(zhuǎn)化帶有p35S-gfp表達(dá)框的質(zhì)粒作為對(duì)照，28 ℃避光孵育18 h，250 g離心5 min，保留沉淀和少許上清，輕輕搖勻，激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss， LSM7 DUO）觀察結(jié)果并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1Ossp1基因堿基序列和SP1蛋白氨基酸序列特征

以擬南芥sp1基因的堿基序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列作為參照，經(jīng)BLAST分析，確定水稻中的同源基因位于7號(hào)染色體，基因登錄號(hào)為Os07g0647800，基因堿基序列全長(zhǎng)1 032 bp。水稻SP1蛋白質(zhì)氨基酸序列由343個(gè)氨基酸殘基組成，與擬南芥SP1氨基酸殘基數(shù)相同。DMAMAN等軟件分析結(jié)果顯示，水稻和擬南芥SP1蛋白的氨基酸序列相似度為7118%，其中靠近羧基端的35個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成RING（Really interesting new gene）型鋅指結(jié)構(gòu)域（圖1A），水稻SP1蛋白共有2個(gè)跨膜區(qū)，一個(gè)位于氨基端，含25個(gè)氨基酸殘基（圖1B，圖1C），為SP1蛋白的信號(hào)肽序列，該信號(hào)肽與擬南芥SP1信號(hào)肽序列基本相同，只有2個(gè)氨基酸殘基差異，推測(cè)SP1蛋白也定位于葉綠體外膜，另一個(gè)跨膜區(qū)域位于第220～250氨基酸殘基處，2個(gè)跨膜區(qū)之間的肽段位于膜外，第二個(gè)跨膜區(qū)后的肽段（羧基端）位于膜內(nèi)側(cè)（圖1C）。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示SP1蛋白中含有多段α螺旋結(jié)構(gòu)，占4227%，其余為無(wú)規(guī)卷曲、伸展性結(jié)構(gòu)以及少量β轉(zhuǎn)角（圖1D），分別占3294%、2012%和466%。

2.2Ossp1基因克隆

根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，在開放讀碼框兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得Ossp1的全長(zhǎng)堿基序列，產(chǎn)物經(jīng)回收和測(cè)序驗(yàn)證，確定該序列與BLAST分析獲得的mRNA序列一致，片段長(zhǎng)度為1 032 bp，電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2。

2.3基因Ossp1的組織表達(dá)和干旱響應(yīng)性分析

野生型水稻幼苗在自然生長(zhǎng)條件下經(jīng)營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)至三葉一心后，取根、葉鞘和倒數(shù)第二片葉片分析基因Ossp1的組織表達(dá)情況。Real time PCR結(jié)果顯示，目的基因在3種組織中的表達(dá)存在差異，在葉片中的表達(dá)水平最高，而在根中表達(dá)水平最低。Ossp1在正常生長(zhǎng)條件下的表達(dá)水平均低于內(nèi)參基因OsActin1，葉中表達(dá)水平為OsActin1的0.27倍，葉鞘和根中的表達(dá)水平分別為OsActin1的011倍和004倍（圖3A）。

在干旱條件下，基因Ossp1的表達(dá)水平顯著提高。干旱處理至所有葉片完全卷葉時(shí)，基因Ossp1的表達(dá)水平接近內(nèi)參基因OsActin1的表達(dá)水平，持續(xù)干旱至卷葉時(shí)間達(dá)到16 h時(shí)，基因Ossp1表達(dá)水平較葉片剛完全卷葉時(shí)有所下降，但相比對(duì)照仍然較高（圖3B）。

2.4Ossp1-gfp載體的構(gòu)建

為確定SP1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，我們以綠色熒光蛋白基因gfp作為報(bào)告基因，構(gòu)建了Ossp1與gfp融合的瞬時(shí)表達(dá)載體。根據(jù)SP1蛋白的信號(hào)肽分析結(jié)果，該蛋白的信號(hào)肽位于氨基端，因此我們構(gòu)建了gfp堿基序列位于Ossp1堿基序列3′端的融合表達(dá)載體（羧基端融合），以防止GFP遮蔽信號(hào)肽而影響定位。經(jīng)序列擴(kuò)增、酶切、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測(cè)序后，獲得Ossp1堿基序列（不含終止密碼子TAG）插入到gfp上游的融合表達(dá)載體陽(yáng)性克隆，載體結(jié)構(gòu)見圖4。

2.5水稻SP1蛋白的亞細(xì)胞定位

為了分析水稻SP1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，用構(gòu)建好的帶有p35S-sp1-gfp-nos表達(dá)框的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻葉鞘原生質(zhì)體，同時(shí)用p35S-gfp-nos質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻葉鞘原生質(zhì)體作為對(duì)照。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，作為對(duì)照的p35S-gfp-nos質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，GFP蛋白全部定位于細(xì)胞質(zhì)，而p35S-sp1-gfp-nos轉(zhuǎn)化后，SP1-GFP融合蛋白出現(xiàn)的區(qū)域與葉綠素自發(fā)熒光區(qū)域完全重合，表明融合蛋白已經(jīng)定位到葉綠體（圖5），可以確定SP1蛋白定位于葉綠體。

3討論

葉綠體是植物最重要的細(xì)胞器之一，是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，此外還涉及植物的氨基酸代謝、脂肪酸代謝和脅迫信號(hào)ROS的產(chǎn)生[10]。葉綠體是半自主性細(xì)胞器，其自身基因組負(fù)責(zé)約100種蛋白質(zhì)的合成，其余絕大多數(shù)蛋白質(zhì)通過(guò)核基因編碼，在細(xì)胞質(zhì)合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體內(nèi)[11]。

在過(guò)去的幾十年里，核基因編碼的蛋白質(zhì)向葉綠體的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程已經(jīng)大致研究清楚。葉綠體的外膜和內(nèi)膜上共結(jié)合有十幾種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，外膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白統(tǒng)稱為TOC，內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白統(tǒng)稱為TIC，兩類蛋白均有多個(gè)成員，這些成員在分子量、分子結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運(yùn)功能方面均有差別[12]。TOC和TIC形成的轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體可以識(shí)別葉綠體蛋白質(zhì)的N端信號(hào)肽，引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入葉綠體，并進(jìn)一步定位到葉綠體基質(zhì)、類囊體膜、類囊體基質(zhì)等部位[13]。

在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，以及對(duì)各種脅迫作出響應(yīng)的過(guò)程中，葉綠體都需要對(duì)其蛋白質(zhì)組及時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)整，以適應(yīng)體內(nèi)體外生理生化條件的變化[14]。一直以來(lái)，盡管人們對(duì)葉綠體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)入機(jī)制已經(jīng)有深入研究，但是，對(duì)葉綠體蛋白質(zhì)輸入調(diào)控的過(guò)程了解較少。最近幾年，Ling等[6-7]陸續(xù)報(bào)道了擬南芥葉綠體蛋白質(zhì)輸入調(diào)控基因sp1的功能，并于2019年報(bào)道了完整的擬南芥葉綠體蛋白質(zhì)輸入調(diào)控機(jī)制，確定植物對(duì)葉綠體蛋白質(zhì)輸入的調(diào)控是通過(guò)控制葉綠體外膜上TOC蛋白的降解實(shí)現(xiàn)的[4]。SP1蛋白對(duì)TOC蛋白的降解具有關(guān)鍵作用，sp1基因表達(dá)量的提高能夠促進(jìn)外膜上TOC數(shù)量的下降，并減少葉綠體蛋白質(zhì)的輸入量[4]。水稻Ossp1基因堿基序列長(zhǎng)度、水稻SP1蛋白多肽鏈的長(zhǎng)度均與擬南芥sp1基因和SP1蛋白相同，2種蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)也具有高度相似性，BLAST分析結(jié)果顯示，Ossp1是水稻基因組中唯一與sp1具有高度相似性的基因，因此，可以確定Ossp1為sp1在水稻中的同源基因。

擬南芥SP1蛋白是泛肽E3連接酶家族成員[15]，并且屬于RING（Really interesting new gene）型E3連接酶，酶分子中均含有RING結(jié)構(gòu)域，這是一種鋅指結(jié)構(gòu)域，與酶分子和其他蛋白質(zhì)的互作功能及泛肽化功能有關(guān)，多數(shù)RING型E3連接酶都參與植物的脅迫響應(yīng)[16-17]。擬南芥sp1基因的表達(dá)可在脅迫誘導(dǎo)下提高，sp1過(guò)表達(dá)植株對(duì)鹽脅迫耐受性高于野生型植株，而sp1突變植株則出現(xiàn)耐受性下降表型，表明該基因不僅參與正常生長(zhǎng)條件下的葉綠體蛋白質(zhì)輸入調(diào)控，還參與植物的逆境脅迫響應(yīng)。本研究通過(guò)序列對(duì)比，確定水稻SP1具有與擬南芥SP1相同的RING結(jié)構(gòu)域，因此可以確定水稻SP1也屬于RING型E3連接酶。轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果表明，Ossp1的表達(dá)具有明顯的干旱響應(yīng)性特征，在干旱條件下，Ossp1的表達(dá)量可以提高到正常條件下的4倍左右，表明該基因參與了水稻的干旱響應(yīng)過(guò)程。此外，根據(jù)亞細(xì)胞定位結(jié)果，結(jié)合信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果，可以確定水稻SP1定位在葉綠體，并且信號(hào)肽位于肽鏈N端，與擬南芥SP1的信號(hào)肽位置和定位相同。

水稻是中國(guó)最重要的糧食作物之一，干旱、高鹽等各類逆境條件對(duì)水稻的生長(zhǎng)和產(chǎn)量影響嚴(yán)重[18-19]。本研究結(jié)果顯示了基因Ossp1與水稻葉綠體及水稻干旱脅迫響應(yīng)之間的關(guān)系，為進(jìn)一步的基因功能研究和揭示水稻葉綠體蛋白質(zhì)輸入調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。目前，我們已經(jīng)通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)開展了Ossp1基因過(guò)量表達(dá)植株和轉(zhuǎn)基因植株的培育，以期通過(guò)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Ossp1基因的功能進(jìn)行更為深入的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]JARVIS P， KESSLER F. Mechanisms of chloroplast protein import in plants[M].New York： Springer， 2014： 241-259.

[2]WATSON S J， SOWDEN R G， JARVIS P. Abiotic stress-induced chloroplast proteome remodelling： a mechanistic overview[J]. Journal of Experimental Botany， 2018， 69（11）： 2773-2781.

[3]LEE S， LEE D W， LEE Y， et al. Heat shock protein cognate 70-4 and an E3 ubiquitin ligase， CHIP， mediate plastid-destined precursor degradation through the ubiquitin-26S proteasome system in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2009， 21（12）：3984-4001.

[4]LING Q， BROAD W， TRSCH R， et al. Ubiquitin-dependent chloroplast-associated protein degradation in plants[J]. Science， 2019， 363（6429）：4467.

[5]KESSLER F. Chloroplast delivery by UPS[J]. Science， 2012， 338（6107）：622-623.

[6]LING Q， WEIHUA H， AMY B， et al. Chloroplast biogenesis is regulated by direct action of the ubiquitin-proteasome system[J]. Communicative & Integrative Biology， 2013， 338（2）：655-659.

[7]LING Q， JARVIS P. Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants[J]. Current Biology， 2015， 25（19）：2527-2534.

[8]SCHMITTGEN T D， LIVAK K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J]. Nat Protoc， 2008， 3（6）：1101-1108.

[9]ZHANG Y， SU J， DUAN S， et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes[J]. Plant Methods， 2011， 7（1）：30.

[10]BOSE J， MUNNS R， SHABALA S， et al. Chloroplast function and ion regulation in plants growing on saline soils： Lessons from halophytes[J]. Journal of Experimental Botany， 2017， 68（12）： 3129-3143.

[11]LEE D W， HWANG I. Evolution and design principles of the diverse chloroplast transit peptides[J]. Molecules & Cells， 2018， 41（3）：161-167.

[12]胥華偉，侯典云. 植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)向葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)的研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào)， 2018， 53（2）： 264-275.

[13]CHOTEWUTMONTRI P， REDDICK L E， MCWILLIAMS D R， et al. Differential transit peptide recognition during preprotein binding and translocation into flowering plant plastids[J]. Plant Cell， 2012， 24（7）：3040-3059.

[14]JARVIS P， LPEZ-JUEZ E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids[J]. Nat Rev Mol Cell Biol， 2013， 14（12）： 787-802.

[15]PAN R， HU J. Sequence and biochemical analysis of Arabidopsis SP1 protein， a regulator of organelle biogenesis[J]. Communicative & Integrative Biology， 2017， 10（4）： e1338991.

[16]LIM S D， YIM W C， MOON J C， et al. A gene family encoding RING finger proteins in rice： their expansion， expression diversity， and co-expressed genes[J]. Plant Mol Biol，2010， 72（4/5）：369-380.

[17]BORJA B， JOSE J， ALBERTO C， et al. ABA inhibits myristoylation and induces shuttling of the RGLG1 E3 ligase to promote nuclear degradation of PP2CA[J]. The Plant Journal， 2019， 98（5）： 813-825.

[18]劉艷，孫文濤，雋英華. 控水對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（4）：53-55.

[19]李婷，朱長(zhǎng)波，李俊偉，等. 海水脅迫對(duì)海稻86種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，49（7）：1297-1303.

（責(zé)任編輯：陳海霞）