年輕Sca-1+骨髓干細(xì)胞對年老小鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖能力的調(diào)控作用及機(jī)制*

董珺， 曾波航， 田朝偉， 莫沛， 劉建衛(wèi)， 熊龍根， 黎佼△

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 1腫瘤科， 2心內(nèi)科(廣東廣州 510260)

我們前期的研究表明：通過年輕小鼠骨髓細(xì)胞重建年老小鼠骨髓，可再生心肌梗死后年老小鼠心臟功能。年輕骨髓細(xì)胞可以通過旁分泌等分子機(jī)制增加年老小鼠心肌梗死后細(xì)胞存活，促進(jìn)細(xì)胞增殖以及血管再生[1]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Sca-1+骨髓干細(xì)胞在重建年老小鼠心臟中表達(dá)升高最明顯[2]。通過年輕Sca-1+骨髓干細(xì)胞重建年老小鼠骨髓，可通過旁分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)，促進(jìn)心外膜細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終改善心肌梗死后年老小鼠心臟功能[3-4]。最新的研究證實(shí)，衰老同樣影響了血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的功能[5]。VSMC的衰老，是動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭等心血管疾病的重要誘因[6-7]。然而年輕Sca-1+骨髓干細(xì)胞對年老小鼠血管平滑肌細(xì)胞(old mice vascular smooth muscle cell， OMVSMC)的作用及其機(jī)制研究少見報(bào)道。為此，2017年1月至2019年11月，本研究探討了年輕Sca-1+骨髓干細(xì)胞對OMVSMC增殖的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 不同年齡段小鼠細(xì)胞提取 選取2～3個月月齡C57BL/6小鼠作為年輕組(Y組)。選取22～23個月月齡C57BL/6小鼠作為年老組(O組)。提取Y組小鼠骨髓細(xì)胞，Y組及O組小鼠VSMC。

1.1.2 主要試劑及儀器 Sca-1+細(xì)胞分選試劑盒(Stem Cell Technology)；BrdU(Sigma)；血小板源生長因子B鏈的純合二聚體(PDGFBB)ELISA檢測試劑盒(R&D)；MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒(Abcam)；平滑肌肌動蛋白(α-SMA)熒光染色(Sigma)；Transwell室(Corning)；熒光定量PCR儀(ABI)。

1.2 方法

1.2.1 年輕Sca-1+細(xì)胞的提取及鑒定 按照Sca-1+細(xì)胞分選試劑盒使用方法，收集Y組小鼠股骨，提取小鼠骨髓細(xì)胞，通過分選試劑盒，分選Sca-1+及Sca-1-細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞儀鑒定Sca-1+細(xì)胞比例[3]。

1.2.2 MVSMC培養(yǎng) 收集Y組及O組小鼠主動脈，分離消化后，培養(yǎng)MVSMC。并通過α-SMA熒光染色鑒定細(xì)胞[3， 8]。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測 BrdU染色及MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力。

1.2.4 qRT-PCR檢測 收取OMVSMC總RNA，通過qRT-PCR檢測不同實(shí)驗(yàn)組中cyclin B1、cyclin D1基因的表達(dá)。選取GAPDH作為內(nèi)參對照。各基因引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 Western blot檢測 收取OMVSMC蛋白，通過Western blot檢測不同實(shí)驗(yàn)組中cyclin B1、cyclin D1蛋白的表達(dá)。選取GAPDH作為內(nèi)參對照。

1.2.6 年輕Sca-1+/-細(xì)胞分別與OMVSMC共培養(yǎng) Y組Sca-1+/-細(xì)胞分別培養(yǎng)于Transwell小室濾膜上方，OMVSMC培養(yǎng)于Transwell下室。無血清，低氧(0.1% O2)培養(yǎng)72 h，行BrdU染色檢測增殖細(xì)胞。提取OMVSMC總RNA及蛋白，檢測增殖相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)。收集Y組Sca-1+/-細(xì)胞上清分別與OMVSMC共培養(yǎng)。1%血清，低氧培養(yǎng)7 d。分別于第1、3、5、7天，收取OMVSMC，通過MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力。

1.2.7 年輕Sca-1+/-細(xì)胞旁分泌生長因子鑒定 無血清，低氧培養(yǎng)(0.1% O2)72 h后，分別收集Y組Sca-1+/-細(xì)胞及上清。參照PDGFBB ELISA 檢測試劑盒使用方法，檢測細(xì)胞及上清中PDGFBB的表達(dá)。

注：體外培養(yǎng)年輕(Y)及年老(O)VSMC圖1 α-SMA染色鑒定細(xì)胞類型

2 結(jié)果

2.1 不同年齡組MVSMC增殖能力檢測 培養(yǎng)MVSMC，并通過α-SMA熒光染色，鑒定細(xì)胞形態(tài)及類型，見圖1。與Y組相比，O組MVSMC增殖細(xì)胞(BrdU染色陽性)比例下降71%，見圖2、表2；增殖相關(guān)基因cyclin B1表達(dá)下降67%，cyclin D1表達(dá)下降57%；增殖相關(guān)蛋白cyclin B1表達(dá)下降60%，cyclin D1表達(dá)下降46%；MTT檢測細(xì)胞增殖，與Y組相比，O組MVSMC在第3、5、7天，細(xì)胞增殖能力下降，見圖3、表2。

注：A:Y組；B:O組

圖3 Western blot檢測增殖相關(guān)蛋白(cyclin B1，cyclin D1)表達(dá)

表2 不同年齡組MVSMC增殖能力、增殖相關(guān)基因及蛋白表達(dá)檢測

2.2 年輕Sca-1骨髓干細(xì)胞對OMVSMC增殖能力的調(diào)控作用 與Sca-1-細(xì)胞共培養(yǎng)組比較，Sca-1+細(xì)胞共培養(yǎng)組，增殖細(xì)胞(BrdU染色陽性)比例上升2.6倍(圖4、表3)；增殖相關(guān)基因cyclin B1表達(dá)上升2.27倍，cyclin D1表達(dá)上升2.47倍；增殖相關(guān)蛋白cyclin B1表達(dá)上升2.43倍，cyclin D1表達(dá)上升2.73倍(圖5、表3)；MTT檢測細(xì)胞增殖，證實(shí)與Sca-1-細(xì)胞共培養(yǎng)組相比，Sca-1+細(xì)胞共培養(yǎng)組，在第3、5、7天，細(xì)胞增殖能力上升，見表3。

注：A： O+Y Sca-1-組；B:O+Y Sca-1+組

表3 年輕Sca-1骨髓干細(xì)胞對OMVSMC增殖能力、增殖相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的調(diào)控作用

圖5 Western blot檢測年輕Sca-1骨髓干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3 年輕Sca-1骨髓干細(xì)胞旁分泌生長因子檢測 與Sca-1-細(xì)胞比較，Sca-1+細(xì)胞中，Pdgfb基因表達(dá)上升2.49倍，PDGFBB的表達(dá)上升2.7倍。與Sca-1-細(xì)胞上清相比，Sca-1+細(xì)胞上清中PDGFBB的表達(dá)上升3.31倍，見表4。

表4 年輕Sca-1骨髓干細(xì)胞旁分泌生長因子檢測

2.4 年輕Sca-1骨髓干細(xì)胞促進(jìn)OMVSMC增殖的機(jī)制 中和年輕Sca-1+細(xì)胞旁分泌的PDGFBB。與Sca-1+細(xì)胞共培養(yǎng)對照組相比，中和PDGFBB組，增殖細(xì)胞(BrdU染色陽性)比例下降66%(圖6、表5)；增殖相關(guān)基因cyclin B1表達(dá)下降63%，cyclin D1表達(dá)下降68%；增殖相關(guān)蛋白cyclin B1表達(dá)下降45%，cyclin D1表達(dá)下降58%(圖7、表5)；MTT檢測細(xì)胞增殖，與對照組比較，中和PDGFBB組，在第3、5、7天，細(xì)胞增殖能力下降，見表5。

注：A:O+Y Sca-1++C組；B:O+Y Sca-1++N組

圖7 Western blot檢測中和后年輕Sca-1骨髓干細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)

表5 OMVSMC增殖能力、增殖相關(guān)基因及蛋白表達(dá)檢測

3 討論

衰老影響了機(jī)體內(nèi)源性干細(xì)胞/祖細(xì)胞的功能，衰老成為再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題[9]。衰老同樣影響了VSMC的增殖、遷移能力，以及細(xì)胞周期調(diào)控因子、衰老相關(guān)蛋白/酶的表達(dá)[6]。在Sca-1+骨髓干細(xì)胞的前期研究中，證實(shí)年輕Sca-1+骨髓干細(xì)胞可通過旁分泌改善年老心外膜細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，再生心肌梗死后年老小鼠心臟功能[8]。但年輕小鼠Sca-1+骨髓干細(xì)胞對OVSMC功能的調(diào)控作用研究甚少。所以本研究探討了年輕小鼠Sca-1+骨髓干細(xì)胞對OVSMC功能的調(diào)控作用，研究發(fā)現(xiàn)年輕小鼠Sca-1+骨髓干細(xì)胞可通過旁分泌PDGFBB促進(jìn)OVSMC增殖。

Sca-1+干細(xì)胞在心肌損傷修復(fù)中起重要作用，Sca-1+細(xì)胞被證實(shí)可調(diào)控細(xì)胞黏附、增殖及分化[10]。Sca-1+細(xì)胞缺乏可導(dǎo)致小鼠心臟收縮缺陷和年齡相關(guān)的心肌肥大[11]。在心臟中過表達(dá)Sca-1可減輕心肌肥大和纖維化，恢復(fù)心臟功能[12]。更有研究證實(shí)，在心肌梗死后，Sca-1+干細(xì)胞可以被招募到新生鼠及成年小鼠心臟，從而發(fā)揮修復(fù)作用[13]。在Sca-1+心臟干細(xì)胞中的研究也同樣證實(shí)，將Sca-1+心臟干細(xì)胞移植于心肌梗死后心臟，可減小心梗范圍，恢復(fù)左室心臟功能，促進(jìn)新生血管生成[14]。我們的前期研究證實(shí)，與Sca-1-細(xì)胞相比，Sca-1+骨髓干細(xì)胞可以更好地改善心肌梗死后小鼠心臟功能[3]。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，與Sca-1-細(xì)胞相比，Sca-1+細(xì)胞可以旁分泌更多的生長因子，其中包括PDGFBB[2-3]。本研究，我們進(jìn)一步證實(shí)了年輕Sca-1+骨髓干細(xì)胞旁分泌PDGFBB再生OVSMC增殖能力的作用。

研究證實(shí)，衰老影響了VSMC的功能，并導(dǎo)致了衰老相關(guān)血管疾病的發(fā)生[15]。在大鼠、小鼠和人來源VSMC的研究中證實(shí)，衰老導(dǎo)致VSMC的增殖能力下降[16-17]。Ruiz-Torres等[18]的研究證實(shí)，人來源VSMC的遷移能力也隨年齡的增加而下降。同樣地，隨年齡增加，小鼠和人來源VSMC凋亡比例增加[16， 19]。MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、MMPs等炎癥相關(guān)因子在VSMC中的表達(dá)也隨年齡的增加而發(fā)生改變[20]。本研究我們證實(shí)，隨年齡增加，MVSMC增殖相關(guān)基因及蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞增殖能力下降。而通過年輕Sca-1+骨髓干細(xì)胞與OVSMC共培養(yǎng)，恢復(fù)了OVSMC的增殖能力。這為年輕Sca-1+骨髓干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的運(yùn)用，提供了更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。也為VSMC衰老導(dǎo)致的動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭等心血管疾病的治療提供了更多的治療手段。

PDGF家族被證實(shí)可調(diào)控VSMC功能，調(diào)控血管形成[21]。其中PDGFBB更是被證實(shí)參與VSMC表型的轉(zhuǎn)化、細(xì)胞增殖及細(xì)胞遷移能力的調(diào)控[22]。本研究我們證實(shí)，與Sca-1-細(xì)胞相比，Sca-1+細(xì)胞可以旁分泌更多的PDGFBB，從而促進(jìn)OVSMC增殖。中和Sca-1+細(xì)胞分泌的PDGFBB，使Sca-1+失去促進(jìn)OVSMC增殖的作用。所以我們證實(shí)，年輕小鼠Sca-1+骨髓干細(xì)胞可通過旁分泌PDGFBB促進(jìn)OVSMC增殖。

綜上所述，年輕小鼠Sca-1+骨髓干細(xì)胞可通過旁分泌PDGFBB促進(jìn)OVSMC增殖相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究進(jìn)一步闡述了年輕Sca-1+骨髓干細(xì)胞對年老小鼠細(xì)胞功能的影響及分子機(jī)制，為干細(xì)胞在衰老相關(guān)疾病中運(yùn)用提供了更多的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。