金銀花總有機(jī)酸有效部位的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張 蕊，王騰騰，蘇培文，李孟孟，黃 鵬，李海剛

(臨沂大學(xué)，山東 臨沂 276000)

有機(jī)酸類化合物是金銀花的主要有效成分[1-2]，包括綠原酸、異綠原酸、咖啡酸等有機(jī)酸類成分，具有抑菌抗病毒[3-4]、解熱[5]、抗炎、保肝、止血、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[6]。近年來(lái)人們對(duì)金銀花綠原酸的提取方法[7-8]、金銀花有機(jī)酸類成分的含量測(cè)定方法進(jìn)行了廣泛的研究，但將金銀花總有機(jī)酸作為有效部位進(jìn)行分離提取的報(bào)道尚不多見。本文在前期研究的基礎(chǔ)上制備了金銀花總有機(jī)酸有效部位，研究其薄層鑒別方法、總有機(jī)酸含量測(cè)定方法，采用高效液相色譜法測(cè)定了金銀花總有機(jī)酸有效部位中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B及異綠原酸C的含量，為金銀花總有機(jī)酸有效部位的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)，為金銀花總有機(jī)酸有效部位制劑的開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀(美國(guó) Agilent公司)；TU-1810spc紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000A上海亞榮生化儀器廠)；ME104E電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y24J7K16726)；異綠原酸A對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：P28O7F23862)；異綠原酸B對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)P25J6F1793)；異綠原酸C對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：P28D4S1)；金銀花(山東平邑)；甲醇、乙腈為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 金銀花總有機(jī)酸有效部位的制備

取金銀花切段，加入10倍量70%乙醇回流煎煮3次，每次1h，濾過(guò)，合并3次煎煮液，濾過(guò)，取續(xù)濾液減壓濃縮至相對(duì)密度1.2，石油醚萃取除去脂溶性成分，然后用等量乙酸乙酯萃取5次，棄去乙酸乙酯層，取水層上大孔吸附樹脂LSA-7，徑高比9∶1，先用4倍量柱體積水洗脫，洗脫流速3 mL/min，再用7倍量70%乙醇洗脫，洗脫流速5 mL/min，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至干，即得金銀花總有機(jī)酸有效部位，其中總有機(jī)酸含量約為71.6%。

2.2 薄層色譜鑒別

取金銀花有機(jī)酸有效部位粉末50 mg置于10 mL量瓶中，加75%乙醇使溶解，作為供試品溶液。量取綠原酸對(duì)照品，加75%乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版通則0502)試驗(yàn)，分別吸取上述兩種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯∶水∶乙酸∶二甲苯(85∶10∶20∶4)溶液為展開劑，飽和20 min后展開，取出，晾干，于365nm波長(zhǎng)處觀察，供試品色譜圖中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。

1.金銀花有機(jī)酸有效部位；2.綠原酸

2.3 總有機(jī)酸含量測(cè)定

2.3.1 綠原酸對(duì)照品溶液配制 精密稱取綠原酸對(duì)照品0.010 8 g，置于50 mL棕色量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.216 mg/mL的對(duì)照品溶液(10 ℃以下避光保存)。

2.3.2 最大吸收波長(zhǎng)選擇 取綠原酸對(duì)照品溶液適量，加70%乙醇稀釋至適當(dāng)濃度，按照紫外分光光度法于200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，記錄掃描色譜圖，結(jié)果如圖2所示。取金銀花總有機(jī)酸提取物適量，70%無(wú)水乙醇溶解并稀釋至適當(dāng)濃度，同法于200～600 nm波長(zhǎng)處掃描，記錄掃描色譜圖，結(jié)果如圖3所示。

圖2 綠原酸紫外掃描

圖3 總有機(jī)酸有效部位紫外掃描

由圖可見，綠原酸在327 nm波長(zhǎng)處有一最大吸收，總有機(jī)酸在243 nm及327 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，參考山東省藥材標(biāo)準(zhǔn)[9](金銀花提取物中總有機(jī)酸測(cè)定方法)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文選擇327 nm作為吸收波長(zhǎng)測(cè)定總有機(jī)酸含量。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取綠原酸對(duì)照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，以70%乙醇作空白對(duì)照，在327 nm處測(cè)吸光度。以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，綠原酸在4.32～21.6 μg/mL濃度范圍內(nèi)與其吸光度線性關(guān)系良好，回歸方程為y=48.936x+0.0425(R2=0.9994)。

圖4 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取綠原酸對(duì)照品溶液0.6 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，在0、2、4、6、8 h，于327 nm下測(cè)定吸光度。RSD為0.98%，溶液吸光度在8h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密量取綠原酸對(duì)照品溶液0.6 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，于327 nm下測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，RSD為0.56%，表明試驗(yàn)所用儀器精密度良好。

2.3.6 樣品回收率試驗(yàn) 分別精密量取綠原酸對(duì)照品溶液0.6 mL 9份，分別置于9個(gè)25 mL量瓶中，各量瓶均加入已知濃度的供試品溶液0.4、0.5、0.6 mL，70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，于327 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算總有機(jī)酸加樣回收率，結(jié)果見表1，RSD為1.93%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好。

表1 總有機(jī)酸的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

參考山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)中“金銀花提取物”總綠原酸含量測(cè)定方法[9]，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)做如下變動(dòng)，測(cè)定樣品中總綠原酸含量，具體測(cè)定方法如下：精密稱取綠原酸對(duì)照品0.010 8 g，置于50 mL棕色量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.216 mg/mL的對(duì)照品溶液(10 ℃以下避光保存)。取提取物粉末置于25 mL棕色量瓶中，加70%乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻、濾過(guò)得供試品溶液。按照紫外分光光度法于327 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以綠原酸為對(duì)照計(jì)算總有機(jī)酸含量，結(jié)果見表2。

表2 金銀花有機(jī)酸有效部位中總有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果(%)

2.4 樣品中指標(biāo)成分含量測(cè)定

以綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C作為指標(biāo)性成分，采用高效液相色譜法測(cè)定各指標(biāo)性成分含量。

2.4.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～15 min，10%～20%(A)；15～40 min，20%～30%(A)；40～60 min，30%～60%(A)；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm；柱溫：室溫；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

2.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 分別精密稱取綠原酸0.010 1 g、異綠原酸A 0.010 0 g、異綠原酸B 0.010 5 g、異綠原酸C 0.010 1 g，分別置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，得各指標(biāo)性成分儲(chǔ)備液。分別取各指標(biāo)性成分儲(chǔ)備液2.5 mL置于25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，得各指標(biāo)性成分混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.4.3 系統(tǒng)適應(yīng)性 取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C分離度良好，相鄰色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按綠原酸計(jì)算不低于2 000。

1.綠原酸；2.異綠原酸B；3.異綠原酸A；4.異綠原酸C

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、1.0、3.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，各對(duì)照品回歸方程見表3?？梢?種成分在0.01～1.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與其峰面積積分線性關(guān)系良好。

表3 4種對(duì)照品的回歸分析結(jié)果

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照溶液1.0 mL置于10 mL量瓶中，加70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別取10 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積RSD分別為0.62%、0.77%、0.82%。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照溶液1.0 mL置于10 mL量瓶中，加70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別于0、2、4、6、8、12 h取10 μL進(jìn)樣分析，結(jié)果綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積RSD分別為0.72%、0.85%、0.94%。表明在12 h以內(nèi)各對(duì)照品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照溶液1.0 mL 6份，分別置于10 mL量瓶中，加70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別取10 μL進(jìn)樣分析，結(jié)果綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積RSD分別為0.51%、0.65%、0.74%，表明重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的同一樣品3份若干置于100mL量瓶中，分別精密加入各對(duì)照品溶液適量，加70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密稱取10 μL注入高效液相色譜儀，計(jì)算3種成分的加樣回收率。由表4結(jié)果可以看出，在該色譜條件下，該定量方法對(duì)3種成分的加樣回收率良好。

表4 4種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.9 樣品中綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C含量測(cè)定 取有機(jī)酸提取物樣品置于100 mL量瓶中，加70%乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中4種成分含量。見表5。

表5 金銀花有機(jī)酸有效部位中4種成分含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

有機(jī)酸有效部位薄層鑒別圖譜中綠原酸斑點(diǎn)清晰，其他成分斑點(diǎn)不夠清晰，可能是含量較低的原因，因此在薄層鑒別中我們選擇綠原酸作為有機(jī)酸有效部位薄層鑒別指標(biāo)性成分。

流動(dòng)相篩選過(guò)程中，考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸、乙腈-醋酸、甲醇-醋酸梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)以乙腈-磷酸為流動(dòng)相時(shí)色譜峰峰形較好，分離度較高。綠原酸對(duì)照品溶液在200～800 nm全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明綠原酸在327 nm波長(zhǎng)處有最大吸收?？傆袡C(jī)酸提取物的200～600 nm全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示出兩個(gè)吸收峰(327 nm、243 nm)，參照山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)中“金銀花提取物”總綠原酸含量測(cè)定方法測(cè)定樣品中總綠原酸含量，選擇327 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。