無金屬ATRP法制備SBA-15-g-PNIPAM溫敏性復合材料及其藥物控釋性能研究

楊金罡 郭廣國 姚淑娟 范治平 趙燕娜 王利平 李 光

(1.聊城大學 材料科學與工程學院，山東 聊城 252059；2.聊城大學 生物制藥研究院，山東 聊城 252059)

0 引言

自20世紀60年代英國學者Bangham等首次將磷脂分子分散在水中進行電鏡觀察時發(fā)現(xiàn)了脂質體以來[1]，載藥體系(Drug delivery systems，DDS)的研究成為了生物醫(yī)學、醫(yī)療衛(wèi)生和制藥工業(yè)的研究熱點[2-4].近年來，隨著對納米藥物載體的深入研究，環(huán)境響應型無機-有機復合納米粒子在藥物傳遞系統(tǒng)中得到了廣泛的應用，這種智能型納米藥物載體具有其獨特的優(yōu)勢，其不僅可以有效地提高疏水性藥物的溶解性和化學穩(wěn)定性，而且可以隨著生理環(huán)境的變化(如 pH 和溫度)進行控制釋放，實現(xiàn)藥物在病變部位的靶向性，從而提高藥效，減小其對正常組織的毒副作用[5-7].

介孔分子篩SBA-15由于其具有良好的生物相容性，水熱穩(wěn)定性，吸附性能和低毒性，以及巨大的比表面和孔容積可以有效提高藥物裝載能力，其表面含有豐富的硅羥基，可以通過物理、化學的方法進行表面修飾引入功能性分子，使形成具有環(huán)境響應型的介孔納米復合材料[8-10].原子轉移自由基聚合(ATRP)方法具有適用單體廣泛，可精確控制分子量及分子量分布等優(yōu)點，從而成為無機材料表面接枝聚合物的有效方法[11-13].傳統(tǒng)的ATRP體系存在金屬離子(主要是銅離子和鐵離子)在反應產(chǎn)物中難以除去，從而導致聚合物老化的加速，且銅鹽具有一定的生物毒性，從而限制了材料在生物醫(yī)用和電子等領域的應用.電子轉移活化再生催化劑原子轉移自由基聚合(ARGET-ATRP)雖使得反應產(chǎn)物中的金屬離子含量降到ppm級，但仍然沒有除盡金屬離子[14-16].2014年Hawher等人第一次報道了以10-苯基吩噻嗪(PTH)為 催化劑的無金屬催化ATRP[17]，使得ATRP體系徹底避免了金屬離子在聚合物中的殘留，拓寬了ATRP產(chǎn)物的應用范圍.

本研究通過無金屬ATRP聚合，在SBA-15孔道內接枝了溫敏性聚合物PNIPAM，制備了以SBA-15介孔分子篩為儲存藥物的 “倉庫”，以接枝于孔道內的溫敏性PNIPAM作為控制釋放藥物“閥門”的溫敏性藥物控釋載體，并對藥物載體的藥物裝載量和在不同的溫度下的釋放行為進行了研究.

1 實驗部分

1.1 原料及試劑

10-苯基吩噻嗪(PTH)[17]和介孔分子篩SBA-15[18]根據(jù)文獻合成，SBA-15的N2吸附-解吸等溫線和孔徑分布曲線如圖1所示，孔徑分布比較均勻，大多數(shù)粒子的孔徑為13.24 nm.3-氨基丙基三乙氧基硅烷偶聯(lián)劑(KH550)(上海阿拉丁生化科技有限公司)，2-溴異丁酸乙酯(EBiB)(阿拉丁試劑)，2-溴代異丁酰溴(BIBB)(阿拉丁試劑)，N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)，以上試劑均為分析純.

1.2 測試分析

采用美國Nicolet IR-100紅外光譜儀測定產(chǎn)物的特征吸收峰；采用日本JEOL的JEM-1400透射電鏡(TEM)進行對樣品進行觀察，先將樣品分散于乙醇中，滴在銅網(wǎng)上干燥后進行.用MERLIN Compact場發(fā)射掃描電鏡對樣品形貌進行觀測.用德國耐馳STA449C同步熱分析儀測定產(chǎn)物隨著溫度的增加其熱失重變化.采用UV-2200(北京，北分瑞利)紫外-可見分光光度計在367 nm處監(jiān)測槲皮素在不同PBS中的釋放，波長精度為0.25 nm.用Belsorp-Max 低溫物理吸附儀，在液氮溫度下測試樣品對氮氣的吸附-脫附等溫線，樣品在測試前先在120 ℃的真空條件下脫氣.細胞毒性分析測試在Multiskan 1530型酶標儀上進行.

1.3 實驗過程

1.3.1 10-苯基吩噻嗪(PTH)的合成[17]. 將叔丁醇鈉(134 mg，1.4 mmol)，吩噻嗪(199 mg，1 mmol)，Rphos Brecat(14 mg，0.02 mmol)，Ruphos(8 mg，0.02 mmol)，1 mL 1,4-二氧六環(huán)，143 μL氯苯依次加入單口瓶中，磁力攪拌混合均勻后，氮氣保護下110 ℃加熱攪拌6 h.反應完后冷卻至室溫，加入30 mL CH2Cl2稀釋后用等量水萃取，取下層墨綠色和黑色物質用飽和食鹽水萃取，取下層墨綠色有機相用無水MgSO4干燥，遮光存放，然后用色譜柱分離純化(5%乙酸乙酯/正己烷)，所得產(chǎn)物減壓蒸餾，室溫真空干燥，得白色粉末狀產(chǎn)物PTH.

1.3.2 SBA-15介孔分子篩的氨基化. 將SBA-15(0.5 g)，KH-550(2 mL)，甲苯(10 mL)依次加入圓底燒瓶中，室溫下磁力攪拌均勻后，于90℃加熱攪拌10 h.反應完后冷卻至室溫，離心分離，40 ℃真空干燥.將干燥產(chǎn)物于索氏提取器中抽提12 h，去除吸附在無機粒子表面的KH550，抽提后的產(chǎn)物40℃真空干燥，得氨基化產(chǎn)物SBA-15-NH2.

1.3.3 SBA-15-NH2的溴代. 將SBA-15-NH2(0.5 g)和四氫呋喃(THF)(6 mL)加入圓底燒瓶中，室溫磁力攪拌15 min，使其分散均勻，再加入三乙胺(2.5 mL)，冰水浴條件下用恒壓滴液漏斗滴加四氫呋喃(4 mL)和2-溴異丁酰溴(4 mL)的混合溶液，冰水浴繼續(xù)反應24 h.反應結束后依次用水和乙醇洗至近中性，35℃真空干燥，得SBA-15負載的溴代引發(fā)劑SBA-15-Br.

1.3.3 SBA-15-g-PNIPAM的制備. 將SBA-15-Br(0.10 g)，N-異丙基丙烯酰胺(2.30 g，9.94 mmol)，PTH(1.87 mg，0.0070 mmol)，2-溴異丁酸乙酯(0.01 mL，0.07mmol)依次加入圓底燒瓶中，再加入2 mL乙醇與水的混合液(V乙醇∶V水=4∶1)，充放氮氣三次，室溫攪拌30 min，使其分散均勻后，再用紫外燈于365 nm下照射4 h.反應結束后，用12 mL乙醇與水的混合液(V乙醇∶V水=4∶1)將聚合產(chǎn)物稀釋后離心分離.上清液(含PNIPAM均聚物)用冷石油醚沉淀后室溫真空干燥；下層沉淀干燥完全后用THF索氏抽提以去除吸附在SBA-15表面的均聚物，得SBA-15-g-PNIPAM復合材料.

1.3.4 細胞毒性分析. 根據(jù)ISO 10993-5標準和相關文獻[19]，通過MTT法測定SBA-15-g-PNIPAM的提取液，評價SBA-15-g-PNIPAM的體外細胞毒性.將細胞(8×103個L929細胞/孔)接種于96孔板中,在補充有 10% PBS 和 1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中、5% CO2氛圍中37 ℃孵育24 h，用含有SBA-15-g-PNIPAM的培養(yǎng)基(100 μL) 替換原培養(yǎng)基，并在 37 ℃下 5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)1、2、3 d，加入20 μL MTT溶液( 5 mg mL-1in PBS)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內溶液,每孔加入150 μL DMSO，振搖 5 min 以保證藍色晶體被充分溶解，用酶標儀于490 nm處測定各孔的吸光度值，計算細胞存活率，每組重復3次，數(shù)據(jù)以相對于空白對照數(shù)據(jù)的百分比表示. 每組用6個樣本進行測試.

1.3.5 槲皮素的負載與釋放. 將SBA-15-g-PNIPAM(0.02 g)與槲皮素(Qu)(0.02 g)加入到1 mL的乙醇中，室溫攪拌直至溶劑完全蒸發(fā).然后將粉末狀負載產(chǎn)品用透析袋封住口放于50 mL蒸餾水中洗滌3次，每次浸泡1 h，即得負載產(chǎn)物SBA-15-g-PNIPAM-Qu.

取2份1 mg藥物負載產(chǎn)物SBA-15-g-PNIPAM-Qu于2個透析袋中，各加入1 mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液，然后分別放入裝有99 mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液的磨口錐形瓶中，分別標記為1號和2號.1號置于20 ℃搖床恒溫釋放，2號置于37 ℃搖床恒溫釋放，定時取樣3 mL，并及時補液，每隔12 h進行換液，測量其吸光度.槲皮素的負載與釋放示意圖如圖2所示.

2 結果與討論

2.1 FT-IR分析

圖3是SBA-15(a)，SBA-15-NH2(b)，SBA-15-Br(c)和SBA-15-g-PNIPAM(d)的紅外光圖譜.由圖3a可以看出，在1085 cm-1處有一強吸收峰，為SBA-15介孔分子篩的特征吸收峰Si-O-Si的伸縮振動峰；與KH550反應以后(圖3b)，在2930 cm-1處出現(xiàn)了亞甲基的吸收峰，在1568 cm-1處的吸收峰為N-H鍵的非對稱彎曲振動峰，說明KH550已成功負載到SBA-15介孔分子篩的表面；與2-溴代異丁酰溴反應以后，如圖3(c)，在1661 cm-1處出現(xiàn)了酰胺CONH中C=O的特征吸收峰，可歸屬為SBA-15-NH2末端氨基酰溴化后的C=O的伸縮振動吸收峰，由此斷定介孔分子篩溴代過程成功；SBA-Br表面引發(fā)NIPAM聚合后，如圖3(d)，1661 cm-1處的酰胺CONH中C=O的特征吸收峰相比SBA-Br增強，2850-3000 cm-1處的C-H鍵的吸收峰也明顯增強，說明SBA-15表面成功接枝了聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM).

2.2 形貌分析

圖4分別是SBA-15(a)的透射電鏡(TEM)圖片，SBA-15(b)和SBA-15-g-PNIPAM(c)的掃描電鏡(SEM)圖片.由圖4(a)可看出，SBA-15介孔分子篩具有一定長度且排列有序的介孔孔道結構，其有序性，規(guī)整性比較好；由圖4(b)可以發(fā)現(xiàn) SBA-15 介孔分子篩的顆粒外貌呈蓮藕狀，表面細微的凹槽清晰可見，凹面結構在催化以及吸附反應中會增加SBA-15 對反應物或者擴散介質的吸附能，這也是 SBA-15 可以作為各類藥物的載體的重要原因.接枝PNIPAM后，如圖4(c)，SBA-15介孔分子篩的外觀形貌并沒有因為接枝聚合物的引入而發(fā)生根本性的變化，仍呈蓮藕狀，孔狀結構依稀可見，說明聚合物的接枝對SBA-15的孔道結構沒有產(chǎn)生破壞，屬于孔內接枝.

2.3 熱失重分析(TGA)

圖5為SBA-15和SBA-15-g-PNIPAM的TGA曲線(N2氛圍).由TGA曲線可以計算出SBA-15在室溫-800 ℃區(qū)間的熱失重為7.0 %，SBA-15-g-PNIPAM在室溫-800 ℃區(qū)間的熱失重為32.2 %，經(jīng)計算可知二者的熱失重之差為25.2 %，二者的熱失重之差主要是由SBA-15表面的有機物分解引起的，但因為SBA-15表面的有機物在加熱過程中可能碳化，不會完全失去，因此SBA-15表面的有機物含量應該會稍大于25.2 %，熱失重結果也進一步證實了SBA-15介孔分子篩可通過表面引發(fā)進行活性自由基聚合.

2.4 溫度敏感性分析

圖6是SBA-15-g-PNIPAM復合材料分別在20 ℃水和40 ℃水中的分散性.從圖中可以看出，SBA-15-g-PNIPAM復合材料在20 ℃的水中呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，分散性良好，在40 ℃水中則呈聚集狀出現(xiàn)在底部，上液面澄清.這是由于SBA-15表面接枝的溫敏性聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)的臨界相轉變溫度大約在32 ℃，當溫度低于32 ℃時，整個聚合物網(wǎng)絡處于伸展的狀態(tài)，有利于聚合物的分散，當溫度高于32 ℃時，整個聚合物網(wǎng)絡結構處于收縮的狀態(tài)，不利于其分散.

進一步用UV-vis全譜掃描不同溫度下溶液的透過率來檢測溶液的分散度(圖7)，結果顯示，SBA-15-g-PNIPAM復合材料在40 ℃水中的透過率明顯高于在20 ℃水中的透過率，說明復合材料在20 ℃的水中呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，而在40 ℃水中則呈聚集狀出現(xiàn)在底部，上液面澄清，這與圖6的結果相佐證.

圖8為SBA-15-g-PNIPAM復合材料分別在20 ℃水和40 ℃水中的的粒度分布曲線.從圖中可以看出，在20 ℃水中的粒徑在141.77 nm左右，在40 ℃水中的粒徑在341.99 nm左右，隨著溫度的升高，粒徑呈現(xiàn)增大的趨勢，同樣進一步驗證了SBA-15-g-PNIPAM復合材料在20 ℃的水中分散性好，而在40 ℃水中則呈聚集狀，導致復合材料粒度增大，顯示了良好的溫度敏感性.

2.5 藥物釋放曲線的分析

圖9為SBA-15-g-PNIPAM負載槲皮素(SBA-15-g-PNIPAM-Qu)后，在pH=7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液中的釋放曲線，由于SBA-15表面的接枝聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)具有溫度敏感性，其臨界相轉變溫度(LCST)在32 ℃左右，因此我們選擇在20 ℃和37 ℃兩種溫度下進行槲皮素的釋放.如圖9中槲皮素在20 ℃磷酸鹽緩沖溶液中的釋放曲線，當體系所處溫度低于其臨界相轉變溫度(LCST=32 ℃)時，SBA-15-g-PNIPAM-Qu中的聚N-異丙基丙烯酰胺聚合物呈現(xiàn)親水傾向，整個聚合物網(wǎng)狀結構處于伸展的狀態(tài)，有利于槲皮素的釋放，且隨著時間的增長，釋放率慢慢增加，在96 h時釋放曲線出現(xiàn)拐點，釋放率達到97.36 %，此后釋放率呈現(xiàn)平臺形式，在120 h時達到釋放率為98.53 %的最大值；而當溫度高于其臨界相轉變溫度時(37 ℃)，槲皮素的釋放率曲線近乎一條直線，保持在非常低的釋放率，釋放率在5.95 %-11.20 %之間.這是由于溫度高于其臨界相轉變溫度時，聚合物網(wǎng)狀結構處于收縮狀態(tài)，封堵住了介孔分子篩的孔道，不利于槲皮素的釋放.由此可得出通過PNIPAM功能化的SBA-15介孔材料能夠實現(xiàn)藥物劑量的控制釋放，有望應用于藥物控釋載體領域.

2.6 生物相容性分析

采用 MTT 法即細胞毒性實驗評價SBA-15-g-PNIPAM的生物相容性.圖10為L929細胞毒性定量評價結果.第1天和第2天，細胞存活率分別為90.01 %和95.32 %，第3天，SBA-15-g-PNIPAM對L929細胞的細胞毒性完全消失.相對生長速率(RGR)的值證實了SBA-SBA-15-g-PNIPAM具有良好的生物相容性，充分滿足后續(xù)生物醫(yī)學應用的要求.

3 結論

本文以SBA-15介孔分子篩為載體，BIBB修飾后采用無金屬ATRP聚合法制備了SBA-15-g-PNIPAM溫敏型的有機/無機復合材料，進一步以抗癌藥物槲皮素作為藥物模型分子，對其進行槲皮素的藥物負載，通過TEM、SEM、紫外、紅外等表征方法進行了表征，并研究其不同溫度下的槲皮素控釋行為.研究結果表明，溫敏性功能單體N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)成功接枝到了介孔分子篩SBA-15的表面，且可根據(jù)臨界相變點(LCST)對藥物進行控制釋放，成功制備出了溫度控釋型的智能高分子材料，可有望應用于醫(yī)學藥物控釋領域.