三白瓜酒發(fā)酵及其香氣成分分析

李小燕，陳文波，鐘 鳴，李 慧，強(qiáng)婉麗，張連慧，張晨悅，盧 玉

（中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院，營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209）

三白瓜，原名三白西瓜（Citrullus lanatuscv.Sanbai (Citrullus lanatus(Tunb.) Matsum & Nakai cv.Sanbai)）是中國(guó)栽培歷史悠久的一種瓜果，屬于被子植物亞門、雙子葉植物綱、葫蘆目、葫蘆科、西瓜屬[1-3]。它因白皮、白瓤、白籽而得名“三白瓜”。三白瓜含有豐富的礦物質(zhì)和多種維生素，成熟果實(shí)除含有大量水分外，瓢肉含糖量一般為5%～12%，包括葡萄糖、果糖和蔗糖。歷史資料顯示，三白瓜始種于西漢，曾被定為明清兩代貢品[3-4]。目前，三白瓜的種植地主要分布在中國(guó)河北省威縣、山西省萬(wàn)榮縣一帶，是當(dāng)?shù)鼐用裣哪┣锍醯闹饕?/p>

古醫(yī)書記載：三白瓜瓤亦稱“白虎湯”，能除暑熱，治血痢，解酒毒，治口瘡；其皮曰“翠衣”，亦有生津解煩之奇效；其籽甘寒，清肺潤(rùn)腸，補(bǔ)中宜人，主治腸痛[3]。在中醫(yī)學(xué)上瓜汁和瓜皮都能入藥。作為地方特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，三白瓜因具有敗火清熱解毒的功效得到當(dāng)?shù)乩习傩盏恼J(rèn)可。另外，三白瓜具有其他西瓜品種無(wú)法超越的耐貯性能，最長(zhǎng)可以存貯到第二年的清明[4]。此時(shí)，三白瓜甜度會(huì)因雙糖水解為單糖而降低，內(nèi)部為蜜汁狀，風(fēng)味更加香甜醇厚。因此，三白瓜具有較高的綜合利用和研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。

目前三白瓜的研究和消費(fèi)方式主要集中在瓜汁和瓜瓤直接生食或開(kāi)發(fā)成果汁、瓜皮加工制成菜蔬或蜜餞，瓜子榨油等等，但開(kāi)發(fā)成三白瓜發(fā)酵酒的研究及產(chǎn)品較少。

本研究擬以山西產(chǎn)三白瓜為原料，同時(shí)配合使用部分玉米深加工產(chǎn)品——淀粉糖漿，利用實(shí)驗(yàn)室保藏的釀酒酵母和商業(yè)釀酒酵母，研究開(kāi)發(fā)三白瓜發(fā)酵酒產(chǎn)品，以期為擴(kuò)大三白瓜增值途徑，提高三白瓜經(jīng)濟(jì)附加值，將我國(guó)三白瓜地方資源優(yōu)勢(shì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

三白瓜：產(chǎn)地山西

酵母：釀酒酵母BH8（Saccharomyces cerevisia），中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)，由李慧博士從中國(guó)科學(xué)院植物所的“北紅”釀酒葡萄中分離篩選；EnartsES181英納帝斯公司意大利，商業(yè)白葡萄酒釀造酵母。為方便說(shuō)明，將酵母BH8和ES181重新編號(hào)為B和E。

玉米淀粉糖漿、F55果葡糖漿：中糧生化能源（衡水）有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD固體培養(yǎng)基（酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、瓊脂2%、酵母粉、蛋白胨、瓊脂）：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；10°P麥汁培養(yǎng)基：實(shí)驗(yàn)室制備。

1.1.3 試劑

葡萄糖、果糖、蔗糖：分析純，上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、氯化鈉、濃硫酸、冰醋酸、琥珀酸、乳酸、檸檬酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。果膠酶（XXL，酶活力1 400 PECTU）：諾維信（中國(guó)）。

1.2 主要儀器和設(shè)備

IPP260低溫培養(yǎng)箱：德國(guó)Memmert公司；Scan1200自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀：法國(guó)Interscience公司；AC2-4S1生物安全柜：新加坡ESCO；THZ-98AB恒溫振蕩器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器：日本YAMATO公司；LA-20AT高效液相色譜儀：日本島津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭及萃取手柄：美國(guó)Supelco公司；6890N-5973I氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；7890B-5977榨汁機(jī)：九陽(yáng)JYZ-V911。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酵母活化從斜面上挑取1環(huán)酵母菌，接入無(wú)菌的30 mL麥汁中，28 ℃搖床培養(yǎng)18 h，轉(zhuǎn)速150 rpm。

1.3.2 三白瓜汁制備

自來(lái)水清洗干凈三白瓜后，用生理鹽水洗滌3遍，再用蒸餾水清洗3遍，控干，將三白瓜一分為二，剔除瓜籽，取瓜肉及瓜汁用打漿機(jī)破碎，添加0.03 g/L的果膠酶和70 mg/L的SO2，混合均勻3 h后，過(guò)濾備用。

1.3.3 成分調(diào)整

使用玉米淀粉糖漿調(diào)糖至120 g/L，使用檸檬酸調(diào)酸至4.6 g/L；

1.3.4 三白瓜酒釀造

使用滅菌的三角瓶，三角瓶體積/三白瓜汁的體積為5/2，活化菌種接種量為0.5%，靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃。使用透氣封口膜或添加有濃H2SO4的發(fā)酵栓封口。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌量筒并添加30 mg/L的SO2，4 ℃后發(fā)酵。

1.3.5 酵母生長(zhǎng)測(cè)定

酵母菌液或三白瓜酒發(fā)酵液梯度稀釋后涂布YPD平板，28 ℃培養(yǎng)72 h后計(jì)算活菌落數(shù)。

1.3.6 葡萄糖、果糖、酒精的檢測(cè)

按李慧等[5]的方法，色譜柱為Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm，Bio-Rad；USA）。柱溫：65 ℃；流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4，流速為0.600 mL/min。檢測(cè)器為示差檢測(cè)器，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.7 CO2失重的測(cè)定

接種前、接種后及發(fā)酵過(guò)程中，用電子天平稱重（精確到0.01 g）發(fā)酵瓶，稱前先搖晃三角瓶，以趕除二氧化碳。

1.3.8 總酸的測(cè)定

按國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006[6]指示劑法進(jìn)行。

1.3.9 總糖的測(cè)定

按國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006[6]直接滴定法進(jìn)行。

1.3.10 三白瓜酒香氣成分檢測(cè)

參考Xiao Z、王松廷等的方法檢測(cè)三白瓜酒的香氣成分[7-8]。

將固相微萃取頭插入氣相色譜的進(jìn)樣口中，270 ℃老化1 h，并進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，直至無(wú)色譜峰出現(xiàn)。將樣品裝入樣品瓶，裝液量為整個(gè)樣品瓶容積的1/3～1/2，并加入2 g氯化鈉，將固相微萃取頭插入樣品瓶中，45 ℃萃取45 min，在溫度為270 ℃的氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣口中解吸5 min，進(jìn)樣分析。

氣相色譜（GC）條件：HP-INNOWAX MS型色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣為氦氣（He），流速1 mL/min；柱溫起始為50 ℃，保持5 min，以6 ℃/min升溫至160 ℃，保持3 min，再以20 ℃/min升溫至230 ℃；不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜（MS）條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，發(fā)射電流為200 μA，離子源溫度為230 ℃，四級(jí)桿150 ℃，全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍50～550 amu，無(wú)溶劑延遲。

定性分析方法：經(jīng)過(guò)分析得到的圖譜和美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，保留下匹配度＞80%的組分。

定量分析方法：采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量，進(jìn)行定量分析

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，使用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)為平均值±sd，使用軟件OriginPro 2016繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三白瓜酒的發(fā)酵速率及酵母生長(zhǎng)曲線

發(fā)酵酒釀造過(guò)程中，酵母菌除了利用糖進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖外，還通過(guò)胞內(nèi)酶的作用把可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化成酒精等物質(zhì)[9]。酵母發(fā)酵速率及糖的轉(zhuǎn)化率是評(píng)價(jià)發(fā)酵酒主發(fā)酵進(jìn)程及發(fā)酵產(chǎn)品綜合品質(zhì)[10]的主要參數(shù)。

三白瓜酒發(fā)酵過(guò)程中CO2失重及酵母生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖1，

圖1 酵母菌株B和E在三白瓜汁中發(fā)酵CO2失重及酵母生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)曲線

如圖1所示，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到第2 d和第3 d時(shí)，商業(yè)酵母E和實(shí)驗(yàn)室保藏酵母B分別開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，酵母數(shù)為1.52×109CFU/mL（E）和1.47×109CFU/mL（B）。CO2失重分別在第1.0 d（E）和第1.5 d（B）達(dá)到最大值，發(fā)酵至第6 d后，CO2失重穩(wěn)定在0.2 g/400 mL以下，基本達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)室保藏酵母和商業(yè)酵母在三白瓜汁中都表現(xiàn)出了較好的發(fā)酵性能，本研究所選用的兩株酵母可以用于三白瓜酒的發(fā)酵。

2.2 三白瓜酒發(fā)酵過(guò)程糖消耗及酒精產(chǎn)生的變化

三白瓜酒發(fā)酵過(guò)程中糖及酒精動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖2。

圖2 酵母菌株B和E在三白瓜汁中發(fā)酵糖消耗及酒精產(chǎn)生動(dòng)態(tài)曲線

如圖2所示，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到第2 d和第3 d時(shí)，商業(yè)酵母E和B的糖消耗速率和酒精生成速率加快，發(fā)酵至第6 d時(shí)，發(fā)酵液中的葡萄糖含量為0.37 g/L（B）和0.3 g/L（E），果糖含量為2.03 g/L（B）和1.05 g/L（E），未檢出蔗糖。兩種酵母發(fā)酵的三白瓜酒總糖含量低于4 g/L，滿足干型果酒標(biāo)準(zhǔn)要求（NY/T 1508—2017）[11]及干型葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)要求（GB 15037—2006）[12]。發(fā)酵至第6 d時(shí)，發(fā)酵基本結(jié)束，最終產(chǎn)生的酒精濃度為5.96%（E），5.5%（B）。結(jié)果顯示，成分調(diào)整后的三白瓜汁適于酵母發(fā)酵釀造三白瓜酒。

2.3 三白瓜酒酸度及有機(jī)酸的含量

酸度對(duì)發(fā)酵酒品質(zhì)有直接影響，合適的酸度及不同的有機(jī)酸含量對(duì)酒體平衡以及滋味起著重要作用[13]。三白瓜酒酸度（酒石酸計(jì)）及有機(jī)酸的含量見(jiàn)表1。

表1 三白瓜酒酸度及有機(jī)酸的含量

如表1所示，發(fā)酵結(jié)束后，三白瓜酒酸度為5.06 g/L（B），5.30 g/L（E）。同時(shí)三白瓜酒釀造過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生少量琥珀酸、乳酸和乙酸。琥珀酸濃度分別為0.19 g/L（B），0.20 g/L（E），乳酸濃度分別為0.63 g/L（B）和0.76 g/L（E）。兩種酵母發(fā)酵的三白瓜酒中乙酸的含量都低于果酒標(biāo)準(zhǔn)要求（NY/T 1508—2017）[11]及葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)要求（GB 15037—2006）[12]。琥珀酸、乳酸和乙酸不存在于三白瓜中，是酵母在生長(zhǎng)和發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物[14]。兩種酵母發(fā)酵的三白瓜酒中都檢出了琥珀酸、乳酸和乙酸，雖然含量不高，但對(duì)酒的酸味和酒體的穩(wěn)定性有重要影響[15]。

2.4 三白瓜酒香氣成分檢測(cè)

發(fā)酵酒釀造過(guò)程中，酵母可將原料中原有的成分轉(zhuǎn)化入酒體中，同時(shí)生成新的物質(zhì)，形成不同發(fā)酵酒的獨(dú)特風(fēng)味[16]。兩種三白瓜酒的香氣成分分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 三白瓜酒香氣成分分析

續(xù)表2

如表2所示，兩種三白瓜酒中共鑒定出47種香氣成分。實(shí)驗(yàn)室保藏酵母B發(fā)酵酒中檢測(cè)出36種，其中酯類14種，占33.51%；醇9種，占42.58%；酸3種，占7.62%。商業(yè)酵母E發(fā)酵酒中檢測(cè)出37種，其中酯類11種，占23.08%；醇8種，占52.97%；酸三種，占0.93%。

酯類物質(zhì)是通過(guò)酸和醇酯化反應(yīng)或者酵母代謝產(chǎn)生的，不同的酵母菌株細(xì)胞內(nèi)具有不同的酯酰輔酶A的活性[17]。辛酸乙酯、月桂酸乙酯和乙酸異戊酯賦予酒體水果香氣，癸酸乙酯具有椰子香氣。酵母B發(fā)酵酒中這4種酯類物質(zhì)相對(duì)含量為7.54%、1.94%、1.76%和3.26%，酵母E發(fā)酵酒為4.10%、3.74 %、0%和5.24%。因此，兩種酵母都可在三白瓜酒釀造過(guò)程中形成風(fēng)味較好的酯類化合物，酵母B在產(chǎn)酯類風(fēng)味物質(zhì)方面相對(duì)優(yōu)勢(shì)更大。

兩種發(fā)酵酒中的醇類物質(zhì)主要是乙醇，另外還檢測(cè)出異丁醇、異戊醇、苯乙醇和橙花叔醇和(±)-2-甲基-1-丁醇。苯乙醇和橙花叔醇可賦予酒愉快的花香味，酵母B發(fā)酵酒中苯乙醇和橙花叔醇的相對(duì)百分含量分別為3.79%和0.71%，酵母E發(fā)酵酒中為5.63%和1.12%。

兩種發(fā)酵酒中均檢出了乙酸、癸酸兩種酸，相對(duì)含量分別為0.17%和1.58%（B），0.31%和0.36%（E）。乙酸有強(qiáng)烈的酸味，癸酸具有愉快的脂肪氣味，它們?cè)诰凭嬃现械暮恐饕Q于所應(yīng)用的菌株[18]。酵母B發(fā)酵酒中還檢測(cè)出了具有水果香味的辛酸，相對(duì)含量為5.67%，這些有機(jī)酸對(duì)三白瓜酒的風(fēng)味有積極的貢獻(xiàn)。

色、香、味是構(gòu)成發(fā)酵酒的三要素，香氣成分的分子種類、含量、相互之間的比例及人們的感覺(jué)閾值決定了發(fā)酵酒的香味[19]。發(fā)酵酒發(fā)酵過(guò)程中，由于酵母菌株本身之間存在的差異，也將使發(fā)酵酒風(fēng)味物質(zhì)含量有所差異。香氣成分分析發(fā)現(xiàn)本研究使用酵母B發(fā)酵酒醇酯比為1.27，酵母E發(fā)酵酒醇酯比為2.30，感官品評(píng)兩種發(fā)酵酒，雖有差異，但都具有典型的三白瓜風(fēng)味，酒體相對(duì)協(xié)調(diào)。

3 結(jié)論

本研究以山西產(chǎn)三白瓜為主要原料，利用實(shí)驗(yàn)室保藏的釀酒酵母和商業(yè)釀酒酵母，研究三白瓜發(fā)酵酒釀造工藝，測(cè)定了三白瓜酒釀造過(guò)程中的理化指標(biāo)并分析了三白瓜酒中的香氣成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種酵母釀造的三白瓜酒，雖然香氣成分有差異，但兩種酵母都可以充分將三白瓜中的糖分轉(zhuǎn)化為酒精，代謝產(chǎn)生少量發(fā)酵酸。感官品評(píng)三白瓜發(fā)酵酒，酒體較協(xié)調(diào)并具有濃郁的三白瓜果香。本研究所選用的酵母可用于三白瓜果酒的釀造，配合使用部分玉米深加工產(chǎn)品——淀粉糖漿，可開(kāi)發(fā)低酒精度的三白瓜發(fā)酵酒飲料，豐富三白瓜產(chǎn)品，提高三白瓜應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值。