降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇直投菌劑發(fā)酵制備工藝研究及初步應(yīng)用

杜 穩(wěn)，常曉嬌，趙一凡，管玉龍，孫長(zhǎng)坡，劉虎軍

（1.國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京，100037；2.安徽古井貢股份有限公司，安徽省 亳州，236800）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）又名嘔吐毒素，是一種單端孢霉烯族毒素，主要是由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產(chǎn)生的一種劇毒次級(jí)代謝產(chǎn)物。谷類作物在生長(zhǎng)、收割、倉(cāng)儲(chǔ)，加工、運(yùn)輸、銷售等諸多環(huán)節(jié)均可能發(fā)生霉變，從而產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[1-2]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇一方面使飼料行業(yè)蒙受巨大損失，另一方面，可導(dǎo)致畜禽食欲廢絕、發(fā)育受阻、代謝紊亂、免疫失調(diào)，造成母畜不孕、孕畜流產(chǎn)，胎兒異常等繁殖性能障礙，對(duì)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重破壞[3-5]。目前，DON的脫除方法有吸附法、紫外法、生物降解法等，而生物降解法可通過(guò)微生物釋放胞外酶作用于DON，使其轉(zhuǎn)化為低毒或無(wú)毒的代謝產(chǎn)物，具有徹底，無(wú)二次污染的特點(diǎn)。程亮等[6]通過(guò)篩選得到可以降解DON的假單孢菌，徐劍宏等[7]通過(guò)篩選得到可以降解DON的德沃斯氏菌，李曉鳳等[8]通過(guò)篩選得到降解DON的腸桿菌，譚劍等[9]通過(guò)篩選鑒定得到一株枯草芽孢桿菌可有效降解DON。由此可見(jiàn)，生物降解法因其具有高效針對(duì)性，環(huán)境友好性等特點(diǎn)，正廣泛受到關(guān)注。

枯草芽孢桿菌是在自然界中廣泛存在的一種好氧性產(chǎn)芽孢桿菌[10］，它具有很強(qiáng)的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等酶活性，代謝旺盛，對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境，是很好的生物防控菌。芽孢具有耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑等多種抗逆性，在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的過(guò)程中，需要提高芽孢的生成率，以保證后期產(chǎn)品的活性，郭夏麗，王法富等[11-12]通過(guò)搖瓶對(duì)產(chǎn)芽孢的培養(yǎng)基和發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了初步優(yōu)化，確定培養(yǎng)基配方和搖瓶發(fā)酵參數(shù)，但缺乏系統(tǒng)的發(fā)酵罐制備工藝研究。芽孢一般被加工成菌劑并且應(yīng)用于多種領(lǐng)域，曹丁等[13]用產(chǎn)抗菌肽芽孢桿菌的菌劑作為飼料添加劑應(yīng)用于仔豬生產(chǎn)，減少仔豬腹瀉，提高斷奶仔豬的成活率；劉年浪等[14]用枯草芽孢桿菌菌劑應(yīng)用于黃瓜枯萎病防治，使黃瓜顯著增產(chǎn)；肖偉等[15]將枯草芽孢桿菌菌劑應(yīng)用于小麥種子貯藏，在一定程度上抑制了真菌病害對(duì)小麥的污染。目前，對(duì)芽孢桿菌直投發(fā)酵劑制備工藝進(jìn)行研究并應(yīng)用于糧食副產(chǎn)物的真菌毒素生物降解，鮮有報(bào)道。

在前期的工作中，我們篩選鑒定得到一株可以高效降解DON的枯草芽孢桿菌ASAG-35，并對(duì)其進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化，通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)等確定了該降解菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。在該工作的基礎(chǔ)上，本文在發(fā)酵罐中對(duì)該DON降解菌ASAG-35產(chǎn)芽孢發(fā)酵制備工藝進(jìn)行研究，從而提高枯草芽孢桿菌的芽孢總量和芽孢率，并將該菌制作成直投發(fā)酵菌劑，初步應(yīng)用于污染糧食中DON毒素的降解，為開(kāi)展該菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種與培養(yǎng)基

降解DON枯草芽孢桿菌ASAG-35由本實(shí)驗(yàn)室提供。

活化培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂2 g/L。

種子培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：小麥麩皮5 g/L，玉米粉3 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，硫酸錳0.2 g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基配方通過(guò)優(yōu)化獲得[16]。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：糖蜜2～20 g/L。

菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂2 g/L。

單物料培養(yǎng)基：玉米、小麥加工副產(chǎn)物物料150 g，物料通過(guò)外加DON毒素，將DON含量設(shè)置為（3 000±50）μg/kg，加水定容到1 L，調(diào)節(jié)pH到6.5，121 ℃滅菌20 min。玉米或小麥副產(chǎn)物液態(tài)物料直接使用，調(diào)節(jié)pH到6.5，121 ℃滅菌20 min。

復(fù)合物料培養(yǎng)基：復(fù)合物料（玉米皮∶蛋白粉∶玉米胚∶玉米稀漿=2∶5∶3∶1）150 g，物料通過(guò)外加DON毒素，將DON含量設(shè)置為（3 000±50）μg/kg，加水定容到1 L，調(diào)節(jié)pH到6.5，121 ℃滅菌20 min。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BLBIO-5GJG-4-H型發(fā)酵罐：上海百侖生物科技有限公司；SW-CJ-2F型無(wú)菌工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PYL-125型培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；EVOLUTION-300型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)THERMO FISHER SCIENTIFIC；Waters e2695高效液相色譜：美國(guó)WATERS；YC-015小型噴霧干燥機(jī)：上海雅程儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化與種子液的制備

將保藏于-80 ℃冰箱的枯草芽孢桿菌菌種取出，室溫解凍后在活化培養(yǎng)平皿上進(jìn)行三區(qū)劃線復(fù)蘇，37 ℃培養(yǎng)16 h。將復(fù)蘇的枯草芽孢桿菌單菌落轉(zhuǎn)劃到新的活化培養(yǎng)基平皿上，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單菌落接到種子培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)16 h，獲得種子液。

1.3.2 5 L自動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng)

5 L發(fā)酵罐按照70%的體積比裝液，調(diào)節(jié)pH到7.0，將培養(yǎng)好的種子液以10%(v/v)的量接入5 L發(fā)酵罐，初始發(fā)酵條件為溫度37 ℃，風(fēng)量0.2 vvm，轉(zhuǎn)速r≥300 r/min，溶氧DO≥30%，培養(yǎng)26 h。

1.3.3 影響產(chǎn)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)芽孢的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在初始發(fā)酵條件基礎(chǔ)上，設(shè)置不同的發(fā)酵溫度30、33、35、37、39 ℃，研究溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)芽孢的影響；設(shè)置不同的發(fā)酵pH值：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，研究pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)芽孢的影響；將葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、糊精、果糖、麥芽糖等作為補(bǔ)料碳源，研究其對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)芽孢的影響；設(shè)置不同補(bǔ)料碳源濃度，研究其對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)芽孢的影響；選擇最佳發(fā)酵溫度、pH以及補(bǔ)料碳源濃度，確定最適發(fā)酵時(shí)間。

1.3.4 發(fā)酵菌液濃度的測(cè)定

取發(fā)酵液，充分混勻后靜置10 min，取上層無(wú)顆粒雜質(zhì)的發(fā)酵液1 000 r/min離心20 s后取上層發(fā)酵液，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定發(fā)酵液的吸光度。

1.3.5 直投菌劑制作方法

將發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)為3.5，向其中加入20%（w/v）膨潤(rùn)土后充分?jǐn)嚢?，噴霧干燥機(jī)進(jìn)風(fēng)溫度160 ℃，出風(fēng)溫度70 ℃，風(fēng)速30 m3/h，以進(jìn)料量10 mL/min進(jìn)行噴霧干燥。

1.3.6 活菌數(shù)和芽孢數(shù)測(cè)定方法

活菌數(shù)計(jì)數(shù)方法參照周德慶[17]的《微生物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》中的方法。芽孢總數(shù)計(jì)數(shù)方法[18]：芽孢平板計(jì)數(shù)是在80 ℃水浴加熱20 min后用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)芽孢的形成量，芽孢率計(jì)算公式如下： 芽孢率% =芽孢數(shù)/ 活菌數(shù) ×100%。

1.3.7 DON測(cè)定方法

DON含量測(cè)定方法參照國(guó)標(biāo)法GB5009.111—2016[19]，高效液相色譜條件如下，色譜柱：C18（259 mm×4.6 mm，5 μm，xbridge）；流動(dòng)相：水/甲醇=80/20（v/v）；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm。DON降解率（%）=降解后培養(yǎng)基中DON含量/原培養(yǎng)基中DON含量×100%。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣品T檢驗(yàn)進(jìn)行分析，顯著性水平設(shè)定為0.05；3組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析的Duncan’s法進(jìn)行兩兩比較分析，顯著性水平分析同樣設(shè)定0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)芽孢的影響

不同溫度對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)有著不同的影響，5 L發(fā)酵罐接種10%，調(diào)節(jié)風(fēng)量0.2 vvm，轉(zhuǎn)速r≥300 r/min，溶氧DO≥30%，溫度分別設(shè)定30、33、35、37、39 ℃進(jìn)行發(fā)酵，枯草芽孢桿菌發(fā)酵生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1，發(fā)酵結(jié)束后活菌數(shù)和芽孢數(shù)見(jiàn)圖2。

圖1 不同溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

圖2 不同溫度對(duì)菌體產(chǎn)芽孢的影響

由圖1可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度低于37 ℃時(shí)，菌體濃度處于較低水平，當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃和39 ℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)狀況較好。值得關(guān)注的是在發(fā)酵對(duì)數(shù)期，溫度37 ℃時(shí)的菌體濃度高于39 ℃的菌體濃度，而在發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期后，溫度39 ℃的菌體濃度高于發(fā)酵溫度37 ℃的菌體濃度。由圖2可見(jiàn)，隨著溫度的增加，發(fā)酵液中的活菌數(shù)和芽孢數(shù)以及芽孢率均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，39 ℃的芽孢率為93.6%，顯著高于37 ℃芽孢率（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，37 ℃更有利于發(fā)酵對(duì)數(shù)期菌體的生長(zhǎng)，39 ℃更有利于發(fā)酵平穩(wěn)期芽孢的形成。

2.2 發(fā)酵pH對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)芽孢的影響

不同pH對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)有不同影響，5 L發(fā)酵罐接種10%，調(diào)節(jié)風(fēng)量0.2 vvm，轉(zhuǎn)速r≥300 r/min，溶氧DO≥30%，溫度37 ℃，pH分別設(shè)置為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0進(jìn)行發(fā)酵，枯草芽孢桿菌發(fā)酵生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3，發(fā)酵結(jié)束后活菌數(shù)和芽孢數(shù)見(jiàn)圖4。

由圖3可見(jiàn)，當(dāng)pH為6.0和8.0，枯草芽孢桿菌的濃度均處于較低水平，pH為7.0時(shí)，枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)狀況最好，菌體濃度OD600可以達(dá)到3.5。由圖4可見(jiàn)，pH為7.5時(shí)，菌體數(shù)量雖然低于pH 7.0的菌體數(shù)量，但是芽孢數(shù)量和芽孢率均高于pH 7.0的芽孢率。由此可見(jiàn)，pH 7.0雖然有利于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)，但是不利于芽孢的生成，而將pH設(shè)置為7.5，可以很好的將菌體轉(zhuǎn)化為芽孢，提高芽孢生成率。

圖3 不同pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

圖4 不同pH對(duì)菌體產(chǎn)芽孢的影響

2.3 補(bǔ)料碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)芽孢的影響

以發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照，以添加2%不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵。以5%的接種量接到250 mL搖瓶中（裝液50 mL），在轉(zhuǎn)速220 r/min、溫度37 ℃、pH自然條件下培養(yǎng)24 h后檢測(cè)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)芽孢能力，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 碳源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

由圖5可見(jiàn)，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)照組活菌數(shù)為3×109CFU/mL，當(dāng)添加葡萄糖、果糖、淀粉和糊精作為碳源時(shí)，枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)無(wú)顯著變化（P＞0.05）或有所降低，說(shuō)明該枯草芽孢桿菌不能有效利用這些碳源，而添加蔗糖、糖蜜和麥芽糖作為碳源，均可以顯著提高（P＜0.05）枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)，而糖蜜效果顯著性最強(qiáng)，總活菌數(shù)和芽孢數(shù)分別為8.1×109CFU/mL和7.8×109CFU/mL，芽孢率為96.3%，所以應(yīng)將糖蜜作為補(bǔ)料碳源，以提高枯草芽孢桿菌發(fā)酵的總活菌數(shù)和芽孢產(chǎn)率。

將枯草芽孢桿菌以10%的接種量接到5 L發(fā)酵罐中，風(fēng)量0.2 vvm，轉(zhuǎn)速r≥300 r/min，溶氧DO≥30%，溫度37 ℃，pH 7.0，發(fā)酵培養(yǎng)12 h后采用一次性補(bǔ)料，分別添加2、5、10、15 g/L的糖蜜，在發(fā)酵36 h后檢測(cè)總活菌數(shù)和芽孢數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同糖蜜添加量對(duì)菌體產(chǎn)芽孢的影響

由圖6可見(jiàn)，隨著糖蜜添加量的增加，活菌數(shù)和芽孢數(shù)也逐漸增加，當(dāng)一次性補(bǔ)加10 g/L糖蜜時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后活菌數(shù)和芽孢數(shù)均為最高，分別為2.0×1010CFU/mL和1.89×1010CFU/mL，芽孢率為94.5%，當(dāng)補(bǔ)加15 g/L糖蜜時(shí)，活菌數(shù)和芽孢數(shù)均顯著下降（P＜0.05），由此可見(jiàn)，10 g/L的糖蜜添加量最有利于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和芽孢的生成。

2.4 最佳發(fā)酵策略的確定

5 L發(fā)酵罐接種10%，調(diào)節(jié)風(fēng)量0.2 vvm，轉(zhuǎn)速r≥300 r/min，溶氧DO≥30%，發(fā)酵pH全程控制在7.5，37 ℃發(fā)酵12 h后提高溫度到39 ℃直至發(fā)酵結(jié)束，且在第12 h一次性補(bǔ)加10 g/L的糖蜜，從第12 h開(kāi)始，每隔3 h取樣，檢測(cè)活菌數(shù)和芽孢產(chǎn)量，并確定最佳發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)，發(fā)酵結(jié)果如圖8所示。

圖7 枯草芽孢桿菌在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵結(jié)果

由圖7可見(jiàn)，隨著時(shí)間的增加，活菌數(shù)量逐漸增加，發(fā)酵15 h后，芽孢數(shù)成對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，活菌數(shù)和芽孢數(shù)持續(xù)增長(zhǎng)到30 h且達(dá)到最大值，分別為3.0×1010CFU/mL和2.9×1010CFU/mL，芽孢率為96.7%，隨后活菌數(shù)和芽孢率均有所下降，說(shuō)明發(fā)酵已經(jīng)到達(dá)菌體生長(zhǎng)末期，所以應(yīng)在30 h停止發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，在發(fā)酵對(duì)數(shù)前期設(shè)置溫度37 ℃提高總活菌數(shù)，在發(fā)酵對(duì)數(shù)中后期提高溫度至39 ℃刺激芽孢生成，并一次性補(bǔ)加糖蜜，延長(zhǎng)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)周期，增加活菌總量和芽孢量，效果較好。

2.5 直投菌劑在糧食加工副產(chǎn)物DON降解中的初步應(yīng)用

將發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)為3.5，向其中加入20%（w/v）的膨潤(rùn)土并充分?jǐn)嚢?，噴霧干燥機(jī)進(jìn)風(fēng)溫度160 ℃，出風(fēng)溫度70 ℃，風(fēng)速30 m3/h，以進(jìn)料量10 mL/min進(jìn)行噴霧干燥，制成直投菌劑，菌劑生物量≥1 000億/g，含水量≤5%。

2.5.1 直投菌劑降解不同糧食加工副產(chǎn)物中的DON

直投菌劑以0.2%（w/v）的接種量接到物料培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)15 h，取樣烘干測(cè)定物料中DON含量，降解效果如圖8所示，該直投菌劑在玉米稀漿和復(fù)合物料中的降解效果較好，降解率均在90%以上，DON殘留量在500 μg/kg以下；在小麥麩皮、玉米皮、玉米蛋白粉和玉米胚芽中的降解效果相對(duì)減弱，但降解率也在50%以上，其原因可能是物料中的營(yíng)養(yǎng)成分以單一碳源或氮源為主，菌體生長(zhǎng)狀態(tài)沒(méi)有復(fù)合物料生長(zhǎng)狀態(tài)好；而降解菌在玉米濃漿中的降解效果較差，DON降解率低于10%，分析其原因可能是在玉米漿中無(wú)機(jī)鹽含量較高，不利于該芽孢桿菌的生長(zhǎng)。該菌在糧食加工副產(chǎn)物DON發(fā)酵降解的應(yīng)用中效果較好，具有較廣泛的應(yīng)用前景。

圖8 直投菌劑降解不同物料中的DON

2.5.2 直投菌劑接種量對(duì)糧食加工副產(chǎn)物DON降解的影響

分別將直投菌劑以0.01%、0.1%、0.5%、1%的接種量接到復(fù)合物料培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)15 h，取樣烘干測(cè)定物料中DON含量，DON降解率如圖9所示，隨著直投菌劑接種量的增加，DON的降解率也隨之增加，當(dāng)菌劑接種量為0.01%，DON的降解率為62.2%，當(dāng)添加量為0.1%時(shí)，降解率為92.7%，添加0.5%和1%時(shí)，DON降解率分別為96.3%和98.8%。接種量在0.1%以上時(shí)，DON降解率均達(dá)到90%以上，DON殘留量在500 μg/kg以下，說(shuō)明0.1%以上的菌劑接種量可以較好地降解物料中的DON。

圖9 直投菌接種量對(duì)物料中的DON降解的影響

2.5.3 物料培養(yǎng)基中不同干物質(zhì)含量對(duì)菌劑降解糧食加工副產(chǎn)物DON的影響

分別將直投菌劑以0.1%接種量接到不同干物質(zhì)含量的復(fù)合物料培養(yǎng)基中，置于30 ℃，220 r/min條件下發(fā)酵15 h，取樣烘干測(cè)定物料中DON含量，結(jié)果如圖10所示，當(dāng)物料培養(yǎng)基干物質(zhì)含量在20%以下時(shí)，DON降解效果較好，降解率均在90%以上，DON殘留量在500 μg/kg以下，當(dāng)干物質(zhì)含量為30%時(shí)，降解率顯著降低（P＜0.05），降解率為55.1%，并且隨著物料培養(yǎng)基中干物含量的增加，降解率隨之下降，分析其原因，物料培養(yǎng)基中干物含量高，導(dǎo)致溶氧不足，降解菌只能在初期生長(zhǎng)后便無(wú)法繼續(xù)增殖，從而無(wú)法有效地降解物料中的DON。由此可見(jiàn)，物料培養(yǎng)基中水分含量高，更有利于降解菌發(fā)揮作用。

圖10 不同干物質(zhì)含量的物料培養(yǎng)基對(duì)直投菌劑降解DON的影響

3 討論

孫梅、宋卡魏等[20-21]的研究中表明高溶氧有利于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和芽孢的生成，所以在本研究中，將溶氧控制在30%以上，而以發(fā)酵溫度、pH、補(bǔ)料碳源及補(bǔ)料量等作為優(yōu)化條件研究其對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢的影響。在郭夏利、王法富等[11-12]的研究中，主要研究搖瓶中初始pH對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢的影響，未對(duì)整體發(fā)酵的pH進(jìn)行監(jiān)控，而本研究結(jié)果表明，當(dāng)全程pH控制在7.5，更有利于芽孢的生成，提高芽孢產(chǎn)率。通過(guò)分階段控溫發(fā)酵，即在發(fā)酵前12 h的對(duì)數(shù)期將溫度控制在37 ℃，利于菌體生長(zhǎng)，而12 h后將溫度調(diào)高到39 ℃，更有利于枯草芽孢桿菌生成芽孢，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果有所區(qū)別[20-21]。此外，在本研究中整體發(fā)酵時(shí)間均少于報(bào)道中[22-23]的發(fā)酵時(shí)間，更加利于工業(yè)生產(chǎn)縮短發(fā)酵周期，降低工業(yè)能耗。

速效碳源有利于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)[24]，但是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等碳源對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢的影響不大，這與郭榮君等[25]的部分研究成果相一致。在本研究中，將糖蜜作為補(bǔ)料碳源添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，總活菌數(shù)和芽孢生成率均顯著提高。糖蜜作為復(fù)合碳源，其中含有豐富的生物素和礦物質(zhì)，而其是促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)的重要物質(zhì)，這也從側(cè)面說(shuō)明了糖蜜既可以促進(jìn)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)又可以促進(jìn)芽孢的生成。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的存在一直危害著糧油加工、飼料生產(chǎn)及畜牧行業(yè)，使這些行業(yè)蒙受著巨大的損失，而枯草芽孢桿菌菌劑正在被這些行業(yè)廣泛地應(yīng)用。本研究利用發(fā)酵罐對(duì)降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇直投菌劑發(fā)酵制備工藝進(jìn)行研究并獲得最佳發(fā)酵策略，增加了芽孢生產(chǎn)率，并且將該菌劑初步應(yīng)用于污染糧食加工副產(chǎn)物中DON的脫除，效果顯著，減少真菌毒素給這些行業(yè)帶來(lái)的困擾。