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    低溫等離子快速提高糖基化花生分離蛋白溶解性及乳化性

    2020-07-22 14:37:36
    農業(yè)工程學報 2020年11期
    關鍵詞:糖基化接枝等離子

    季 慧

    (臨沂大學生命科學學院,臨沂 276000)

    0 引 言

    花生蛋白因其功能性質較差,嚴重阻礙了花生蛋白在食品工業(yè)中的應用。國內外科學家研究多種方法對花生蛋白進行改性以提高其功能性質,包括酶解、高壓處理、超聲波處理和微波處理。但這些方法存在耗時長、副產物產生周期短、效果有限、對環(huán)境造成污染、容易引起安全隱患等缺點。蛋白質和多糖的共價交聯(糖基化)作為一種安全、無健康危害的蛋白改性方法,近年來,越來越受到科學家的關注。蛋白糖基化是指蛋白和多糖通過美拉德反應形成共價鍵[1],研究表明,蛋白質糖基化可以改變蛋白質的溶解度、熱穩(wěn)定性、乳化性、界面性質、抗菌活性、膠凝性能、蛋白質的三級和二級結構[2-6]。其反應實質為蛋白質的ε-NH2與多糖分子上的還原末端羰基之間的反應。蛋白質與糖接枝改性一般分為濕熱法和干熱法兩種,但是,兩種方法反應時間較長,特別是干法反應,少則數十小時,多則幾天甚至幾周,傳統(tǒng)濕熱反應需要24 h 以上,能耗較高,不利于商品的產業(yè)化[5-7]。因此,尋求一種加速花生蛋白質與多糖的接枝技術與方法是提高花生蛋白應用于食品工業(yè)生產的關鍵問題。

    低溫等離子體(Non-Thermal Plasma,NTP)是一種新興的、快速的、非熱的、無害的技術,它由大量高能電子和活性自由基組成,包括原子氧(O)、超氧化物(O2?-)、一氧化氮(·NO)、羥基自由基(·OH)等,這些粒子結合在一起可以打破共價鍵,引發(fā)各種化學反應。NTP 越來越受到人們的關注,已被應用于修飾表面生物大分子,包括乳清蛋白、小麥粉、玉米蛋白、大米蛋白、肌原纖維蛋白、花生蛋白等[8-13]。結果表明NTP可以在幾分鐘內改變蛋白質的三級和二級結構,蛋白結構變松散,進而影響蛋白質的理化和功能特性。還有一些研究結果表明,蛋白質的糖基化與蛋白質三級結構的破壞程度密切相關[14-15]。等離子產生的高能粒子通過能量傳質于蛋白表面,使其產生刻蝕作用,引發(fā)蛋白表面的化學鍵斷裂,降低蛋白表面自由能,為蛋白表面的接枝反應提供大量的接枝位點,同時等離子產生的活性自由基也能引發(fā)單體的接枝聚合,能夠對材料表面進行持久改性,有研究表明,等離子體已經成功應用于高分子材料表面接枝[16-18]。這些研究成果為蛋白-多糖接枝反應提供理論基礎。

    針對前人的研究結果中花生分離蛋白-葡聚糖反應條件復雜,接枝時間長,難于應用于實際生產中的特點,本研究采用低溫等離子處理花生分離蛋白-葡聚糖混合溶液,旨在探索蛋白-多糖的快速糖基化反應方法,評價不同NTP 處理時間對花生蛋白分離-葡聚糖(Peanut Protein Isolate-Dextran,PPI-Dex)偶聯物結構和理化性質的影響。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE)、傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared,FTIR)、自動氨基酸分析儀、熒光分析儀、Turbiscan 等儀器表征和分析PPI-Dex 偶聯物的分子量、二級結構和熱穩(wěn)定性、溶解性及穩(wěn)定性等的變化。研究的結果可為蛋白質糖基化反應提供一種快速、安全、方便的技術,同時為制備高親水性食品配料提供一種新的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    花生分離蛋白(Peanut Protein Isolate,PPI)是實驗室采用堿溶酸沉法從低溫脫脂花生蛋白粉中提取,PPI 粉中蛋白質質量分數為83.0%(濕基,凱氏常數:5.46)、脂肪1.56%、總糖5.67%、水分7.92%、 灰分1.85%。血清白蛋白購買于華美生物工程有限公司。賴氨酸、o-鄰苯二甲醛(OPA)、β-巰基乙醇、二硫代二硝基苯甲酸、三羥甲基氨基甲烷等試劑均為分析純級。

    1.2 儀器與設備

    DBD-50 低溫等離子體設備,南京蘇曼等離子科技有限公司;Ultra-Turrax T25 高速乳化剪切機,德國IKA 公司;E-201-C-9 紫外分光光度計,上海羅素科技有限公司;DY-6C 電泳儀,北京六一儀器廠;NicoletiS50 傅立葉變換紅外光譜,美國賽飛世爾科技有限公司;F-4500 熒光分光光度計,日本HITACHI 公司;日立L-8900 全自動氨基酸分析儀;DSC-60A 差示掃描量熱儀,日本SHIMADZU 公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 共價交聯產物的制備

    用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Solution,PBS)(pH 值=7.0)配成1 g/mL 的PPI-Dex(PPI:Dex=1∶1,體積比)溶液,充分溶解混合后,10 000 r/min,1 min 剪切,同時參照Li 等[19]研究結果將溶液加熱至60 ℃,取10 mL PPI-Dex 溶液放入介質阻擋DBD-50 反應器中處理,輸入電壓為35 V,不斷調節(jié)電流使其穩(wěn)定在(2±0.02)A,即處理功率為70 W,處理時間為0、0.5、1.5、2.0、3.0 min;處理后的樣品,于4 ℃透析24 h后真空冷凍干燥 (干燥室真空度0.09 MPa,溫度-40 ℃),得到PPI-Dex 交聯物,備用。

    1.3.2 接枝度測定

    采用OPA 法測定糖基化反應的接枝度。參照Vigo等[20]和Chen 等[5]的方法制備試劑及步驟,以賴氨酸為標準物,利用下列公式(1)計算接枝度(Degree of Graft,DG)

    式中A0為PPI-Dex 混合物中游離氨基酸的濃度,mmol/L;At為PPI-Dex 接枝物中游離氨基酸的濃度,mmol/L;A1:PPI 中游離氨基酸的濃度,mmol/L。

    1.3.3 溶解度測定

    采用雙縮脲法測定蛋白含量[21],取1.00 g 低溫等離子處理后的PPI-Dex 交聯物溶于100 mL 0.1 mol/L 的PBS (pH 值=7)中充分溶解后,于3 000 r/min 下離心15 min(備用)。取1 mL 上清液加入4 mL 雙縮脲試劑,旋渦充分混合。反應30 min 后,在540 nm 下測定溶液的吸光度,不添加樣品為空白。

    1.3.4 溶液穩(wěn)定性測定

    用0.1 mol/L的PBS緩沖液(pH值7.0)配制成20 mg/mL的PPI-Dex 溶液,使溶液與大豆油以2∶3 的體積比混合后,以10 000 r/min 轉速,均質2 min 得到PPI-Dex 乳狀液。采用分散穩(wěn)定性分析儀對花生分離蛋白的乳狀液的穩(wěn)定性進行分析,在室溫(25 ℃)下每0.5 h 掃描1 次,連續(xù)掃描6 h。乳液穩(wěn)定性指數(Turbiscan Stability Index,TSI)按公式(2)計算

    式中Xi為每分鐘測量的樣本背向散射,XBS為Xi的均值,n 為掃描次數。

    1.3.5 氨基酸測定

    樣品處理:取0.200 0 g NTP處理前后的樣品于20 mL水解管中,加入6 mol/L 濃鹽酸10 mL、,真空脫氣10 min,充氮封管,在110 ℃下水解22 h。取出冷卻后用去離子水無損轉移到50 mL 的容量瓶中定容。準確取1 mL 水解液于蒸餾瓶中,于真空旋轉蒸發(fā)儀水浴脫酸抽干(水浴溫度40 ℃,真空度0.01 MPa),加1 mL 水再抽干,然后加入10 mL,0.02 mol/L 鹽酸充分溶解,備用。樣品過0.22 μm 的水相濾膜后上機分析[22]。

    1.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

    采用還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)方法鑒定低溫等離子處理前后花生蛋白中亞基的變化情況[23]。分離膠和濃縮膠的質量分數分別為12%和5%,樣品中加入1 mmol/L β-巰基乙醇。電泳后,蛋白膠用考馬斯亮藍R250 染色。

    1.3.7 熱穩(wěn)定性測定

    稱取粉末狀樣品3~5 mg 放置在坩堝中,壓樣密封,以空坩堝作為空白對照,放入差示掃描量熱儀中測量,掃描范圍為30~180 ℃,升溫速度為5 ℃/min。并采用TA-60WS 軟件計算樣品的變性溫度(Td)和焓變(?H)。

    1.3.8 傅里葉紅外光譜(Fourier Transform Infrared,FTIR)測定

    采用溴化鉀壓片法對樣品進行紅外光譜掃描。準確稱量1 mg 花生蛋白樣品,與150 mg 溴化鉀混合均勻,用研缽研磨成均勻粉末,利用壓片機將混合物壓成薄片。采用傅里葉紅外光譜儀對花生蛋白樣品進行全波段掃描,掃描波長為4 000~400 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描次數為32[24]。

    1.3.9 表面疏水性(Surface Hydrophobicity Index,H0)的測定

    采用 1-苯胺基-8-萘磺酸(1-anilinonaphthalene-8- sulfonic acid,ANS)熒光探針法[25],用 0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH 值=7.0)配制不同質量分數的樣品蛋白溶液(0.005%~0.2%)和8 mmol/L 的ANS 溶液。取20 μL ANS 溶液加到4 mL 蛋白溶液中,混合均勻,迅速測定混合液的熒光強度,激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為390 和470 nm,以熒光強度對蛋白質濃度作圖,直線斜率即為蛋白質樣品的表面疏水性指數(H0)。

    1.4 數據處理

    采用SPSS 統(tǒng)計軟件(Version 19.0,SPSS Inc.,Chicago,IL,USA),通過單因素方差分析(ANOVA)進行低溫等離子處理對花生分離蛋白-葡聚糖交聯物特性的顯著性檢驗,P<0.05 認為有顯著性差異。

    2 結果與分析

    2.1 接枝度和溶解度分析

    在加熱60 ℃的情況下,采用NTP 對PPI-Dex 混合物進行短時接枝處理,結果如表1 所示,從表看出,隨著NTP 處理時間的延長,PPI-Dex 接枝物的接枝度呈現先升高后略有下降的趨勢,在處理1.5 min 時,接枝度達最大為21.62%,與超聲波接枝PPI-Dex 需要40 min,傳統(tǒng)濕接枝需要24 h 相比[7],大大縮短了接枝時間。1.5 min 后,接枝度下降,其原因可能是由于高能粒子的持續(xù)轟擊,部分形成的糖苷鍵再次斷開,同時,由于高能粒子的活性物質氧化,使PPI 分子之間發(fā)生氧化聚合,導致PPI-Dex,PPI-PPI 發(fā)生競爭結合,故接枝度下降。

    蛋白質的溶解度是影響其功能性質的重要因素,由表1 可以看出,隨著NTP 處理時間的延長,蛋白溶解度呈現與接枝度相似的變化趨勢,在1.5 min 時,PPI 溶解度最高為4.17 mg/mL,與未處理樣品相比,PPI 溶解度提高了22.28 %,說明PPI 糖基化形成偶聯物后,提高了蛋白的溶解性。這種現象可能是由于PPI-Dex 偶聯物多糖的多羥基結構和Dextan 的立體效應增強了蛋白質與水分子之間的親和力[14]。同時,NTP 處理誘導蛋白結構被打開,包埋在蛋白分子內部的親水氨基酸殘基暴露,促使蛋白的親水性增加,溶解度升高。NTP 處理1.5 min 后,溶解度下降的原因可能是由于高能粒子的活性物質的氧化,蛋白因交聯而聚集沉淀,PPI 溶解度降低。

    表1 不同NTP 處理時間對PPI-Dex 接枝物接枝度和溶解度的影響 Table 1 Effects of different NTP treatment time on Degree of Graft (DG) and solubility of PPI-dextran conjugates

    2.2 乳液穩(wěn)定性分析

    圖1 顯示了不同等離子處理時間對PPI-Dex 接枝物乳液穩(wěn)定性(TSI)的影響,TSI 值越小,溶液乳化穩(wěn)定性越高。由圖1 可以看出,隨著貯藏時間的延長,乳狀液體系的TSI值均發(fā)生不同程度的增大。在貯藏時間0.5 h 內,等離子處理的樣品的TSI 值均低于未處理樣品,說明NTP 處理提高了PPI-DEX 接枝物的乳化活性。并且隨著等離子處理時間的延長,TSI 值逐漸降低,在NTP 處理1.5 min 時,TSI 值達最低為3.54,與未處理樣品5.18 相比,降低了31.67%。同時,隨著貯藏時間的延長,樣品的TSI 值均有不同程度的升高。等離子處理1.5 min 的樣品的TSI 值與其他樣品的TSI 值相比,均最低,說明DG 值越高,PPI-Dex 的乳化穩(wěn)定性高。

    圖1 PPI-Dex 接枝物乳狀液的穩(wěn)定性指數(TSI) Fig.1 Turbiscan Stability Index (TSI) of PPI-dextran conjugates emulsions

    2.3 SDS-PAGE 分析

    PPI-Dex 接枝產物的SDS-PAGE 如圖2 所示。由圖2可以看出,在60 ℃條件下,NTP 處理后PPI-Dex 接枝物發(fā)生糖基化反應后,在分離膠上端有較寬條帶出現,說明PPI-Dex 結合形成了分子量較大的糖蛋白復合物;NTP處理較短時間就發(fā)生糖基化反應,糖基化反應發(fā)生后,伴花生球蛋白Ⅱ(>61.0 kDa)、酸性花生球蛋白(40.5、37.5、35.5 kDa)的條帶顏色變淺、減少。此現象說明,在反應液60 ℃條件,NTP 處理能夠協同PPI 與Dex 發(fā)生共價接枝反應。

    圖2 不同NTP 處理時間下PPI-Dex 接枝物的SDS-PAGE 圖 Fig.2 SDS-PAGE of PPI-dextran conjugates treated by different NTP time

    2.4 氨基酸分析

    表2 列舉了在加熱60 ℃條件下,NTP 處理對PPI-Dex接枝物中氨基酸變化影響,由表2 可以看出,在60 ℃條件下,NTP 處理PPI-Dex 接枝物后,苯丙氨酸(Phe)和賴氨酸(Lys)相對含量顯著降低,說明等離子處理引起的蛋白的反應位點可能主要是Phe 和Lys,在一些報道中蛋白質發(fā)生糖基化時Lys 和Arg(精氨酸)相對含量明顯降低[26-27],而等離子處理后PPI 中Arg 的相對含量沒有降低,原因可能是由于等離子主要是表面處理,而Arg在PPI 表面分布較少的原因所致。

    2.5 DSC 分析

    表3 列舉了不同NTP 處理后PPI-DEX 接枝物的熱力學參數的變化,變性溫度(Td)反映了蛋白的熱穩(wěn)定性和聚集程度,焓值(ΔH)與蛋白的疏水相互作用有關[23]。從表3 可以看出,隨著NTP 處理PPI-Dex 接枝物時間的延長,Td值、ΔH 呈先降低后增加的趨勢,表明NTP 處理后,PPI 的熱穩(wěn)定性降低,分子間作用力減弱,PPI 聚集程度降低,活性基團被暴露,為PPI 與Dex 接枝提供反應位點。同時,由于Dex 分子含有大量羥基,親水性強,隨著接枝度增加,引入蛋白的羥基增多,PPI-Dex 接枝物的疏水作用減弱,親水作用增強,與表1 中的溶解度結果一致;處理2 min 后,隨著高能粒子的持續(xù)轟擊,蛋白之間發(fā)生交聯,分子聚集程度增加,Td值增加;同時,親水基團被包埋,ΔH 增加,親水作用減弱,疏水作用增強。

    表3 PPI-Dex 接枝物的熱力學參數 Table 3 Thermodynamic parameters of PPI-dextran conjugates

    2.6 FTIR 分析

    如圖3 展示了NTP 處理后PPI-Dex 接枝物的圖譜變化。一般來說,蛋白與糖共價結合后,典型的特征是羥基的增加,在紅外圖譜上一般表現在3 000~3 500 cm-1及1 000~1 260 cm-1處出現吸收[28]。隨著NTP 處理時間的延長,3 500~3 000 cm-1及1 260~1 000 cm-1處峰的吸收值逐漸增加,在處理1.5 min 時吸收峰值達最大,說明在此條件下,引入蛋白的羥基最多,PPI-Dex 接枝程度最大,該結果與表1 中處理1.5 min 時,PPI-Dex 接枝物的接枝度(DG)最大的結果相一致,同時,糖基化反應后,PPI 在1 537 和1 654 cm-1處的峰(未處理)偏移到1 539和1 656 cm-1處(1.5 min)(圖4),表明美拉德反應導致了Schiff 堿基的形成[29],進一步證實了PPI 與Dex 以共價鍵的形式相結合。

    圖3 NTP 處理對PPI-Dex 接枝物的紅外光譜影響 Fig.3 Effect of NTP treatment on FTIR of PPI-Dex conjugates

    圖4 NTP 處理1.5 min 與未處理時PPI-Dex FTIR 光譜圖變化比較 Fig.4 Comparison of FTIR spectra of untreated PPI-Dex mixture and the PPI-Dex conjugate treated by NTP for 1.5 min

    酰胺I 帶對蛋白質的二級結構相當敏感,選取紅外光譜中的酰胺Ⅰ帶(1 600~1 700 cm-1)進行分析,用Omnic 軟件用對蛋白質各二級結構進行定量分析。對應于二級結構的譜帶如下:1 650~1 670 cm-1對應于α-螺旋,1 610~1 640 cm-1對應于β-折疊,1 660~1 700 cm-1對應于β-轉角,1 640~1 650 cm-1對應于無規(guī)則卷曲。每個二級結構組分的百分比通過相應峰的面積來計算[30]。NTP 處理后PPI 二級結構變化結果如表4,由表中看出,NTP 處理0.5 min 與未處理相比,β-折疊含量增加,β-轉角含量降低,一般來說,β-折疊較穩(wěn)定,表面疏水;β-轉角在蛋白的表面,表面親水[31-32],結果表明,NTP 處理0.5 min 時,PPI 表面疏水性增強。隨著處理時間的延長,β-折疊、α-螺旋相對百分含量降低,無規(guī)則卷曲百分含量稍有下降,β-轉角含量增加;在1.5 min 時,β-折疊和α-螺旋含量最低,β-轉角含量最高。說明蛋白的有序結構被破壞,結構變松散,蛋白表面由疏水型向親水型轉變。

    表4 不同NTP 處理時間對PPI 二級結構的影響 Table 4 Effects of different NTP treatment time on secondary structure composition of PPI

    2.7 蛋白表面疏水性分析

    NTP處理前后PPI-Dex接枝物表面疏水性結果如圖5所示,Ho代表蛋白質表面與極性水環(huán)境接觸的疏水基團數量,Ho值越大,表明蛋白疏水性越強。有研究表明,疏水基團大部分隱藏于球蛋白質的內部區(qū)域[33]。等離子處理后,蛋白周圍結構變松散,埋藏在內部的疏水基團被暴露,蛋白表面疏水性增加,在處理0.5 min 時,蛋白表面疏水性高于未處理樣品,隨著NTP 處理時間的延長,接枝度增加,Dex 被引入的越來越多,由于Dex 分子包含的羥基多,親水強,蛋白表面親水基團增加,疏水基團被包埋,熒光探針ANS 無法與其結合,PPI 的 Ho降低,表面疏水性減弱。在處理1.5 min 時,接枝度最大,此時PPI 表面疏水性達最低,從4 839.3(0 min)降低到3 951.4(1.5 min),降低了30.86%?;ㄉ鞍妆砻媸杷缘闹饾u降低揭示了花生蛋白分子間疏水性相互作用的減少,親水性相互作用的增加,使得花生蛋白溶液親水性增加。處理1.5 min 后,隨著等離子處理時間的延長,可能由于活性物質的氧化使蛋白分子之間發(fā)生氧化聚合,被暴露的ε-氨基含量減少,接枝位點減少,PPI-Dex 接枝物接枝度降低,結合到蛋白表面的Dex 減少,羥基減少,蛋白表面親水性下降,表面疏水性增加,故Ho 值增加。

    圖5 不同NTP 處理時間對PPI-Dex 接枝物的疏水性指數(Ho)的影響 Fig.5 Effects of different NTP treatment time on surface hydrophobicity index (Ho) of PPI-dextran conjugates

    3 結 論

    低溫等離子體(Non-Thermal Plasma,NTP)處理可明顯加速蛋白質與多糖之間的糖基化反應。NTP 處理僅需1.5 min 即可達到21.62%的接枝度(Degree of Graft,DG),與超聲接枝PPI-dextran 40 min、傳統(tǒng)濕法接枝24 h 相比,NTP 縮短了接枝時間。具體結果為,在70 W 處理功率下,反應液溫度加熱到60 ℃,低溫等離子放電時間為1.5 min時,PPI-Dex 接枝度和溶解度達到最大,與未接枝相比,溶解度提高了22.28%。同時,PPI-Dex 的乳化穩(wěn)定性也得到提高,其TSI 值在貯藏時間為0.5 h 時,降低了31.67%。這是因為NTP 可以使PPI 的二級和三級結構展開,暴露PPI 的糖基化位點,賴氨酸和苯丙氨酸與葡聚糖接枝形成PPI-Dex偶聯物,其偶聯物由于多羥基的引入,表面疏水性降低。

    在后續(xù)研究中,將繼續(xù)對NTP 放電工藝參數進行優(yōu)化,為制備高親水PPI-Dex 偶聯物提供技術支持,同時,為采用NTP 技術快速制備其他高親水性蛋白食品配料提供理論參考。

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