• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的人乳鐵蛋白基因在山羊β-乳球蛋白基因座定點敲入

    2020-07-21 14:18:30宋紹征潘生強周鳴鳴
    中國農(nóng)業(yè)大學學報 2020年7期
    關(guān)鍵詞:基因座纖維細胞山羊

    宋紹征 張 婷 潘生強 陸 睿 成 勇* 周鳴鳴*

    (1.無錫太湖學院 護理學院, 江蘇 無錫 214000;2.揚州大學 獸醫(yī)學院/江蘇省轉(zhuǎn)基因動物制藥工程研究中心,江蘇 揚州 225009;3.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學院 制藥工程學院,江蘇 淮安 223003)

    近年來牛乳過敏癥體質(zhì)者日漸增多[1],因此研發(fā)改造不含致敏原的食用乳品至關(guān)重要。羊乳的成分更接近于人乳,可作為牛乳過敏體質(zhì)者最理想的替代乳品[2]。研究表明山羊乳中β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是引起人體過敏反應的主要致敏原,且酶水解、加熱和糖基化處理也很難消除其致敏性,反而會加重過敏反應[3-4]。人乳鐵蛋白(Human lactoferrin,hLF)是最初在人乳汁中發(fā)現(xiàn)的一種鐵結(jié)合蛋白,具有抑菌和殺菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、促進鐵元素吸收等多種生物學功能,是十分理想的乳品添加劑[5]。因此,消除或降低羊乳中致敏原,同時增加功能營養(yǎng)蛋白成分,是提高羊乳品質(zhì)的一個重要研究方向。

    CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種成簇規(guī)律間隔短回文重復序列,由sgRNA引導Cas9核酸內(nèi)切酶特異識別靶基因位點,切割使DNA雙鏈斷裂,再經(jīng)同源重組和非同源末端連接兩種途徑進行修復[6],是一種新型基因打靶技術(shù),具有簡單、高效、精準且易獲得純合子突變體等特點,被廣泛地應用于轉(zhuǎn)基因動物細胞和個體的基因組定點精確編輯和修飾[7-9]。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因打靶技術(shù),可以對山羊致敏原BLG基因敲除和營養(yǎng)成分hLF基因敲入,通過內(nèi)源調(diào)控機制在乳腺中特異表達hLF而不表達BLG,實現(xiàn)羊乳的“人源化”改造,從而改善乳品質(zhì)量:田雨晨等[10]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對牛胎兒成纖維細胞β-酪蛋白基因進行編輯;劉暢等[11]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導奶山羊胎兒成纖維細胞中的β-酪蛋白基因位點的打靶研究;周文君等[12]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導人乳鐵蛋白在山羊耳成纖維細胞BLG基因座的打靶研究。這些研究雖然成功高效獲得了基因打靶細胞,為羊乳蛋白基因編輯和“人源化”改造提供了研究價值,但僅局限于細胞水平的基因打靶研究,還未能獲得存活的基因打靶山羊個體。因此,本研究擬利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù),在山羊中敲除致敏原BLG基因,同時定點敲入功能營養(yǎng)蛋白hLF基因,并通過體細胞核移植制備BLG-/hLF+基因打靶山羊胎兒,進而建立細胞系,以期為今后CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導BLG基因座的定點精確修飾和精準基因分子遺傳育種奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    選用薩能奶山羊和徐淮白山羊常規(guī)飼養(yǎng)于揚州大學實驗農(nóng)牧場。

    BLC14質(zhì)粒和菌種 (含山羊BLG3′調(diào)控序列和BLG5′調(diào)控序列、hLFcDNA、NEO基因、CMV增強子、PolyA信號)[13],宿主菌DH5α(Escherichiacoli), CRISPR/Cas9 二合一質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒購自南京堯順禹生物科技有限公司(AxyPrep PCR Clean-up Kit,Cat.No.AP-PCR-250)。

    DMEM/F12培養(yǎng)液、FBS (Hyclone公司,美國);G418、Trypsin (Amresco公司,美國);M16、M2、青鏈霉素、透明質(zhì)酸酶、細胞松弛素B、核熒光染料hochest 33342、6-甲基氨基蝶呤、離子霉素(Sigma公司,美國);DNA 膠純化回收試劑盒(QIAGEN 公司,德國);DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶(大連寶生物工程有限公司);其他未說明試劑均為分析純(上海生工生物工程有限公司和中國國藥集團化學試劑有限公司)。

    1.2 引物設計及合成

    本試驗使用到的所有PCR引物均通過Primer Premier 5.0軟件完成,由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成引物的合成(表1)。

    1.3 sgRNA設計及sgBLG/Cas9表達載體構(gòu)建

    針對山羊基因組中BLG基因座 (NCBI,Z33881.1,8 088 bp) 的第一外顯子區(qū)域設計sgRNA,應用在線軟件 (https:∥zlab.bio/guide-design-resources) 設計長度為22 bp 的sgRNA 引導序列,靶位點序列為GTGCCCCCACTTCTGGGGTCTA。然后通過常規(guī)分子生物學技術(shù)構(gòu)建表達載體并命名為sgBLG/Cas9。

    表1 研究所用引物Table 1 Primers used in this study

    1.4 奶山羊胎兒成纖維細胞的分離及培養(yǎng)

    按照參考文獻[14]和[15]的常規(guī)細胞培養(yǎng)方法,通過無菌手術(shù)剖宮產(chǎn)取35日齡奶山羊胎兒,來進行原代細胞的分離與培養(yǎng)。

    1.5 CRISPR/Cas9編輯山羊BLG位點致突變活性檢測

    待山羊胎兒成纖維細胞生長匯合度達到約80%時,收集細胞,用電轉(zhuǎn)染液洗滌離心后,重懸細胞調(diào)整密度至1×106個/mL,進行轉(zhuǎn)染。sgBLG/Cas9質(zhì)粒經(jīng)QIAGEN試劑盒純化后與細胞懸液混合,然后調(diào)整質(zhì)粒終濃度至15 μg/mL,進行電轉(zhuǎn)染(條件:2.0 kV/cm、250 μs、電擊2次,2 mm間隙電極杯,靜置3 min),使用DMEM/F12+10% FBS培養(yǎng)液重懸細胞,轉(zhuǎn)移至六孔板內(nèi)培養(yǎng)(條件:37 ℃、5% CO2、飽和濕度),隔1 d換液1次。同時設置未轉(zhuǎn)染的正常細胞作陰性對照。待細胞匯合至60%左右時,收集細胞,提取DNA,經(jīng)PCR對靶標區(qū)域進行檢測,擴增產(chǎn)物送上海華大基因科技有限公司進行測序。

    1.6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的hLF基因打靶細胞系的建立

    BLC14打靶載體經(jīng)SalⅠ和NotⅠ雙酶切線性化后,與sgBLG/Cas9表達載體混合,終濃度均調(diào)整至15 μg/mL,按照步驟1.5的方法和條件進行電轉(zhuǎn)染,同時設置陰性對照(正常未轉(zhuǎn)染的細胞)。2 d后,添加500 μg/mL G418 進行藥物抗性篩選,定期換液(隔3 d)和觀察。當陰性對照組的細胞全部死亡時(10~14 d),在熒光倒置顯微鏡下挑取單克隆細胞集落,更換為正常培養(yǎng)液,置于48孔板內(nèi)常規(guī)培養(yǎng),傳代于12孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)擴大培養(yǎng)。待匯合度至80%~90%時,重懸收集一部分細胞,提取基因組用作PCR檢測。應用CMV-hLF-F/R引物進行人乳鐵蛋白基因整合檢測,應用5′BLG-hLF-F/R引物進行5′端靶位點同源重組檢測,應用NEO-3′BLG-F/R引物進行另一側(cè)的3′端靶位點同源重組檢測。剩余細胞凍存以作供核細胞來制備轉(zhuǎn)基因克隆山羊。

    1.7 轉(zhuǎn)基因克隆山羊的制備

    按照參考文獻[14-16]的方法,對性成熟的正常雌性徐淮白山羊進行超數(shù)排卵,獲取供質(zhì)的卵母細胞,且同步對受體羊進行發(fā)情處理。隨后進行體細胞核移植、重構(gòu)胚的融合與激活、胚胎受體移植、受體山羊妊娠診斷檢測等,成功受孕后的山羊單圈常規(guī)飼養(yǎng)管理。

    1.8 基因打靶克隆胎兒鑒定

    妊娠山羊經(jīng)無菌剖宮產(chǎn)手術(shù)獲取35 日齡克隆胎兒,按照1.4的方法獲得細胞系,通過PCR進行基因打靶鑒定,應用CMV-hLF-F/R引物進行人乳鐵蛋白基因整合檢測,應用5′BLG-hLF-F/R和NEO-3′BLG-F/R引物進行同源重組檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 sgBLG/Cas9介導的山羊BLG基因座的打靶原理

    根據(jù)山羊BLG基因第一外顯子序列設計了長度為22 個堿基的sgRNA引導序列,并依據(jù)同源重組的原理,以BLC14乳腺特異性表達載體作為打靶載體,利用sgBLG/Cas9介導的山羊BLG基因敲除的同時定點導入hLF基因。由sgRNA 引導序列在山羊BLG基因座的打靶原理見圖1。

    圖1 sgBLG靶位點和打靶原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of sgBLG target site and target principle

    2.2 山羊胎兒成纖維細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)

    利用胰蛋白酶消化法(消化液:0.05%胰蛋白酶+0.04% EDTA)分離獲得山羊胎兒成纖維細胞,經(jīng)傳3 代培養(yǎng)后的典型形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖2所示。正常的原代(P0)山羊胎兒成纖維細胞形態(tài)瘦小,大部分呈現(xiàn)細長條狀、長梭形或無規(guī)律性排列,屬于一種常見的貼壁細胞(圖2(a))。經(jīng)傳至第三代(P3)以后的胎兒成纖維細胞匯合至80%~90%時,細胞群通常呈現(xiàn)放射狀、渦旋狀或火焰狀;當細胞密度大于90%時,肉眼可觀察到有散落的白色集落形成于細胞群內(nèi),而且細胞間相互擠壓呈現(xiàn)明顯的細長條狀(圖2(b))。

    圖2 山羊胎兒成纖維細胞(標尺=10 μm)Fig.2 Goat fetal fibroblasts (Sale bar=10 μm)

    2.3 CRISPR/Cas9編輯山羊胎兒成纖維細胞的BLG位點活性檢測

    將構(gòu)建成功的sgBLG/Cas9表達載體轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞后,提取細胞基因組DNA,使用sg-BLG-F/R引物進行PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)測序后獲得峰圖,通過峰圖的重疊情況來驗證細胞系的突變程度(圖3)。開始出現(xiàn)重疊的套峰處如圖中箭頭所指,即此處開始出現(xiàn)突變堿基(sgBLG/Cas9識別位點為山羊BLG基因第一外顯子C)。根據(jù)這種重疊套峰所占峰面積的比例情況,可初步判斷sgBLG/Cas9表達載體在山羊胎兒成纖維細胞中切割基因組DNA雙鏈的致突變活性約為30%~35%。

    圖3 sgBLG/Cas9表達載體的 PCR活性檢測峰截圖Fig.3 Sequencing peak diagram of sgBLG/cas9 expression vector by PCR

    2.4 hLF基因打靶細胞系的檢測

    BLC14基因打靶載體與sgBLG/Cas9表達載體共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞5×106個(細胞計數(shù)),經(jīng)G418篩選獲得72株藥物抗性細胞。應用CMV-hLF-F/R引物進行hLF基因整合檢測,獲得65株hLF轉(zhuǎn)基因細胞,PCR擴增產(chǎn)物大小均為470 bp(圖4(a))。應用5′BLG-hLF-F/R引物對hLF轉(zhuǎn)基因細胞進行5′端同源重組檢測,初步判斷有37株為基因打靶細胞,PCR擴增產(chǎn)物大小均為4 708 bp(圖4(b))。應用NEO-3′BLG-F/R引物對基因打靶細胞進行3′端同源重組檢測,進一步驗證該37 株細胞均為基因打靶細胞,PCR擴增產(chǎn)物大小均為2 402 bp(圖4(c))。山羊胎兒成纖維細胞BLG基因座定點打靶hLF基因的效率達51.4%(37/72)。

    熒光倒置顯微鏡下觀察細胞,挑取其中形態(tài)較好、飽滿度高、折光性和立體感強的7株基因打靶細胞凍存以作核移植的供核細胞。

    2.5 克隆胚的發(fā)育情況及基因打靶的驗證

    選擇2.4中形態(tài)較好的7 株基因打靶細胞(Ts1~Ts7),超排共獲得709 枚山羊卵母細胞,去核卵548 枚,去核率為77.3%(548/709);融合后獲得452枚重構(gòu)卵,融合率為82.5%(452/548);激活后培養(yǎng)挑取較好的416 枚重構(gòu)胚移植入30 只經(jīng)同步發(fā)情處理的受體山羊輸卵管中,30~35日,使用 B超對受體山羊進行妊娠診斷,13 只懷孕,妊娠率為43.3%(13/30)(表2)。

    (a) hLF基因整合檢測PCR圖 hLF transgenic integration analysis of PCR;M: DL-2000 DNA marker; P: BLC14 載體; N: 未轉(zhuǎn)染正常細胞; 1~22: 轉(zhuǎn)染細胞.M: DL-2000 DNA marker; P: BLC14 vector; N: Untransfected normal cells; 1-22: Transfected cell samples.(b) 5′端基因同源重組檢測PCR圖5′ gene homologous recombination analysis of PCR;M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker; N: 未轉(zhuǎn)染正常細胞; 1~7: 轉(zhuǎn)基因細胞.M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker; N: Untransfected normal cells; 1-7: Transgenic cell samples.(c) 3′端基因同源重組檢測PCR圖3′ gene homologous recombination analysis of PCR;M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker; N: 未轉(zhuǎn)染正常細胞; 1~7: 轉(zhuǎn)基因細胞.M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker; N: Untransfected normal cells; 1-7: Transgenic cell samples.圖4 PCR檢測基因打靶細胞株圖Fig.4 PCR analysis of gene targeting cell lines

    手術(shù)剖宮產(chǎn)獲取3 只35日齡胎兒 (圖5分別為 Ts1-1、Ts5-1、Ts5-3克隆胎兒)。通過hLF基因整合檢測和同源重組檢測證明了該3 只胎兒均為BLG基因座打靶胎兒(圖6),并建立了BLG-/hLF+靶向性修飾細胞系。

    表2 細胞核移植生產(chǎn)克隆胎兒統(tǒng)計Table 2 Statistics of the production of cloned fetuses by nuclear transfer

    (a) Ts1-1克隆胎兒 Ts1-1 cloned fetus; (b) Ts5-1克隆胎兒 Ts5-1 cloned fetus; (c) Ts5-3克隆胎兒 Ts5-3 cloned fetus圖5 35日齡BLG-/hLF+基因型克隆胎兒圖片F(xiàn)ig.5 Images of three 35-day-old cloned fetuses of BLG-/hLF+ genotype

    3 討論與結(jié)論

    CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細菌和古生菌在長期演化過程中形成的一種能夠抵御外來病毒或遺傳物質(zhì)入侵的獲得性免疫防御系統(tǒng),在植物、微生物、小鼠和大中型家畜細胞中已有較多的應用報道[9,16-17],是近年來基因編輯領域的一大“利器”,也是應用最廣泛的一種高效、精準、簡單的基因編輯技術(shù)。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的動物基因打靶技術(shù)可以對哺乳動物的乳蛋白基因組進行精準編輯修飾,在BLG等致敏原基因座定向置換hLF等功能營養(yǎng)蛋白基因,既可以降低或去除乳中致敏原又可以增加營養(yǎng)成分,改善消費者飲用乳品的質(zhì)量,是動物乳產(chǎn)品“人源化”改造的新思路和新方法[16]。

    (a) 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: 陰性對照; P: 陽性對照; M: DL-2000 DNA marker. 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: Negative control; P: Positive control; M: DL-2000 DNA marker.(b) 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: 陰性對照; P: 陽性對照; M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker. 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: Negative control; P: Positive control; M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker.(c) 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: 陰性對照; P: 陽性對照; M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker. 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: Negative control; P: Positive control; M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker.圖6 BLG-/hLF+基因型打靶胎兒檢測PCR圖Fig.6 PCR detection of gene targeting fetuses of BLG-/hLF+ genotype

    牛、羊等大中型家畜基因打靶的早期研究報道主要集中于長同源臂構(gòu)建打靶載體、人工鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應蛋白核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)等,存在效率低、精準度低、篩選繁雜、難以獲得完整的打靶動物個體等缺陷[18]。孫麗新等[19]在山羊β-酪蛋白基因位點定點敲入hLF基因的研究;Shen等[20]在山羊β-酪蛋白基因定點敲入htPAm基因的研究;張學明等[21]將gdnf基因定點導入牛β-casein基因座的打靶研究。但是,上述研究均沒有獲得存活的基因打靶動物個體,而且效率低下,脫靶現(xiàn)象極為嚴重。李雪玲等[11]利用TALENs基因編輯技術(shù)在奶山羊胎兒成纖維細胞β-酪蛋白基因的第二外顯子的打靶研究,將打靶效率提高達到32.35%,為今后通過體細胞核移植技術(shù)制備敲除β-酪蛋白基因奶山羊提供了可選的供體細胞。本課題組通過TALENs技術(shù)在山羊BLG基因座定點敲入hLF基因的研究中,獲得了6株BLG-/hLF+基因打靶細胞及1只打靶胎兒,為羊乳“人源化”及遺傳育種提供了研究基礎[15]。因此,一種高效的基因編輯技術(shù)亟待解決。Ni W和Polejaeva IA等[22]首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功地應用于山羊的基因編輯,從而開啟了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在山羊基因組中編輯的新篇章。

    利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的乳蛋白基因編輯和羊乳“人源化”改造是目前乳腺生物反應器研究領域的熱點。西北農(nóng)林科學大學張涌團隊等[10]率先利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對牛胎兒成纖維細胞β-酪蛋白基因進行編輯,打靶效率為9.7%;周文君等[12]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導人乳鐵蛋白在山羊耳成纖維細胞BLG基因座的打靶研究,打靶效率為36.69%;劉暢等[11]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對山羊胎兒成纖維細胞β-酪蛋白基因的第二外顯子進行打靶研究,打靶效率高達74.29%。但是,上述研究仍然局限于細胞水平,還沒有在中靶動物個體水平進行研究,也沒有存活的基因打靶動物個體出生。

    本研究證實了CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠介導山羊乳蛋白靶向基因敲入和敲出。共篩選出37株BLG-/hLF+基因打靶細胞,打靶效率為51.4%,遠遠高于傳統(tǒng)的基因打靶效率[14,16],與類似研究報道打靶效率相當[11-12],而且妊娠率(43.3%)也遠遠高于其它相關(guān)研究報道[15]。最終通過無菌剖宮產(chǎn)獲取克隆胎兒,建立BLG-/hLF+基因打靶細胞系,并進一步證明了均為BLG基因座定點打靶hLF基因胎兒和細胞系。此外,本實驗室保存的BLC14基因打靶載體含有山羊BLG調(diào)控區(qū)、hLF功能基因、CMV增強子及藥物抗性基因NEO,其在乳腺中特異性穩(wěn)定表達能力在山羊、兔和小鼠中已經(jīng)得到了良好的驗證[13-16]。以上結(jié)果表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的BLG-/hLF+中靶細胞作為山羊體細胞核移植的供核細胞制備的重構(gòu)胚具有類似干細胞的全能發(fā)育性和恢復發(fā)育成長至完整個體的潛能,而且在內(nèi)源BLG基因座定向編輯置換hLF基因并未影響早期山羊胚胎的順利發(fā)育。雖然有部分受體在中后期發(fā)育過程中出現(xiàn)妊娠終止情況,暗示基因打靶細胞可能會干擾克隆胎兒的發(fā)育程度,但已有研究也報道了隨著重構(gòu)胚胎的不斷發(fā)育,中后期出現(xiàn)胎兒發(fā)育停滯的現(xiàn)象[20,23]。

    本研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導在山羊BLG基因座定向置換hLF基因,成功地獲得了多株BLG-/hLF+基因打靶細胞,經(jīng)核移植和剖宮產(chǎn)獲得了該基因的中靶克隆山羊胎兒個體及靶向性修飾細胞系,為培育羊乳中低致敏原和富含hLF功能營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)基因山羊新品系奠定了基礎,也為羊乳“人源化”改造及其它乳蛋白基因編輯提供了科學依據(jù)。

    猜你喜歡
    基因座纖維細胞山羊
    夏季如何讓山羊增膘
    Tiger17促進口腔黏膜成纖維細胞的增殖和遷移
    滇南小耳豬膽道成纖維細胞的培養(yǎng)鑒定
    山羊受騙
    聰明的山羊
    DXS101基因座稀有等位基因的確認1例
    臨夏回族自治州撒拉族人群15個STR基因座遺傳多態(tài)性
    胃癌組織中成纖維細胞生長因子19和成纖維細胞生長因子受體4的表達及臨床意義
    DYF387S1基因座分型異常現(xiàn)象
    食管疾病(2015年3期)2015-12-05 01:45:11
    兩種制備大鼠胚胎成纖維細胞的方法比較
    亚洲成人av在线免费| 性欧美人与动物交配| 国产高清视频在线观看网站| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲高清免费不卡视频| 性色avwww在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 观看免费一级毛片| 99视频精品全部免费 在线| 美女大奶头视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 99热6这里只有精品| 我要搜黄色片| 亚洲国产精品sss在线观看| 看十八女毛片水多多多| 日韩欧美国产在线观看| 有码 亚洲区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 91精品一卡2卡3卡4卡| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美又色又爽又黄视频| 国产美女午夜福利| 看免费成人av毛片| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久精品影院6| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产精品一区二区在线观看99 | 欧美一区二区亚洲| 波野结衣二区三区在线| a级毛色黄片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 岛国毛片在线播放| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美一级a爱片免费观看看| 精品久久久久久久久av| 毛片一级片免费看久久久久| 免费av观看视频| 日本一二三区视频观看| 最后的刺客免费高清国语| 国产淫片久久久久久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产日韩欧美在线精品| 特大巨黑吊av在线直播| 色视频www国产| 一进一出抽搐动态| 99热这里只有是精品在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 人妻系列 视频| 天堂影院成人在线观看| 老司机福利观看| 最近的中文字幕免费完整| 美女 人体艺术 gogo| 麻豆国产av国片精品| 最近手机中文字幕大全| 欧美一区二区国产精品久久精品| 一级av片app| 久久久久网色| 99国产精品一区二区蜜桃av| 在线观看午夜福利视频| videossex国产| 男人的好看免费观看在线视频| 国产男人的电影天堂91| 国产乱人视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美激情国产日韩精品一区| 联通29元200g的流量卡| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品久久久久久久久免| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲人与动物交配视频| 日日撸夜夜添| 久久九九热精品免费| 最近的中文字幕免费完整| 最近的中文字幕免费完整| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 小说图片视频综合网站| 国产高清激情床上av| 不卡视频在线观看欧美| 欧美人与善性xxx| 亚洲性久久影院| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美潮喷喷水| 国产日本99.免费观看| 嫩草影院入口| 欧美精品国产亚洲| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美激情久久久久久爽电影| 可以在线观看毛片的网站| 99热全是精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 99热这里只有是精品在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美丝袜亚洲另类| 久久久久九九精品影院| 乱系列少妇在线播放| 99riav亚洲国产免费| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 夜夜夜夜夜久久久久| 午夜福利视频1000在线观看| а√天堂www在线а√下载| 嫩草影院新地址| 男女啪啪激烈高潮av片| 中国美白少妇内射xxxbb| 干丝袜人妻中文字幕| 99热只有精品国产| 白带黄色成豆腐渣| 欧美3d第一页| 天堂√8在线中文| 三级经典国产精品| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美+亚洲+日韩+国产| 最新中文字幕久久久久| 综合色丁香网| 午夜爱爱视频在线播放| 国产91av在线免费观看| 免费av观看视频| 全区人妻精品视频| 日韩人妻高清精品专区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 91aial.com中文字幕在线观看| 少妇高潮的动态图| 成人综合一区亚洲| 嫩草影院入口| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 一区二区三区免费毛片| 成人欧美大片| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲经典国产精华液单| 免费看日本二区| 人妻久久中文字幕网| 成人美女网站在线观看视频| 搞女人的毛片| 欧美精品一区二区大全| 国产精品av视频在线免费观看| 日韩欧美精品v在线| 在线观看一区二区三区| 日本成人三级电影网站| 级片在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 少妇丰满av| 搞女人的毛片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品欧美国产一区二区三| or卡值多少钱| 日日干狠狠操夜夜爽| 一夜夜www| 国产麻豆成人av免费视频| 91久久精品国产一区二区成人| 少妇高潮的动态图| 亚洲国产色片| 日本五十路高清| 国产 一区 欧美 日韩| 免费看av在线观看网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲av不卡在线观看| 18+在线观看网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产成人91sexporn| 精品久久久久久久久亚洲| 草草在线视频免费看| 一区二区三区高清视频在线| 色尼玛亚洲综合影院| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产片特级美女逼逼视频| 综合色av麻豆| 亚洲精品自拍成人| 久久精品91蜜桃| 国产精品永久免费网站| av专区在线播放| 联通29元200g的流量卡| 国产精品国产高清国产av| 国产乱人视频| 在线免费观看的www视频| 免费看美女性在线毛片视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲第一电影网av| 一个人看视频在线观看www免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 超碰av人人做人人爽久久| 国产片特级美女逼逼视频| 级片在线观看| 三级经典国产精品| 免费看a级黄色片| 久久久精品94久久精品| 1024手机看黄色片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产乱人视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 中文字幕av在线有码专区| 精华霜和精华液先用哪个| 69av精品久久久久久| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 舔av片在线| 久久久久久久久久久丰满| 22中文网久久字幕| 国模一区二区三区四区视频| 真实男女啪啪啪动态图| 少妇的逼水好多| 青春草亚洲视频在线观看| 成人特级av手机在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 波多野结衣高清无吗| 在线天堂最新版资源| 伊人久久精品亚洲午夜| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美色视频一区免费| 天天躁日日操中文字幕| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 六月丁香七月| 亚洲美女搞黄在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 精品久久久久久久久亚洲| 精品免费久久久久久久清纯| 国产麻豆成人av免费视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 免费观看在线日韩| 亚洲精品色激情综合| videossex国产| 99热这里只有精品一区| 亚洲最大成人中文| 少妇丰满av| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲av成人精品一区久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品欧美国产一区二区三| 麻豆成人av视频| 久久精品国产清高在天天线| 99久国产av精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 免费观看人在逋| 婷婷色av中文字幕| 国产成人a区在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲图色成人| 在现免费观看毛片| 国产精品一区二区三区四区久久| 久久99蜜桃精品久久| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲av不卡在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 99久国产av精品| 18禁在线播放成人免费| 99热6这里只有精品| 国内精品久久久久精免费| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美精品一区二区大全| 男女边吃奶边做爰视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品野战在线观看| 22中文网久久字幕| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 韩国av在线不卡| 97超碰精品成人国产| 国产亚洲5aaaaa淫片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产一级毛片在线| 十八禁国产超污无遮挡网站| 两个人的视频大全免费| 九九热线精品视视频播放| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品人妻久久久影院| 国产视频内射| 欧美一级a爱片免费观看看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 色综合站精品国产| 国产精品免费一区二区三区在线| 村上凉子中文字幕在线| 国产乱人视频| 欧美日韩在线观看h| 国产精品福利在线免费观看| 一本久久中文字幕| eeuss影院久久| 亚州av有码| 亚洲国产色片| 欧美潮喷喷水| 神马国产精品三级电影在线观看| 青青草视频在线视频观看| 久久草成人影院| 国产精品国产高清国产av| 高清日韩中文字幕在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 成人欧美大片| 欧美日韩在线观看h| 久久韩国三级中文字幕| 丝袜喷水一区| 久久久久久九九精品二区国产| 舔av片在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品,欧美在线| 欧美色视频一区免费| 欧美日本视频| 久久99热这里只有精品18| 少妇熟女欧美另类| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品久久视频播放| 国语自产精品视频在线第100页| 中国国产av一级| 国产成人精品一,二区 | 老司机福利观看| 久久99精品国语久久久| 熟女人妻精品中文字幕| 永久网站在线| 男人的好看免费观看在线视频| 国产毛片a区久久久久| 亚洲最大成人av| 精品国内亚洲2022精品成人| 色综合亚洲欧美另类图片| 精品日产1卡2卡| 久久99蜜桃精品久久| 乱系列少妇在线播放| 亚洲国产高清在线一区二区三| 岛国在线免费视频观看| 国产成人一区二区在线| 亚洲最大成人av| 精品国内亚洲2022精品成人| 精品一区二区免费观看| 九九爱精品视频在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 中国美女看黄片| 亚洲最大成人中文| 亚洲七黄色美女视频| 欧美高清成人免费视频www| 精品午夜福利在线看| 色尼玛亚洲综合影院| 久久人人精品亚洲av| 三级毛片av免费| 网址你懂的国产日韩在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 在线播放无遮挡| 99国产极品粉嫩在线观看| 六月丁香七月| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日韩精品青青久久久久久| 六月丁香七月| 特大巨黑吊av在线直播| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美精品国产亚洲| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 精品久久久久久久久av| 高清毛片免费看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 天天躁日日操中文字幕| 久久亚洲国产成人精品v| avwww免费| 久99久视频精品免费| 国产精品一区二区在线观看99 | 亚洲精品国产av成人精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日韩一区二区三区影片| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 中国美女看黄片| 国产伦理片在线播放av一区 | 一本久久精品| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久精品影院6| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 三级国产精品欧美在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 禁无遮挡网站| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产av不卡久久| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 国产精品精品国产色婷婷| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 最好的美女福利视频网| 一本久久精品| 色5月婷婷丁香| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 日韩欧美国产在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 直男gayav资源| 男人舔奶头视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品一二三区在线看| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲天堂国产精品一区在线| 在线观看一区二区三区| 免费在线观看成人毛片| 熟女电影av网| 欧美性猛交黑人性爽| 久久草成人影院| 亚洲欧美日韩高清专用| 午夜免费男女啪啪视频观看| 99热只有精品国产| 亚洲人与动物交配视频| 色5月婷婷丁香| 久久中文看片网| 婷婷色av中文字幕| 男的添女的下面高潮视频| 美女内射精品一级片tv| 欧美高清成人免费视频www| 日日撸夜夜添| 日本黄色片子视频| 天堂中文最新版在线下载 | av在线观看视频网站免费| 日本欧美国产在线视频| 伊人久久精品亚洲午夜| a级毛片免费高清观看在线播放| 老女人水多毛片| 日本色播在线视频| 精品一区二区三区视频在线| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 激情五月婷婷亚洲| 天天影视国产精品| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲国产精品一区三区| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲av成人精品一二三区| 另类精品久久| 九草在线视频观看| 考比视频在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产精品99久久久久久久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美 日韩 精品 国产| 久久人妻熟女aⅴ| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 精品一区二区三区视频在线| 免费高清在线观看视频在线观看| 在线观看免费高清a一片| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲成色77777| 国产免费视频播放在线视频| 日韩视频在线欧美| 国产永久视频网站| 99久国产av精品国产电影| 亚洲美女搞黄在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 桃花免费在线播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 18在线观看网站| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 99九九线精品视频在线观看视频| 成人毛片60女人毛片免费| 国产片特级美女逼逼视频| 久久久午夜欧美精品| 免费看av在线观看网站| 国产成人91sexporn| 精品一区二区三卡| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲人成77777在线视频| 大香蕉97超碰在线| 免费高清在线观看视频在线观看| 内地一区二区视频在线| 欧美精品国产亚洲| 国产成人一区二区在线| 亚洲国产最新在线播放| 久久久亚洲精品成人影院| 999精品在线视频| 亚洲国产精品专区欧美| h视频一区二区三区| 青春草亚洲视频在线观看| 精品酒店卫生间| 高清欧美精品videossex| av网站免费在线观看视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 99热国产这里只有精品6| 精品亚洲成a人片在线观看| 色哟哟·www| 亚洲在久久综合| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美xxⅹ黑人| 三级国产精品片| 亚洲av成人精品一二三区| 日韩视频在线欧美| 色视频在线一区二区三区| 亚洲成人av在线免费| 国产 精品1| 一区在线观看完整版| 老女人水多毛片| 国产亚洲最大av| 九草在线视频观看| 女性被躁到高潮视频| 成人手机av| 日日啪夜夜爽| 91久久精品国产一区二区三区| 免费大片黄手机在线观看| 国产在视频线精品| 久久99精品国语久久久| 97在线人人人人妻| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 伊人久久精品亚洲午夜| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲国产精品成人久久小说| 精品人妻偷拍中文字幕| 三级国产精品片| 在线观看免费日韩欧美大片 | 欧美+日韩+精品| 人人澡人人妻人| 国产不卡av网站在线观看| 久久久精品94久久精品| 男人添女人高潮全过程视频| 男的添女的下面高潮视频| 国产成人91sexporn| 美女视频免费永久观看网站| 男的添女的下面高潮视频| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品一区二区在线观看99| 日本爱情动作片www.在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 黑人猛操日本美女一级片| 人妻 亚洲 视频| 男女国产视频网站| 久久久精品免费免费高清| √禁漫天堂资源中文www| 一级毛片aaaaaa免费看小| 色哟哟·www| 国产不卡av网站在线观看| 搡老乐熟女国产| 亚洲国产精品999| 亚洲精品久久午夜乱码| 黄色配什么色好看| 美女福利国产在线| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美xxⅹ黑人| 欧美日韩av久久| 国产精品国产三级专区第一集| 国产精品一区www在线观看| 亚洲精品自拍成人| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产一区二区三区av在线| 晚上一个人看的免费电影| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 黄片播放在线免费| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产精品久久久久久精品古装| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| a级片在线免费高清观看视频| 精品国产国语对白av| 视频在线观看一区二区三区| av黄色大香蕉| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久久久久久久久成人| 不卡视频在线观看欧美| 国产黄片视频在线免费观看| 尾随美女入室| 天美传媒精品一区二区| 综合色丁香网| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品女同一区二区软件| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲国产欧美在线一区| 久久狼人影院| 色网站视频免费| 一本色道久久久久久精品综合| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲美女视频黄频| 18禁动态无遮挡网站| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 成人国语在线视频| 精品一区二区三卡| 成人亚洲精品一区在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲精品一二三| 高清不卡的av网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 午夜91福利影院| 亚洲av欧美aⅴ国产| 飞空精品影院首页| 亚洲综合色惰| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 插阴视频在线观看视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 另类精品久久| 桃花免费在线播放| 另类亚洲欧美激情| 卡戴珊不雅视频在线播放|