蘋(píng)果根際解磷菌的分離篩選及解磷能力

莊馥璐 柴小粉 高蓓蓓 王 憶

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，北京 100193)

蘋(píng)果是薔薇科蘋(píng)果亞科蘋(píng)果屬植物，其果實(shí)富含礦物質(zhì)和維生素，是人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ?jiàn)的鮮食水果之一。2017年世界蘋(píng)果年產(chǎn)量約為 7 680 萬(wàn)t，中國(guó)作為世界上最大的蘋(píng)果生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，產(chǎn)量達(dá)4 450 萬(wàn)t，占世界蘋(píng)果年產(chǎn)量的58%[1]。中國(guó)蘋(píng)果的商業(yè)化生產(chǎn)已經(jīng)成為許多地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)支柱。

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的大量元素之一，對(duì)促進(jìn)植株的生長(zhǎng)發(fā)育和各種新陳代謝起著重要的作用。植株吸收的磷95%以上是無(wú)機(jī)磷的形式，占全磷含量的25%～56%[2]，因此無(wú)機(jī)磷的供應(yīng)常出現(xiàn)不足。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，全世界約有43%的耕地土壤缺乏能被植物吸收利用的有效磷, 我國(guó)缺乏有效磷的耕地土壤更是占我國(guó)總耕地土壤的70%以上[3]。為了保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求, 人們常常通過(guò)施用大量的磷肥來(lái)彌補(bǔ)有效磷的供應(yīng)[4]。然而隨著大量的磷肥投入，同時(shí)也造成了土壤磷盈余, 不僅降低了磷肥的利用率, 而且對(duì)果園環(huán)境構(gòu)成威脅[5]。因此，如何能夠滿(mǎn)足土壤磷素供給，又不給生態(tài)環(huán)境造成額外負(fù)擔(dān)，成為了果園管理新的關(guān)注點(diǎn)，生物菌肥也隨之孕育而生。

土壤微生物在磷循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用，其中，一些細(xì)菌可以通過(guò)溶解不溶性磷酸鹽來(lái)提高植物的有效磷庫(kù)，其被稱(chēng)之為解磷菌。解磷菌種類(lèi)繁多，根據(jù)種類(lèi)，可分為細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌等。也可以根據(jù)解磷菌作用對(duì)象，即分解底物的不同，分為有機(jī)磷微生物(能夠轉(zhuǎn)化有機(jī)磷化合物)和無(wú)機(jī)磷微生物(將難溶無(wú)機(jī)化合物轉(zhuǎn)為可吸收的可溶磷)。其實(shí)很難根據(jù)分解底物的不同將解磷菌區(qū)分開(kāi)來(lái)，無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷都能被鏈霉菌屬所溶解。目前，報(bào)道的菌屬約有 20 多種，其中解磷細(xì)菌研究最多，主要包括芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌(Rhizobium)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)、固氮菌(Azotobacter)、農(nóng)桿菌(Agrobacterium)、微球菌(Micrococcus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)和根瘤菌(Rhizobiumsp.)等[8-9]。解磷真菌類(lèi)報(bào)道較少，但真菌磷能力強(qiáng)是目前許多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。研究較多的有青霉菌屬(Penicillium)、曲霉菌屬(Asperquillus)、根霉屬(Rhizopus)、 鐮刀菌屬(Fusarium)和小菌核菌屬(Sclerotium)等。放線(xiàn)菌主要包括鏈霉菌屬(Streptomyces)和AM菌根。解磷菌對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有重要的意義，解磷菌肥料的生產(chǎn)簡(jiǎn)單、見(jiàn)效快、市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)。因此，解磷菌肥不僅能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)使作物增產(chǎn)，還能提高磷利用率使土壤環(huán)境改善，促進(jìn)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展。

然而，目前在對(duì)土壤解磷菌的研究主要集中于溶解無(wú)機(jī)磷菌株的篩選[6-7]，對(duì)于篩選土壤難溶性有機(jī)磷解磷菌的報(bào)道則較少[8]。同時(shí)，隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，人們對(duì)園藝產(chǎn)品的需求在不斷增加，相應(yīng)的，園藝產(chǎn)品對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的需求也在不斷增加，致使全國(guó)耕地土壤速效磷含量逐年下降。在土壤磷循環(huán)過(guò)程中，解磷微生物起著重要的作用，它可以將土壤中的難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物能夠吸收并利用的有效磷，最終實(shí)現(xiàn)提高磷肥的利用率、改良土壤結(jié)構(gòu)和提高作物產(chǎn)量的作用[9-12]。目前，對(duì)于解磷細(xì)菌篩選的研究國(guó)內(nèi)外已有一些相關(guān)的報(bào)道，而前人多集中在對(duì)小麥[13-14]、玉米[15]和番茄[16]等根際解磷菌的研究，并將相關(guān)的解磷菌應(yīng)用到菌肥中。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者研究了生物菌肥在豆科和茄科等作物上的應(yīng)用，目前在美國(guó)和澳大利亞等發(fā)達(dá)國(guó)家80%以上的豆科作物種植時(shí)都接種根瘤菌劑，但在中國(guó)接種根瘤菌的作物面積不足種植面積的1%[17-18]。其中，前人對(duì)茄子[19]和花生[20]等植物的研究表明：解磷菌肥的適量增施能夠有效提高植株對(duì)氮、磷和鉀的吸收，顯著提高作物的產(chǎn)量，改善品質(zhì)；生物菌肥在煙草上的施用能夠改善植煙土壤環(huán)境[21]以及促進(jìn)煙株對(duì)鉀素的吸收和利用[22]，從而促進(jìn)煙株生長(zhǎng)發(fā)育，提高產(chǎn)量和質(zhì)量[23]。但是，目前對(duì)于果樹(shù)根際解磷菌的報(bào)道還很少。

本研究以植酸鈣作為唯一有機(jī)磷源，通過(guò)選擇性培養(yǎng)，從蘋(píng)果砧木小金海棠根際土壤中分離純化解磷細(xì)菌，研究該菌株的解磷能力及生長(zhǎng)情況；并選擇解磷能力強(qiáng)的菌株回接到植物根系，研究解磷菌對(duì)植株的影響，以期在開(kāi)發(fā)果樹(shù)特異性和效果好的解磷菌資源。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

蘋(píng)果根際土的收集在北京市昌平區(qū)上莊鎮(zhèn)實(shí)驗(yàn)基地蘋(píng)果園中進(jìn)行。該地區(qū)屬于暖溫帶，半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫13 ℃，年均降水量535 mm，降水主要集中在夏季，全年日照2 390 h，土壤類(lèi)型以褐土為主。果園中的栽培品種為富士，嫁接基砧為小金海棠的實(shí)生砧木，于2011年9月初芽接。在2018年10月進(jìn)行土壤采集，以樹(shù)干為中心的半徑1 m范圍內(nèi)，避開(kāi)施肥點(diǎn)，取深度為0～20 cm 土層的毛細(xì)根，用“抖根法”收集根際土，裝入無(wú)菌自封袋并迅速放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃冰箱保存，用于后續(xù)解磷細(xì)菌的分離篩選。

1.2 解磷菌的分離篩選及純化

稱(chēng)取1 g根際土，裝入10 mL無(wú)菌離心管中，加入10 mL無(wú)菌水，充分振蕩形成細(xì)菌懸浮液，依次稀釋得到10-1、10-2、10-3、10-4和10-5稀釋梯度的樣品。取各稀釋梯度懸液100 μL均勻涂布到含蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基(1 L 體系:10 g葡萄糖(glucose)、0.5 g (NH4)2SO4、0.3 g NaCl、0.3 g KCl、0.03 g FeSO4·7H2O、0.03 g MnSO4·4H2O、0.3 g MgSO4·7H2O、0.4 g酵母粉、15 g瓊脂粉、2 g 植酸鈣，pH為7.0)的平板上，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱2 d。從適當(dāng)稀釋倍數(shù)的培養(yǎng)基上挑取形成溶磷圈的單菌落，采用劃線(xiàn)的方式將單菌落接種到LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成單菌落，再挑取單菌落在蒙金娜培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，反復(fù)上述步驟直至得到純的單菌落。然后將這些菌株接種到LB斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2 d后置于4 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3 解磷細(xì)菌的鑒定

對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。解磷細(xì)菌生理生化特性測(cè)定參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[24]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[25]的方法對(duì)菌株進(jìn)行淀粉水解、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、M.R (甲基紅)試驗(yàn)和明膠試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)。

從小金海棠根際土壤中分離純化的解磷細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析，用以確定解磷菌菌株種類(lèi)。在LB培養(yǎng)液中活化細(xì)菌，吸取菌液進(jìn)行細(xì)菌PCR擴(kuò)增，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F：5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′；1492R：5′- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′；M 為A 或C)，PCR反應(yīng)體系50 μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，循環(huán)34次；最后72 ℃延伸7 min。然后將PCR產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，所得序列提交到Genbank中利用Blast程序(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行相似性比對(duì)，用ClustalX進(jìn)行序列比對(duì)分析，確定細(xì)菌的種類(lèi)，最后用MEGA軟件(版本5.5)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.1解磷菌的解磷能力測(cè)定

將分離純化的菌株接種到蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基平板上，放置 37 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng) 60 h 分別測(cè)定細(xì)菌菌落直徑(d)和溶磷圈直徑(D)，計(jì)算可溶性指數(shù)(D/d)。由于磷酸單酯酶能夠水解對(duì)硝苯基磷酸二鈉，產(chǎn)生磷酸和對(duì)硝基苯酚(黃色)。通過(guò)比色法測(cè)定釋放的對(duì)硝基苯酚的含量，計(jì)算單位根際土單位時(shí)間內(nèi)對(duì)硝基苯酚的量來(lái)評(píng)估磷酸單酯酶的活性。因此向培養(yǎng)基平板上滴加2 mL 150 mmol/LpNPP(對(duì)硝苯基磷酸二鈉)，覆蓋溶磷圈，4 h后觀察顯色結(jié)果，如有黃色產(chǎn)生則說(shuō)明細(xì)菌分泌磷酸酶。將各菌株分別接種到LB液體培養(yǎng)基，以180 r/min 37 ℃ 培養(yǎng)7 h后用分光光度計(jì)調(diào)整細(xì)菌濃度至OD600=0.6。在超凈工作臺(tái)中吸取750 μL細(xì)菌懸液加入到裝蒙金娜液體培養(yǎng)基(15 mL)的50 mL無(wú)菌離心管，斜放于37 ℃振蕩(180 r/min)培養(yǎng)，每個(gè)菌株3次重復(fù)。在培養(yǎng)24 h后吸取2 mL溶液，4 ℃，12 000 r/min 離心5 min，取上清液用鉬銻抗顯色法[26]測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量，同時(shí)用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液pH。另外取上清液0.5 mL，添加0.1 mLpNPP (對(duì)硝苯基磷酸二鈉)MES緩沖液(pH 8.5)，30 ℃水浴培養(yǎng)30 min，用1 mL 0.25 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。對(duì)照先添1 mL 0.25 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，然后 30 ℃水浴培養(yǎng)30 min，12 000 r/min離心10 min，用pNP(對(duì)硝基苯酚)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比色，測(cè)定磷酸酶含量。

1.3.2解磷菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

各解磷細(xì)菌菌株在LB液體培養(yǎng)基以180 r/min 37 ℃培養(yǎng)8 h，用分光光度計(jì)將菌液調(diào)整至OD600=0.1用于接種。本試驗(yàn)用100孔微孔板作為細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定的培養(yǎng)裝置，在微孔中分別加入180 μL液體LB培養(yǎng)基，然后每個(gè)孔內(nèi)加入20 μL調(diào)整好的菌液，對(duì)照加入20 μL液體LB培養(yǎng)基，每個(gè)處理重復(fù)9次。微孔板放到細(xì)菌連續(xù)生長(zhǎng)儀Bioscreen C MBR(Oy Growth Curves Ab Ltd，F(xiàn)inland)中 37 ℃ 培養(yǎng)，每隔2 h監(jiān)測(cè)OD600值，用于反應(yīng)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。

1.4 擬南芥回接試驗(yàn)及根際pH顯色

擬南芥根際回接解磷菌試驗(yàn)在培養(yǎng)基上進(jìn)行。解磷菌回接試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，分別是正常磷供應(yīng)、無(wú)菌且植酸鈣為磷源、回接解磷菌且植酸鈣為磷源(在擬南芥根系生長(zhǎng)位置加入PsbM4菌液10 μL)，每個(gè)處理4次重復(fù)，每次重復(fù)1個(gè)板(10棵擬南芥)。本試驗(yàn)采用M培養(yǎng)基，按照表1準(zhǔn)備母液[27]。配置工作液時(shí)吸取相應(yīng)體積的母液，加 10 g/L 蔗糖，pH調(diào)至5.5，固體培養(yǎng)基加3 g/L植物凝膠，121 ℃滅菌15 min。試驗(yàn)用擬南芥為野生型，種子用75%無(wú)水乙醇消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3～4次，再用次氯酸鈉(體積比：次氯酸鈉∶無(wú)菌水=1∶3)消毒4 min，無(wú)菌水清洗3～4次，播種于MS培養(yǎng)基中，放置于4 ℃純化3 d。之后取出，培養(yǎng)基垂直培養(yǎng)，生長(zhǎng)2周左右轉(zhuǎn)移至不同處理的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至出現(xiàn)缺磷表型。收獲時(shí)檢測(cè)根際pH。

表1 Minimum(M)培養(yǎng)基母液配方[27]Table 1 Concentration of stock solutions to prepare minimum(M) medium

收獲時(shí)，將擬南芥根系用去離子水清洗3次，用吸水紙將根系表面水分吸干，將根系放置于顯色培養(yǎng)基(0.06 g溴甲酚紫用少量95%酒精溶解，用蒸餾水定容至100 mL，取1 mL加入100 mL去離子水中，用1 mol/L NaOH調(diào)整溶液pH約5.9，加入1 g瓊脂，加入溶解后倒板)上，將根系展開(kāi)，暗培養(yǎng)60 min，觀察根系周?chē)囵B(yǎng)基顏色變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Excel進(jìn)行初步整理，利用SPSS軟件(20.0版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)不同菌株的可溶性指數(shù)、液體培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)磷濃度和磷酸酶活性進(jìn)行單因素方差分析和LSD法多重比較(P<0.05)。利用MEGA軟件(版本5.5)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，利用Sigmaplot軟件(版本10.0)擬合細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果根際土壤解磷菌的篩選和純化

在5個(gè)不同稀釋梯度下，對(duì)比根際土壤細(xì)菌懸液在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后的菌落個(gè)數(shù)，確定解磷菌的最終篩選稀釋倍數(shù)為10-3，此時(shí)細(xì)菌在有機(jī)磷篩選培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況如圖1(a)所示，單皿菌落數(shù)在30～300個(gè)且單菌落間較好分離，同時(shí)出現(xiàn)較為明顯的溶磷圈。將出現(xiàn)溶磷圈的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，得到10株解磷菌，分別命名為蘋(píng)果樹(shù)解磷菌1-10(Phosphate-solubilizing bacteria fromMalusxiaojinensis1-10，簡(jiǎn)稱(chēng)PsbM1-10)。

(a)稀釋倍數(shù)為 10-3 的篩選培養(yǎng)基 Selection medium with a dilution factor of 10-3(b)不同解磷菌的解磷能力對(duì)比 Comparison of phosphorus removal ability of different phosphorus removal bacteria圖1 篩選解磷菌的培養(yǎng)基及不同解磷菌解磷能力的對(duì)比Fig.1 Comparison of medium for screening phosphate-solubilizing bacteria and the phosphate-solubilizing capacity of different phosphate-solubilizing bacteria

2.2 解磷菌的生理生化特性

對(duì)篩選獲得的10株解磷菌進(jìn)行細(xì)菌基本理化性質(zhì)的測(cè)定，包含革蘭氏染色、甲基紅、過(guò)氧化氫、淀粉水解和明膠水解試驗(yàn)等。細(xì)菌按特征可為革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌兩大類(lèi)，根據(jù)染色性質(zhì)可以縮小鑒定范圍，有利于進(jìn)一步分離和判斷，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所有篩出的10株解磷菌均為革蘭氏陰性菌，且通過(guò)甲基紅試驗(yàn)驗(yàn)證均不可代謝糖產(chǎn)酸。過(guò)氧化氫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PsbM4和PsbM9具有過(guò)氧化氫酶活性，使得滴加3%過(guò)氧化氫溶液5 min后仍能產(chǎn)生氣體。PsbM4和PsbM10被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生淀粉水解酶，可以水解淀粉使碘液和淀粉無(wú)法形成藍(lán)紫色物質(zhì)。PsbM1、PsbM4、PsbM5和PsbM9可產(chǎn)生明膠酶分解明膠，使明膠液化。

(a)過(guò)氧化氫試驗(yàn) H2O2 test； (b)淀粉水解試驗(yàn) Starch hydrolysis test； (c)明膠試驗(yàn) Gelatin test圖2 3種生理生化指標(biāo)的測(cè)定Fig.2 Determination of three physiological and biochemical indexes

2.3 解磷菌的解磷能力

研究中常用溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)的比例關(guān)系來(lái)代表解磷菌的解磷能力，因此本研究利用蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基測(cè)定純化的10株解磷菌的這2個(gè)指標(biāo)初步測(cè)定10株解磷菌的解磷能力，結(jié)果顯示：10株解磷菌的可溶性指數(shù)>1.50，不同菌株之間存在差異，其中PsbM6的可溶性指數(shù)最大(為5.13)，其次是PsbM7、PsbM8和PsbM10(分別為3.53、3.42和3.18)，可溶性指數(shù)最小的為PsbM1(表3)。

通過(guò)鉬銻抗顯色法對(duì)10株解磷菌的解磷能力進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明PsbM10的解磷能力最強(qiáng)，培養(yǎng)24 h后溶液的無(wú)機(jī)磷濃度達(dá)到104.125 mg/L，其次為PsbM4和PsbM8。由于解磷菌在礦化有機(jī)磷的同時(shí)會(huì)降低溶液pH，因此溶液pH的變化也在一定程度說(shuō)明菌株的解磷能力高低。測(cè)定發(fā)現(xiàn)10株解磷菌使pH降低的程度有所不同，其中PsbM8 和PsbM6下降幅度最低。

表2 10株解磷菌的理化特性Table 2 Physicochemical characteristic of 10 strains of phosphatolytic bacteria

表3 解磷菌溶磷圈和菌落直徑比值Table 3 Disolving phosphate zone diameter to culture community zone diameter ofphosphate-solubilizing bacteria

不同小寫(xiě)字母表示處理間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。下同。The different lower case letters indicate significant difference among the treatments(P<0.05). The same below.圖3 從小金海棠蘋(píng)果砧木根際分離的10株解磷菌的解磷量及菌液pHFig.3 Phosphorus solubility and pH value of the bacteria solution of 10 strains isolated from rhizosphere of apple stock Malus xiaojinensis

2.4 解磷菌的酸性磷酸酶活性

有學(xué)者[28]認(rèn)為，細(xì)菌分泌酸性磷酸酶的活性與解磷菌的解磷能力有關(guān)，因此本研究對(duì)這10株解磷菌進(jìn)行酸性磷酸酶活性的定性和定量的檢測(cè)。在產(chǎn)生溶磷圈的蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基平板上滴加1 mLpNPP，覆蓋溶磷圈，10株解磷菌均有黃色產(chǎn)生(圖4(a)和(b))，說(shuō)明這些解磷菌都能夠分泌酸性磷酸酶。同時(shí)定量檢測(cè)解磷菌的酸性磷酸酶活性(圖4(c))，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)sbM4的酸性磷酸酶活性最高，達(dá)到44.24 μg/(mL·h)(pNPP)，菌株P(guān)sbM3的酸性磷酸酶活性次之，為22.63 μg/(mL·h)(pNPP)。

(a)解磷菌未進(jìn)行磷酸酶顯色反應(yīng)前； (b)解磷菌進(jìn)行磷酸酶顯色反應(yīng)后； (c)10株解磷菌的磷酸酶活性(a) Phospholytic bacteria before phosphatase chromogenic reaction; (b) Phospholytic bacteria after phosphatase chromogenic reaction; (c) Phosphatase activity of 10 strains of phosphatolytic bacteria圖4 解磷菌酸性磷酸酶顯色反應(yīng)和10株解磷菌的酸性磷酸酶活性Fig.4 Phosphatase chromogenic reaction and phosphatase activity of 10 phosphatase producing strains

2.5 解磷菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

為了對(duì)菌種進(jìn)行更好的應(yīng)用，需要篩選出能夠快速增殖的株系。通過(guò)對(duì)解磷菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)擬合發(fā)現(xiàn)，多數(shù)解磷菌生長(zhǎng)迅速，在2 h內(nèi)即進(jìn)入對(duì)數(shù)期，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，但菌株之間的生長(zhǎng)繁殖能力存在一定差異(圖5)。特別是PsbM4，其在培養(yǎng)過(guò)程中滯后期較長(zhǎng)，在6 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，20 h進(jìn)入穩(wěn)定期，繁殖速度較慢。

2.6 優(yōu)勢(shì)解磷菌的篩選及菌株鑒定

對(duì)解磷菌株的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)基因序列比對(duì)分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖6)， 發(fā)現(xiàn)10個(gè)菌株可以歸為3個(gè)主要的菌屬(Acinetobacter、Enterobacter和Pseudomonas)中。在解磷優(yōu)勢(shì)菌的篩選中，以各菌株的解磷能力和酸性磷酸酶的活性為主要篩選標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)前面的試驗(yàn)結(jié)果可知，PsbM4的解磷能力僅次于PsbM10且其酸性磷酸酶的活性明顯高于其他菌株，所以本研究重點(diǎn)關(guān)注PsbM4。通過(guò) BLAST比對(duì)并使用 MEGA7 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，PsbM4顯示與腸桿菌屬成員EnterobactercloacaeMG274270.1具有最高同源性。隨后，將其作為優(yōu)勢(shì)解磷菌株進(jìn)行研究。

2.7 菌株回接擬南芥結(jié)果

為了驗(yàn)證PsbM4是否有利于植物的生長(zhǎng)，將菌株回接到擬南芥根系周?chē)?。挑PsbM4單菌落至LB培養(yǎng)基，在180 r/min 37 ℃培養(yǎng)24 h后用無(wú)菌水調(diào)整細(xì)菌的OD600為1.0，在每盤(pán)培養(yǎng)基中加入20 μL的菌液且用涂布器推開(kāi)。將擬南芥分別移栽至MS、缺磷和缺磷加菌3組培養(yǎng)基中，6 d后進(jìn)行拍照并進(jìn)行根系pH顯色。

從圖7(c)可以看出，缺磷加解磷菌培養(yǎng)基中擬南芥的根系周?chē)忻黠@的解磷圈出現(xiàn)， 這說(shuō)明培養(yǎng)基中的部分植酸鈣被解磷菌分解；而且相比于缺磷培養(yǎng)基(圖7(b)所示)，加菌培養(yǎng)基的植株更大且葉片更綠。同時(shí)，將擬南芥根系用去離子水清洗3次，用吸水紙將根系表面水分吸干，將根系進(jìn)行pH顯色發(fā)現(xiàn)，若有黃色出現(xiàn)說(shuō)明根系分泌出酸性物質(zhì)。如圖7(c)所示，缺磷加菌培養(yǎng)基擬南芥根系周?chē)悬S色出現(xiàn)，這說(shuō)明其根系分泌出酸性物質(zhì)，而如圖7(a)和(b)所示，缺磷培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基并無(wú)顏色變化。

圖5 從蘋(píng)果砧木小金海棠分離的 10 株解磷菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.5 Growth curve of 10 phosphate-degrading bacteria isolated from apple stock Malus xiaojinensis

圖6 從小金海棠蘋(píng)果砧木根際分離的10株解磷菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of estbliashed based on 16S rDNA sequences of 10 phosphatolytic bacteria isolated from apple stock Malus xiaojinensis

(A)和(a) MS培養(yǎng)基; (B)和(b)缺磷培養(yǎng)基; (C)和(c)缺磷加解磷菌培養(yǎng)基(A) and (a) MS medium; (B) and (b) phosphorus deficient medium; (C) and (c) phosphorus-deficient admixture medium for phosphorus-deficient bacteria圖7 各處理組擬南芥的表型及pH顯色情況Fig.7 Phenotype and pH color development of Arabidopsis thaliana in each treatment group

3 討 論

隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，人們對(duì)園藝產(chǎn)品的需求在不斷增加，相應(yīng)的，園藝產(chǎn)品對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的需求也在不斷增加，致使全國(guó)耕地土壤速效磷含量逐年下降。在土壤磷循環(huán)過(guò)程中，解磷微生物起著重要的作用。目前，對(duì)于解磷細(xì)菌篩選的研究主要集中在大田作物，對(duì)于果樹(shù)根際解磷菌的報(bào)道還很少。根際土壤解磷菌在土壤中的數(shù)量及生態(tài)分布主要受宿主植物基因型、土壤類(lèi)型和耕作方式等因素影響[29]。大田作物根際解磷菌多為芽孢桿菌屬和假單胞菌屬，而Zaffar等[30]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果根際土壤中存在大量的芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和微球菌屬。對(duì)解磷菌解磷能力的相關(guān)研究表明，其解磷能力的大小主要是由菌株自身的特性所決定的，有學(xué)者認(rèn)為解磷能力與菌株分泌的蘋(píng)果酸和草酸相關(guān)[31-32]，還有學(xué)者認(rèn)為磷酸酶對(duì)解磷菌的解磷效果有重要影響[33]，磷酸酶活性越高，解磷能力越強(qiáng)。

在本研究中選擇的原產(chǎn)我國(guó)對(duì)磷具有高效吸收特性的蘋(píng)果砧木小金海棠，篩選到具有礦化有機(jī)磷的根際解磷菌主要為不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌屬和假單胞菌屬，這說(shuō)明根際土壤解磷菌的種群類(lèi)型與宿主基因型確實(shí)有一定的關(guān)系，與前人研究相符。運(yùn)用溶磷圈法和鉬銻抗比色法對(duì)10 株解磷菌的解磷能力及酸性磷酸酶活性進(jìn)行綜合測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)后的菌液上清液的pH均比初始pH低，這極有可能是解磷菌在解磷的過(guò)程中產(chǎn)生了酸性磷酸酶等物質(zhì)，礦化了培養(yǎng)基中的植酸鈣產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷，從而引起了pH的下降。綜合分析10株解磷菌的溶磷圈大小、解磷能力和酸性磷酸酶活性，發(fā)現(xiàn)PsbM4體現(xiàn)了較高的解磷能力和酸性磷酸酶活性，因此將它作為篩選到的優(yōu)勢(shì)候選菌株，將其回接到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)解磷菌能促進(jìn)擬南芥生長(zhǎng)，解磷菌同時(shí)影響了擬南芥的根際pH，導(dǎo)致擬南芥的根際pH下降，這可能是由于解磷菌分泌的酸性磷酸酶導(dǎo)致的結(jié)果，與測(cè)定解磷菌能力時(shí)菌液pH下降的結(jié)果相同。

未來(lái)會(huì)將解磷菌進(jìn)一步回接到蘋(píng)果苗并探究解磷菌的促吸磷機(jī)制，由于從蘋(píng)果砧木小金海棠中分離篩選出的解磷菌，與蘋(píng)果根系互作性較好，對(duì)土壤環(huán)境的適應(yīng)性也更強(qiáng)，對(duì)于開(kāi)發(fā)解磷菌肥將具有一定意義。