窖泥中高產己酸功能菌的分離篩選及代謝功能的研究

張 敏，郭 敬，楊玉珍，李 擎，任國軍

（內蒙古河套酒業(yè)集團股份有限公司技術中心，內蒙古巴彥淖爾 015400）

窖泥是濃香型白酒釀造的基礎，是釀酒功能菌繁衍棲息的場所[1]。濃香型酒功能菌區(qū)系是一個復雜的微生物群體?，F(xiàn)代科學技術的發(fā)展揭示窖泥微生物的主體功能菌——厭氧梭狀芽孢桿菌，棲息于窖內，它們根據自身特點，吸收糟醅體系中的營養(yǎng)物質，生長繁殖并進行新陳代謝，使簡單的物質進行復雜的生化合成[2]。尤其以己酸功能菌為主的微生物生長繁殖、代謝、相互協(xié)調，形成了以己酸乙酯為主體香的濃香型白酒的典型風格[3]。

本試驗目的在于找到濃香型白酒窖泥中高產己酸的功能菌株，并對其進行代謝功能的研究，以提高窖泥的生香功能及濃香型白酒中己酸乙酯的含量。本試驗對于穩(wěn)定公司窖泥質量具有重要意義，為濃香型白酒生產提供扎實的理論依據，同時善改良酒質提供微生物資源。

試驗研究主要分為兩個方面：一是從本廠原酒車間老窖泥（窖底泥、窖壁泥）進行富集培養(yǎng)、分離、篩選、復配試驗，篩選到健壯、活力強、高產己酸的菌種。二是對篩選得到的菌種進行產酸性能研究、代謝產物生化性能鑒定以及菌種穩(wěn)定性試驗，優(yōu)選得到適合本地區(qū)土壤、水質、氣候環(huán)境的優(yōu)良菌種，運用于窖泥車間和原酒車間。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 樣品來源

從本廠原酒車間8 個濃香型大曲酒發(fā)酵池中分別取窖底泥和窖壁泥。

1.1.2 儀器設備

島津GC-8A 氣相色譜儀、強極性定制填充柱（1/8′×2M）、生物安全柜、干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、立式高壓滅菌鍋、電子分析天平、顯微鏡、YQX 型厭氧培養(yǎng)箱、酸度計、恒溫水浴鍋等。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）富集及培養(yǎng)用培養(yǎng)基：乙酸鈉0.5 %，硫酸銨0.05%，磷酸氫二鉀0.04%，硫酸鎂0.02%，酵母浸粉0.4%，無水乙醇2%，碳酸鈣1%（無水乙醇和碳酸鈣接種時加入），pH值自然。

（2）分離培養(yǎng)基（固體巴氏培養(yǎng)基）：乙酸鈉0.5 %，硫酸銨0.05 %，磷酸氫二鉀0.04 %，硫酸鎂0.02 %，酵母浸粉0.4 %，瓊脂2 %，無水乙醇2 %（滅菌后使用前加入），pH值自然。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 高產己酸功能菌的分離純化

1.2.1.1 富集培養(yǎng)（菌種熱處理）

高產己酸功能菌的分離基質為車間窖底泥和窖壁泥；取不同班組不同窖齡窖壁泥和窖底泥（選取感官較好，酒樣己酸乙酯含量較高的窖泥），各稱取窖泥33 g，放入裝有少量液體巴氏培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，采用水浴鍋熱處理的方法，在85 ℃水浴鍋中熱處理6～8 min，冷卻至30～40 ℃，在無菌條件下繼續(xù)添加液體巴氏培養(yǎng)基至三角瓶口部，再加2～3滴無水乙醇封口，34 ℃兼性厭氧培養(yǎng)10～15 d（產氣結束）。然后，挑選出產氣較早、較多的三角瓶，放入85 ℃水浴鍋中熱處理6～8 min（己酸菌孢子具有耐熱性，采用熱處理可殺死雜菌及己酸菌繁殖體，純化菌種，同時激活己酸菌種，促進其迅速繁殖，從而得到純化菌種的目的），冷卻后以15 %的接種量接種于事先備好的裝有新鮮液體巴氏培養(yǎng)基的三角瓶中，添滿三角瓶，并封口，34 ℃兼性厭氧培養(yǎng)7～10 d，按此方法連續(xù)傳代3次。

1.2.1.2 初篩（平板分離）

根據培養(yǎng)液的檢測結果，選取己酸含量較高的富集培養(yǎng)液進行平板分離。選用常規(guī)梯度稀釋、平板傾注分離的方法以及產酸菌分離方法（透明圈法和變色圈法）。常規(guī)梯度稀釋、平板傾注分離的方法：將選取的富集培養(yǎng)液進行10 倍梯度稀釋，從合適稀釋度（10-3～10-8）的稀釋液中分別吸取0.5 mL加入空皿中，每一稀釋度做2 個平皿，放于厭氧包和厭氧盒中，于34 ℃嚴格厭氧培養(yǎng)5～7 d。

1.2.1.3 復篩（試管和三角瓶液體培養(yǎng)）

觀察平板分離得到的單菌落，并挑選出生長良好的單菌落，按不同菌落形態(tài)，將選取的單菌落挑到盛有8 mL 已滅菌的液體培養(yǎng)基試管中，34 ℃恒溫兼性厭氧培養(yǎng)或嚴格厭氧培養(yǎng)7～10 d。觀察產氣情況，選取產氣較早、較多的試管轉接于盛有30 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基試管中，34 ℃恒溫兼性厭氧培養(yǎng)7～10 d，然后對其發(fā)酵液進行理化指標的檢測及分析，選取產己酸能力較高的菌株。將產己酸能力高的菌株傳代轉接于100 mL三角瓶及500 mL三角瓶，觀察其發(fā)酵情況、菌種生長情況及檢測其他指標。將產己酸菌較高的培養(yǎng)液制片，顯微鏡觀察菌種的生長情況及特點，并傳代觀察其穩(wěn)定性。選取初篩菌株進行己酸含量、代謝產物的測定，篩選到健壯、活力強、高產己酸的功能菌種。

1.2.2 代謝產物分析方法

1.2.2.1 硫酸銅顯色法（定量）

吸取4 mL 培養(yǎng)液于試管中，再加入4 mL 的2 %硫酸銅和2 mL 無水乙醚，混勻后靜置分層，如果乙醚層呈現(xiàn)藍色則說明有己酸產生。

1.2.2.2 氣相色譜法（定量定性）

樣品處理：取發(fā)酵培養(yǎng)液1 mL 加入0.1 mL 鹽酸酸化后，振蕩器振搖，然后用50%的乙醇溶液定容至10 mL，振蕩器振搖后吸取上清液，用0.2 μm濾膜過濾，上氣相色譜檢測乙酸、丙酸、丁酸和己酸。

氣相色譜儀條件為：總壓力4.0 kg/cm2，色譜柱壓力：1.0 kg/cm2，進樣口溫度：190 ℃，檢測器溫度：190 ℃，柱箱溫度：170 ℃，空氣壓力0.5 kg/cm2，氫氣壓力0.8 kg/cm2。進樣量1.0 μL。

采用外標法，配制200 mg/100 mL 乙酸、丙酸、丁酸和己酸混標，配制成10 mL，用50 %乙醇溶液定容，待用。

1.2.3 微生物計數(shù)方法

采用血球計數(shù)板法計數(shù)以及觀察菌種生長情況。

1.2.4 高產己酸功能菌培養(yǎng)條件優(yōu)化及產酸特性的研究

1.2.4.1 培養(yǎng)溫度對高產己酸功能菌的影響

培養(yǎng)基初始pH6.93，按15 %的接種量接入高產己酸功能菌種子液，用250 mL 三角瓶兼性厭氧培養(yǎng)，在不同的溫度（28 ℃、30 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃和40 ℃）條件下分別培養(yǎng)8 d、16 d 和33 d 取樣，測定代謝產物，研究不同溫度對高產己酸功能菌產酸能力的影響，同時在培養(yǎng)33 d 時檢測最終pH值。

1.2.4.2 初始pH值對高產己酸功能菌的影響

使用鹽酸和氫氧化鈉調整培養(yǎng)液的初始pH值，分別調pH 值至3.35、4.07、4.53、5.05、5.57、6.00、6.53、6.93、7.49、7.95 和8.47，接種后置于34 ℃培養(yǎng)箱中兼性厭氧培養(yǎng)，不同的pH 值下分別培養(yǎng)8 d、16 d 和33 d 取樣，測定代謝產物，研究不同初始pH值對高產己酸功能菌產酸能力的影響。

1.2.4.3 兼性厭氧與嚴格厭氧對高產己酸功能菌的影響

采用100 mL 三角瓶，三角瓶液體裝滿，15%接種量接入高產己酸功能菌種子液，分別置于普通培養(yǎng)箱兼性厭氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)箱中嚴格厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34 ℃。每天跟蹤檢測代謝產物，跟蹤到7 d，研究不同空氣接觸對己酸菌產酸能力的影響，并找出高產己酸功能菌在不同的培養(yǎng)條件下的代謝特點。

1.2.5 高產己酸功能菌在原酒車間應用試驗

原酒車間對高產己酸功能菌的應用試驗，主要采用淋窖的方法，發(fā)酵結束后取楂甲酒樣和翻甲酒樣，并與對照組不加高產己酸功能菌進行淋窖對比。

2 結果與分析

2.1 高產己酸功能菌的分離篩選結果

本研究經過富集培養(yǎng)、初篩和復篩，利用硫酸銅顯色法初步檢測己酸含量，篩到1 株穩(wěn)定高產己酸的功能菌，命名為HJ31#，對HJ31#菌株產己酸量用氣相色譜法進行檢測，結果見表1。由表1 可知，HJ31#菌株的產己酸量為1394 mg/100 mL、1340 mg/100 mL、1266 mg/100 mL、1040 mg/100 mL和1262 mg/100 mL，平均值為1260 mg/100 mL。

表1 HJ31#菌株產己酸量的檢測

2.2 高產己酸功能菌HJ31#的菌落形態(tài)

高產己酸功能菌HJ31#分離基質——老窖泥感官評定為：黃褐色，有老窖泥氣味和酯香酒香，無其他異雜味，香味較持久。經過菌落形態(tài)及革蘭氏染色觀察，HJ31#菌株革蘭氏染色觀察多數(shù)屬革蘭氏陰性菌，鏡檢初步確定己酸菌的菌體活躍健壯，營養(yǎng)細胞呈桿狀，芽孢囊膨大，呈梭狀。菌落呈黃色圓形，邊緣規(guī)則，扁平。

2.3 高產己酸功能菌HJ31#培養(yǎng)條件及產酸特性研究結果

通過對高產己酸功能菌HJ31#不同培養(yǎng)溫度不同時間、不同初始pH 值不同時間、兼性厭氧與嚴格厭氧不同培養(yǎng)時間條件進行優(yōu)化，經氣相色譜法檢測4 種酸類物質含量的變化，從而分析高產己酸功能菌HJ31#代謝產物變化規(guī)律。

2.3.1 培養(yǎng)溫度對HJ31#菌種的影響

HJ31#菌種不同培養(yǎng)溫度8 d、16 d 和33 d 分別取樣跟蹤檢測代謝產物，同時檢測不同培養(yǎng)溫度對HJ31#菌種最終pH 值的影響，檢測結果見圖1—圖4。

從以上檢測HJ31#菌種不同培養(yǎng)溫度、不同時間代謝產物結果看：①HJ31#菌種在培養(yǎng)8 d 時，36 ℃培養(yǎng)己酸含量最高，在培養(yǎng)16 d 時，34 ℃培養(yǎng)己酸含量最高，培養(yǎng)33 d 時，36 ℃培養(yǎng)己酸含量最高，由此可知，HJ31#菌種最佳培養(yǎng)溫度為34～36 ℃，在此溫度條件下，HJ31#菌種活性最大，有最高的產己酸能力；②乙酸和丁酸含量在溫度條件不合適的情況下，對產己酸有一定的影響，乙酸和丁酸在轉化己酸時不夠徹底，丙酸含量較低，不做分析；③在不同溫度下，HJ31#菌種隨著培養(yǎng)時間的延長，己酸含量也略有上升。HJ31#菌種在不同溫度培養(yǎng)下，33 d 時檢測pH 值，沒有很大變化，都在6.0以上。

2.3.2 初始pH值對HJ31#菌種的影響

HJ31#菌種不同初始pH 值培養(yǎng)8 d、16 d 和33 d分別取樣跟蹤檢測代謝產物，檢測結果見圖5—圖7。

從以上檢測HJ31#菌種不同初始pH 值、不同培養(yǎng)時間代謝產物結果看：①HJ31#菌種在培養(yǎng)8 d，初始pH 值在6.00 時，己酸含量最高，培養(yǎng)16 d，初始pH 值在7.95 時，己酸含量最高，培養(yǎng)33 d，初始pH 值在6.93 時，己酸含量最高，由此可知，HJ31#菌種最佳初始pH 值為6.00～7.95，在此初始pH 值條件下，HJ31#菌種活性最大，有最高的產己酸能力；②乙酸含量和丁酸含量在培養(yǎng)8 d 時，如果初始pH值不適宜，轉化己酸的能力就差。隨著時間的延長，乙酸和丁酸向己酸轉化會越來越徹底，但是不如初始pH 值范圍內轉化己酸能力強。丙酸含量較低，不做分析。

對高產己酸功能菌的產酸特性進行研究發(fā)現(xiàn)，HJ31#菌種的最佳培養(yǎng)溫度為34～36 ℃，最佳初始pH 值為6.00～7.95。該菌株在此溫度和初始pH 值條件下，菌種活性最大，有最高的產己酸能力。

2.3.3 兼性厭氧與嚴格厭氧對HJ31#菌種的影響

HJ31#菌種兼性厭氧與嚴格厭氧培養(yǎng)代謝產物1～7 d跟蹤檢測數(shù)據，見圖8、圖9。

從圖8 跟蹤檢測HJ31#菌種兼性厭氧培養(yǎng)7 d代謝產物結果分析：乙酸呈先升高后降低的趨勢。丁酸呈先降低，隨后升高，最后降低的趨勢，最高值出現(xiàn)在第4 天，為135 mg/100 mL。己酸在前4 天緩慢上升，到第5 天時急劇上升，第7 天時達到最高，為989 mg/100 mL。因丙酸含量較低，不做分析。

從圖9 跟蹤檢測HJ31#菌種嚴格厭氧培養(yǎng)7 d代謝產物結果分析：乙酸呈先升高后降低的趨勢。丁酸呈先降低，隨后升高，最后降低的趨勢，最高值出現(xiàn)在第3 天為144 mg/100 mL。己酸在前3 天緩慢上升，到第4 天時急劇上升，第6 天時達到最高，為1269 mg/100 mL。丙酸含量較低，不做分析。

分析不同氧氣接觸水平對HJ31#菌種的影響：HJ 31#菌種兼性厭氧和嚴格厭氧培養(yǎng)乙酸和丁酸變化趨勢一致，己酸在嚴格厭氧條件下第4 天時急劇上升，比兼性厭氧培養(yǎng)大量生成己酸要提前1 天，而且在嚴格厭氧條件下，己酸含量比兼性厭氧條件高，最高為1269 mg/100 mL。己酸量與菌種生長旺盛程度成正比。

同時跟蹤檢測HJ31#菌種的pH 值，當pH 值在6.0～7.0 之間時，HJ31#菌種的產己酸量均達到1000 mg/100 mL 以上，鏡檢菌種總菌數(shù)較多，健壯中桿菌多，活力較好。

2.4 高產己酸功能菌HJ31#原酒車間應用結果

原酒車間對HJ31#菌種的應用試驗，采用淋窖的方法，結果見圖10。

分析：從楂甲和翻甲酒樣檢測指標看，使用HJ31#菌種淋窖后，對產己酸乙酯量有所提升，但是效果不顯著。

3 結論

通過多次對原酒車間老窖泥菌種進行分離篩選，從窖底泥中篩選得到菌體健壯、活力較好、己酸產量高、復合香氣濃郁，遺傳性狀較穩(wěn)定的菌株。革蘭氏染色觀察分離篩選得到的菌，多數(shù)屬革蘭氏陰性菌，并將其命名為HJ31#。

通過對產酸特性的研究，窖泥分離篩選高產己酸功能菌HJ31#菌株的最佳培養(yǎng)溫度為34～36 ℃，最佳初始pH 值為6.00～7.95。HJ31#菌株兼氧、厭氧培養(yǎng)對菌種在代謝產物轉化方面會存在一定的影響，在兼氧、厭氧培養(yǎng)時，乙酸、丁酸和己酸的變化規(guī)律較一致，HJ31#菌株在厭氧培養(yǎng)條件下產己酸含量比兼氧條件下要高，HJ31#菌株在厭氧條件下，最高產己酸量為1269 mg/100 mL。己酸量與菌種生長旺盛程度成正比。