真皮脫細(xì)胞基質(zhì)微載體構(gòu)建可注射軟骨的初步研究

姚琳 賈立濤 劉豫 曹誼林 周廣東

組織工程軟骨應(yīng)用于整形外科時(shí)需滿足創(chuàng)傷小、可塑性好等要求，可注射軟骨應(yīng)運(yùn)而生[1]。目前，整形外科新興的可注射軟骨技術(shù)是軟骨膜片技術(shù)[2]，軟骨膜片技術(shù)利用大量軟骨細(xì)胞培養(yǎng)而成，經(jīng)勻漿化處理可用于微創(chuàng)隆鼻、下巴填充或面部凹陷填充，具有不依賴支架材料、可塑性好等優(yōu)點(diǎn)，但需要大量軟骨細(xì)胞，且培養(yǎng)、制備成本極高。

微載體因培養(yǎng)空間利用效率高且能實(shí)現(xiàn)可注射而備受關(guān)注[3]，但在組織工程與整形美容領(lǐng)域的應(yīng)用尚未見報(bào)道。本研究將軟骨細(xì)胞接種于微載體后體外動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，探索真皮脫細(xì)胞基質(zhì)微載體構(gòu)建可注射軟骨的可能性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

真皮脫細(xì)胞基質(zhì)微載體(江蘇優(yōu)創(chuàng)醫(yī)學(xué)科技有限公司)，采用豬真皮細(xì)胞外基質(zhì)為原料，經(jīng)病毒滅活與脫細(xì)胞等工藝制備而成，為一種多孔性的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，粒徑≤3 mm。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性裸鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)12只，5～7周齡，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組(n=6)。健康山羊(上海甲干生物科技有限公司)，雌雄不限，8月齡，用于軟骨細(xì)胞的獲取。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材和試劑

膠原酶(Sigma公司，美國(guó))；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B(Gibco公司，美國(guó))；蘇木素-伊紅染色試劑、番紅固綠染色液(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)。3D FloTrix miniSpin 生物反應(yīng)器(3D FTmS-1-4，北京華龕生物科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

將分離消化培養(yǎng)得到的軟骨細(xì)胞與真皮脫細(xì)胞基質(zhì)微載體混合，實(shí)驗(yàn)組置于3D生物反應(yīng)器中動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，對(duì)照組采用靜態(tài)培養(yǎng)。體外培養(yǎng)4周后注射入裸鼠皮下，8周后取材，檢測(cè)成軟骨指標(biāo)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1軟骨細(xì)胞獲取

在無菌操作臺(tái)中分離獲取山羊耳軟骨，置于0.15%膠原酶中震蕩消化8 h。濾網(wǎng)過濾消化后的混懸液，1 500 r/min離心混懸液5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用含10%血清和1%抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，以1×105cells/mL的密度接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.2材料準(zhǔn)備

將真皮脫細(xì)胞基質(zhì)微載體置于含10%血清和1%抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.5.3體外培養(yǎng)及觀察指標(biāo)

將體外培養(yǎng)后的軟骨細(xì)胞8×107個(gè)接種于4 g微載體中，同時(shí)加入40 mL含10%血清和1%抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基，混合培養(yǎng)24 h后行電鏡觀察。將以上混合培養(yǎng)物平均分為兩組，實(shí)驗(yàn)組置于125 mL生物反應(yīng)器瓶中，將生物反應(yīng)器瓶放在3D FloTrix miniSpin生物反應(yīng)器底座上，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中動(dòng)態(tài)培養(yǎng)4周；對(duì)照組置于50 mL離心管中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)4周。體外培養(yǎng)2周、4周時(shí)分別取少量混合物在掃描電鏡下觀察。體外培養(yǎng)4周后取少量樣品進(jìn)行活死細(xì)胞染色，染色后在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5.4體內(nèi)培養(yǎng)及觀察指標(biāo)

體外培養(yǎng)4周后，將微載體與細(xì)胞形成的團(tuán)狀物取出，PBS清洗3次，將團(tuán)狀物剪碎成顆粒狀，灌裝至1 mL注射器中，使用注射器將各組混合物0.5 mL注射到各組裸鼠皮下。體內(nèi)培養(yǎng)8周后取材，進(jìn)行大體觀察、HE染色、番紅固綠染色。

2 結(jié)果

2.1 微載體性狀特征

真皮脫細(xì)胞基質(zhì)微載體以豬真皮細(xì)胞外基質(zhì)為原料，呈顆粒狀，粒徑≤3 mm。光鏡下見微載體呈不規(guī)則團(tuán)狀，平均直徑約3 mm，內(nèi)部可見纖維形態(tài)。電鏡觀察結(jié)果與光鏡觀察結(jié)果一致(圖1)。

2.2 體外培養(yǎng)觀察

細(xì)胞接種于微載體后混合培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞與微載體充分接觸，24 h后可見細(xì)胞附著于微載體上，完成細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別動(dòng)態(tài)與靜態(tài)培養(yǎng)2周后，電鏡顯示實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞附著于微載體后大量增殖，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，形成明顯聚團(tuán)現(xiàn)象；對(duì)照組軟骨細(xì)胞附著于微載體后同樣發(fā)生增殖并分泌基質(zhì)，但聚團(tuán)現(xiàn)象不明顯。體外培養(yǎng)4周后電鏡觀察顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖聚團(tuán)更明顯，質(zhì)韌，初步呈現(xiàn)軟骨特征；對(duì)照組軟骨基質(zhì)分泌多，覆蓋微載體表面。體外培養(yǎng)4周的活死細(xì)胞結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞活力較好，與微載體結(jié)合更充分，細(xì)胞進(jìn)入微載體內(nèi)部；對(duì)照組結(jié)合于微載體表面(圖2)。

A、B：微載體大體觀；C：微載體電鏡下形態(tài)；D：微載體光鏡下形態(tài) A, B: General view of cytodex; C: Cytodex morphology under electron microscope; D: Cytodex morphology under light microscope圖1 微載體形態(tài)Fig. 1 Morphology of cytodex

A：動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境；B：體外動(dòng)態(tài)培養(yǎng)2周電鏡下形態(tài)；C：體外動(dòng)態(tài)培養(yǎng)4周電鏡下形態(tài)；D：靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境；E：體外靜態(tài)培養(yǎng)2周電鏡下形態(tài)；F：體外靜態(tài)培養(yǎng)4周電鏡下形態(tài)；G：細(xì)胞接種微載體24 h電鏡下形態(tài)；H：體外動(dòng)態(tài)培養(yǎng)4周活死細(xì)胞染色結(jié)果；I：體外靜態(tài)培養(yǎng)4周活死細(xì)胞染色結(jié)果 A: Dynamic culture environment; B: Morphology under electron microscope after 2 weeks of dynamic culture in vitro; C: Morphology under electron microscope after 4 weeks of dynamic culture in vitro; D: Static culture environment; E: Morphology under electron microscope after 2 weeks of static culture in vitro; F: Morphology under electron microscope after 4 weeks of static culture in vitro; G: Morphology under electron microscope after cells inoculated with cytodex for 24 hours; H: Results of live-dead cell staining after 4 weeks of dynamic culture in vitro; I: Results of live-dead cell staining after 4 weeks of static culture in vitro圖2 體外培養(yǎng)觀察Fig. 2 Observation of culture in vitro

2.3 體內(nèi)培養(yǎng)觀察

經(jīng)體外培養(yǎng)4周后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別注射入裸鼠皮下。體內(nèi)培養(yǎng)8周后取材，可見兩組均形成了軟骨樣組織塊，實(shí)驗(yàn)組的組織塊呈白色，表面光滑，質(zhì)硬有彈性；對(duì)照組的組織塊呈白色略黃，表面光滑，質(zhì)硬但略軟于實(shí)驗(yàn)組，彈性尚可(圖3)。

HE與Safranin-O染色結(jié)果顯示，兩組組織塊均出現(xiàn)軟骨陷窩，實(shí)驗(yàn)組的組織塊中心部分軟骨陷窩較為連續(xù)，周圍部分胞外基質(zhì)環(huán)繞，形成較為成熟的軟骨組織；對(duì)照組的組織塊軟骨陷窩呈島狀，結(jié)締組織與胞外基質(zhì)分布較多(圖4)。

A：實(shí)驗(yàn)組裸鼠體內(nèi)組織塊；B：對(duì)照裸鼠體內(nèi)組織塊 A: Tissue in nude mice of experimental group; B: Tissue in nude mice of control group圖3 體內(nèi)培養(yǎng)大體觀察Fig. 3 General observation of culture in vivo

A：實(shí)驗(yàn)組HE染色；B：對(duì)照組HE染色；C：實(shí)驗(yàn)組番紅固綠染色；D：對(duì)照組番紅固綠染色 A: HE staining in the experimental group; B: HE staining in the control group; C: Safranin-O staining in the experimental group; D: Safranin-O staining in the control group圖4 體內(nèi)培養(yǎng)組織學(xué)觀察(4×)Fig. 4 Histological observation of culture in vivo (4×)

3 討論

利用組織工程學(xué)基本原理，體外構(gòu)建軟骨，是實(shí)現(xiàn)軟骨再生的新方法[4-6]?？勺⑸滠浌且騽?chuàng)傷小、易操作、塑形效果好等優(yōu)點(diǎn)成為整形外科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。可注射軟骨的構(gòu)建需要大量種子細(xì)胞，種子細(xì)胞在擴(kuò)增過程中，隨著代次增高，會(huì)逐漸呈現(xiàn)老化的現(xiàn)象，喪失軟骨細(xì)胞特征性表型[7]。本研究使用的真皮脫細(xì)胞基質(zhì)微載體具有極高的比表面積，相較于平面培養(yǎng)可以節(jié)約大量種子細(xì)胞[8]。且微載體具備一定的形態(tài)和力學(xué)支撐，可以滿足動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的需求。

軟骨構(gòu)建需要一定的力學(xué)刺激，適當(dāng)?shù)撵o水壓有助于維持軟骨的表型和功能[9-11]。本研究中，我們利用培養(yǎng)瓶持續(xù)攪拌，維持動(dòng)態(tài)環(huán)境培養(yǎng)4周，同時(shí)將對(duì)照組置于離心管內(nèi)靜止培養(yǎng)。結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與微載體結(jié)合更充分，細(xì)胞進(jìn)入微載體內(nèi)部；體內(nèi)培養(yǎng)8周的結(jié)果顯示，雖大體觀兩組無明顯差異，但組織學(xué)可見實(shí)驗(yàn)組軟骨形成更成熟。研究表明，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)能夠模擬正常組織微環(huán)境[12]，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)動(dòng)態(tài)環(huán)境所提供的壓力，有助于細(xì)胞與微載體的接觸以及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，即有助于微載體構(gòu)建軟骨。

本實(shí)驗(yàn)使用不具備免疫功能的裸鼠，對(duì)于具有免疫功能的大動(dòng)物，其體內(nèi)成軟骨的情況尚有待研究，下一步我們將對(duì)大動(dòng)物進(jìn)行相關(guān)探索，進(jìn)一步證實(shí)真皮脫細(xì)胞微載體的軟骨構(gòu)建功能。

4 結(jié)論

真皮脫細(xì)胞基質(zhì)微載體復(fù)合軟骨細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)可注射軟骨的構(gòu)建，且動(dòng)態(tài)培養(yǎng)效果優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)。