基因編輯技術(shù)在植物育種工作中的應(yīng)用

王一博 赫兆輝

摘 ? 要：基因編輯技術(shù)可以精準(zhǔn)定位基因組的特定位點(diǎn)，并通過插入、敲除及修飾特定的基因片段實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的定向控制，目前正處于快速發(fā)展階段。CRISPR/Cas9技術(shù)及單堿基編輯技術(shù)由于操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用靈活、效率高等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，在植物遺傳育種及性狀改良中同樣發(fā)揮著重要的作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有較好應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：基因編輯技術(shù);植物育種;應(yīng)用

1 ? 功能基因的敲除

利用 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除功能基因，目前在植物育種工作中尤為關(guān)鍵。這是由于 CRISPR/Cas9可以打破目標(biāo)基因的表達(dá)，當(dāng)Cas9和sgRNA切割目標(biāo)形成雙鏈斷裂時(shí)，一般編輯受體中的非同源性末端接合修復(fù)的錯(cuò)誤途徑會(huì)被優(yōu)先啟動(dòng)，在斷裂的附近位置產(chǎn)生堿基，然后插入到缺失部位，通常是1個(gè)堿基的插入，有時(shí)也為短片段缺失。目前，多目標(biāo)編輯技術(shù)的敲除原理，主要通過對(duì)不同的基因設(shè)計(jì)不同的sgRNA，將這些sgRNA表達(dá)小盒一起連接到表達(dá)載體中，并導(dǎo)入編輯的受體，這種技術(shù)能夠?qū)r(nóng)作物的多個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行改良。另外，多靶點(diǎn)編輯技術(shù)還可以在基因片段兩端分別設(shè)置一個(gè)靶點(diǎn)，以刪除目的基因片段，在作物育種方面有著較大的研究前景。

2 ? 基因插入與替換

在植物染色體上替換或定點(diǎn)插入基因序列是一個(gè)很難突破的技術(shù)問題，而CRISPR/Cas9技術(shù)顯著提高了這一難題的可操作性。在利用CRISPR/Cas9技術(shù)引入DNA雙鏈斷裂的同時(shí)，引入一個(gè)與斷裂處相似的供體DNA片段兩端序列相同的基因片段，這時(shí)同源性定向修復(fù)的方式將會(huì)有概率被編輯受體啟動(dòng)，而位于供體DNA上的基因片段會(huì)通過同源性定向修復(fù)重組整合到雙鏈斷裂的位置上。這種精準(zhǔn)、高效和靈活的編輯方式，可避免由非同源末端連接修復(fù)途徑造成的基因重排或缺失，從而穩(wěn)定聚合多個(gè)優(yōu)良性狀的控制基因，解決傳統(tǒng)育種過程中的難題，因此應(yīng)用前景更為廣闊[1]。盡管CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)在水稻、玉米、大豆、擬南芥、煙草等植物中廣泛應(yīng)用，但其編輯目標(biāo)通常局限于抗性基因，且效率不高。對(duì)此，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了兩種可提升植物基因精準(zhǔn)插入效率的通用策略：一是以小麥矮縮病毒W(wǎng)DV為載體，提高載體的拷貝數(shù)，從而顯著提升插入效率。經(jīng)驗(yàn)證，這種策略在水稻[2]中的插入效率高達(dá)19.4%。二是利用Cas9和一對(duì)gRNA將目標(biāo)序列從載體上“剪切”下來，再“粘貼”到植物基因組的靶位點(diǎn)上，這一策略利用雙鏈斷裂修復(fù)的非同源末端作為連接通路。目前這種通過“剪切”再“粘貼”實(shí)現(xiàn)靶向基因插入和替換[3]的方法已經(jīng)在水稻中實(shí)現(xiàn)。這些策略在CRISPR/Cas9的基礎(chǔ)上，為基因的定點(diǎn)插入被高效率地用于作物遺傳改良提供了可能。

3 ? 單堿基編輯

目前，單基因編輯最常用的手段是利用CRISPR/Cas9在靶位點(diǎn)引入突變，從而破壞靶細(xì)胞的功能。但由于其通常會(huì)產(chǎn)生無功能的蛋白，在植物遺傳改良過程中很少應(yīng)用。為了改變基因的功能，可以對(duì)單個(gè)或幾個(gè)堿基進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，形成功能獲得性突變，實(shí)現(xiàn)作物性狀的定向改良。因此，高效定向轉(zhuǎn)換基因組序列是CRISPR/Cas9技術(shù)用于改良遺傳育種過程中的關(guān)鍵所在，而單堿基編輯技術(shù)（Base Editor）恰好符合這一需求。

CRISPR/Cas9靶向編輯單個(gè)堿基的原理是將Cas9蛋白的突變體（Cas9n或dCas9）與胞嘧啶脫氨酶形成融合蛋白，被gRNA引導(dǎo)至靶位點(diǎn)，受脫氨酶的作用，靶位點(diǎn)附近的C（胞嘧啶）就脫氨為U（尿嘧啶），在DNA復(fù)制時(shí)可進(jìn)行U-T（胸腺嘧啶）轉(zhuǎn)換，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的C-T堿基替換。據(jù)研究表明，同一編輯系統(tǒng)對(duì)不同靶位點(diǎn)有較大差異的編輯效率，具體原因有待進(jìn)一步研究。此外，由于同源性定向修復(fù)效率和可操作性受限，利用Cas9介導(dǎo)的插入實(shí)現(xiàn)的單堿基替換，其應(yīng)用價(jià)值與單堿基編輯技術(shù)無法比擬。

4 ? 未來展望

雖然在植物遺傳育種中，CRISPR/Cas9技術(shù)是一種新興的操作手段，卻為農(nóng)作物遺傳改良提供了有力的技術(shù)支撐[4]。例如，以突變基因MLO的3個(gè)復(fù)制為準(zhǔn)確目標(biāo)，可直接獲得廣譜、持久抗白粉病的小麥材料[5]。此外，科學(xué)家們也將CRISPR/Cas9改變成抗病毒的新型工具，通過使用Cas9和靶細(xì)胞gRNA形成了擬南芥和煙草對(duì)靶病毒的免疫[6-8]。

新技術(shù)的出現(xiàn)必定面臨著新的挑戰(zhàn)和機(jī)遇，與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因植物相比，利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建的性狀改良植物，仍存在著很多未知及不確定性。因此，隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展及廣泛應(yīng)用，如何管理基因編輯的作物，將是一個(gè)值得深思的重要話題。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 劉耀光，李構(gòu)思，張雅玲，等.CRISPR/Cas植物基因組編輯技術(shù)研究進(jìn)展[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，40（5）：38-49.

[ 2 ] Wang MG，Lu YM，Botella JR，et al.Gene targeting by ho-mology-directed repair in rice using a geminivirus-basedCRISPR/Cas9 system[J].Mol Plant，2017（7）：1007-1010.

[ 3 ] Cheng AW，Wang HY，Yang H，et al.Multiplexed activationof endogenous genes by CRISPR-on，an RNA-guided?transcriptional activator system[J].Cell Res，2013，23（10）：1163-1171.

[ 4 ] Wolt JD，Wang K，Yang B.The regulatory status of genome-edited crops[J].Plant Biotechnol J，2016，14（2）：510-518.

[ 5 ] Wang YP，Cheng X，Shan QW，et al.Simultaneous editing?of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confersheritable resistance to powdery mildew[J].Nat Biotechnol，2014，32（9）：947-951.

[ 6 ] Ji X，Zhang H，Zhang Y，et al.Establishing a CRISPR-Cas-like immune system conferring DNA virus resistance inplants[J].Nat Plants，2015（1）：15144.

[ 7 ] Baltes NJ，Hummel AW，Konecna E，et al.Conferring resis-tance to geminiviruses with the CRISPR-Cas prokaryoticimmune system[J].Nat Plants，2015，1（10）：15145.

[ 8 ] Ali Z，Abulfaraj A，Idris A，et al.CRISPR/Cas9-mediatedviral interference in plants[J].Genome Biol，2015（16）：238.