紫菀石斛組培快繁技術研究

姜 艷，高 燕，李桂琳，李澤生，周侯光，羅 凱

（云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所，云南瑞麗678600）

紫菀石斛（Dendrobium transparens）是一種喜陰涼的多年生蘭科石斛屬（Dendrobium）草本植物，原產(chǎn)于緬甸、印度海拔1 500 m 的山中，花色素麗，玲瓏可愛，花姿優(yōu)雅，株型優(yōu)美，具有很高的觀賞價值。楊曉娜等［1］研究結(jié)果表明，紫菀石斛具有相當高的營養(yǎng)價值。近年來隨著生活水平的不斷提高，人們對紫菀石斛的需求量不斷增大，野生紫菀石斛資源產(chǎn)出量遠遠跟不上需求，人工栽培紫菀石斛便應運而生。目前紫菀石斛種苗繁殖主要是靠收集野生資源進行分株繁殖，增殖系數(shù)低，原材料浪費大；加之過度采挖，紫菀石斛野生資源日益枯竭。隨著紫菀石斛生產(chǎn)種植規(guī)模的擴大，分株繁殖已不能滿足市場對種苗的需求。近十多年來，隨著植物組培技術的發(fā)展以及生產(chǎn)需要，很多植物常利用組培快繁種苗，文心蘭、蝴蝶蘭、鐵皮石斛、鼓槌石斛等蘭科植物已經(jīng)實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)［2-5］。為了探索紫菀石斛組培育苗的最佳途徑，筆者于2017-2018 年對從緬甸引進的紫菀石斛野生蒴果種子開展無菌播種、原球莖誘導、增殖分化、壯苗生根、假植育苗和移栽技術試驗研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試紫菀石斛從緬甸引進，栽培于云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所石斛資源圃。選擇無病害、生長健壯植株上所結(jié)的發(fā)育正常、飽滿成熟、未開裂的蒴果為外植體。

1.2 方法

1.2.1 無菌播種

蒴果用0.1%洗潔精或洗衣粉洗凈，純凈水沖洗2～3 次，置于超凈工作臺上，用75%的酒精消毒60 s，10%次氯酸鈉溶液消毒15～20 min，無菌水清洗5～6 次，用無菌濾紙吸干表面水分，酒精燈烘烤外植體表面至干燥。切開蒴果，將種子均勻播種在5 種不同萌發(fā)培養(yǎng)基：A1）1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L，A2）1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥5 g/L，A3）1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L+香蕉泥5%，A4）1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L +6-BA 0.1 mg/L，A5）1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L+NAA 0.1 mg/L，每個處理接種5 瓶，先暗培養(yǎng)5 d，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。培養(yǎng)基pH 為5.8，培養(yǎng)溫度為22～25℃，光照強度為1 600～2 000 lx，光照時間8～10 h/d。培養(yǎng)50 d 后統(tǒng)計萌發(fā)率。

1.2.2 繼代增殖分化培養(yǎng)

將種子萌發(fā)形成的小芽接種于繼代增殖分化培養(yǎng)，以MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥50 g/L+香蕉泥30 g/L 為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（0.1、0.2、0.4 mg/L）或NAA（0.1、0.2、0.4 mg/L），共6 種培養(yǎng)基（B1-B6 處理），每種培養(yǎng)基接種10 瓶，每瓶接種10 株。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強度為1 800～2 200 Lx，光照時間10～12 h/d。培養(yǎng)50 d 后統(tǒng)計增殖倍數(shù)及生長狀況。

1.2.3 壯苗生根培養(yǎng)

將叢生芽分割成單芽，選取株高在3 cm 以上的單芽接種于不同壯苗生根培養(yǎng)基，以3/4 MS+蔗糖20 g/L+瓊脂5.0 g/L+NAA 0.5 mg/L 為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的馬鈴薯泥和香蕉泥：C1）香蕉泥100 g/L，C2）香蕉泥70 g/L+馬鈴薯泥30 g/L，C3）馬鈴薯泥100 g/L，C4）香蕉泥50 g/L+馬鈴薯泥50 g/L，共4 種培養(yǎng)基（C1-C4 處理），每種培養(yǎng)基接種10 瓶，每瓶接種10 株。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強度為1 800～2 200 lx，光照時間10～12 h/d。培養(yǎng)50 d 后統(tǒng)計生根率及生長狀況。

1.2.4 煉苗

選取生長一致、株高4～6 cm、根系3 cm 以上的瓶苗，分別置于蔭蔽度70%～80%的塑料大棚苗床上煉苗5、10、20、30 d，共4 個處理（D1-D4)，每個處理50 瓶。棚內(nèi)通風透氣，無漏雨，控制溫濕度。按照統(tǒng)一流程移栽，觀察不同煉苗時間的移栽成活率及生長狀況。

1.2.5 移栽

將株高5 cm 以上、煉苗20 d 的生根苗取出，用清水洗干凈根部的培養(yǎng)基，在50%多菌靈可濕性粉劑1 000 倍溶液中浸泡10 min，撈出放入透氣的容器內(nèi)，均勻攤開，晾干至根部發(fā)白，分別移栽至4 種不同的基質(zhì)：E1）刨花，E2）樹皮，E3）樹皮屑/刨花體積比=1/1，E4）樹皮屑/水苔體積比=2/1，3 株/叢，株行距5 cm×5 cm。蔭蔽度70%～80%，濕度60%～70%，溫度控制26～30℃。移栽60 d后統(tǒng)計成活率及生長狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配方對紫菀石斛種胚萌發(fā)率的影響

無菌播種12～18 d 后，種子慢慢吸水膨大，由金黃色變成綠色，40 d 后從種胚誘導出大量的原球莖，50 d 后原球莖萌發(fā)出綠色芽尖（圖1）。紫菀石斛種胚在不同的培養(yǎng)基中都能萌發(fā)，由表1可以看出，以A2 處理（1/2 MS +蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥5 g/L 培養(yǎng)基）種子萌發(fā)率最高（95%），萌發(fā)時間最快（12 d），原球莖粗壯，呈綠色；A3 處理（1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L+香蕉泥5 g/L 培養(yǎng)基）種子萌發(fā)率較高（90%），萌發(fā)時間和萌發(fā)狀況與A2 處理近似；A4 和A5 處理（1/2 MS+6-BA 0.1 mg/L 和1/2 MS+NAA 0.1 mg/L 培養(yǎng)基）種子萌發(fā)率較低，分別為87%、85%，萌發(fā)時間較長（15～16 d），原球莖較細弱，淺綠色；A1 處理（1/2 MS 培養(yǎng)基）種子萌發(fā)率最低（80%），原球莖細弱，黃綠色。

表1 不同培養(yǎng)基配方對紫菀石斛種胚萌發(fā)及原球莖誘導的影響

2.2 不同激素濃度對紫菀石斛繼代增殖分化的影響

將種胚萌發(fā)分化的幼芽接種于添加不同激素濃度的培養(yǎng)基中，15 d 后幼苗開始分化出小芽，小芽不斷分蘗長出叢生芽。結(jié)果（表2）顯示，6種增殖分化培養(yǎng)基中，以B2 處理（MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥50 g/L+香蕉泥20 g/L+6-BA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基）增殖分化效果最好，增殖倍數(shù)最高，為10.2 倍，分化的小苗整齊均勻，在培養(yǎng)基上長出密集的小苗，葉片大、深綠色、生長粗壯；當6-BA 濃度為0.4 mg/L 時，增殖倍數(shù)呈下降趨勢，分化的小苗葉片細長，再分化能力變?nèi)?；B5 處理（MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥50 g/L+香蕉泥20 g/L+NAA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基）增殖分化效果好，增殖倍數(shù)最高（9.8 倍），當NAA 濃度為0.4 mg/L 時，小苗根系發(fā)達，但葉片細小，生長緩慢，增殖倍數(shù)下降。

表2 不同激素濃度對紫菀石斛繼代增殖分化的影響

2.3 不同添加物對紫菀石斛壯苗生根的影響

將繼代增殖培養(yǎng)長至3 cm 以上的幼苗接種于不同添加物濃度的培養(yǎng)基中進行壯苗生根培養(yǎng)的結(jié)果見表3 和圖2。從中可以看出，4 種生根培養(yǎng)基中，以C2 處理（3/4 MS+蔗糖20 g/L+瓊脂5.0 g/L+NAA 0.5 mg/L+馬鈴薯泥30 g/L+香蕉泥70 g/L 培養(yǎng)基）誘導生根效果最好，平均株高6.7 cm，平均根數(shù)5.5 條，平均根長5.2 cm，生根苗粗壯，葉片舒展，根系多而粗壯；其次為C1 添加香蕉泥100 g/L 培養(yǎng)基誘導生根較好，平均株高5.8 cm，平均根數(shù)5.3 條，平均根長4.9 cm，生根苗健壯，葉片深綠色；添加馬鈴薯泥100 g/L 的C3 培養(yǎng)基誘導生根較差，平均株高4.9 cm，平均根數(shù)3.4 條，平均根長3.1 cm，生根苗細弱，葉片短小，根系少而細弱。說明香蕉泥和馬鈴薯泥濃度合理組配對紫菀石斛生根有顯著的促進作用，且對幼苗的生長有一定促進作用。

表3 不同添加物對紫菀石斛壯苗生根的影響

2.4 不同煉苗天數(shù)對紫菀石斛移栽成活的影響

從表4 可以看出，瓶苗的污染率隨著煉苗天數(shù)的增加而增加，而成活率呈拋物線分布。D3 處理（煉苗20 d）為最好，污染率低（4%），成活率最高（95%），瓶苗生勢好，無黃葉，無黑色根；煉苗＜10 d，雖然污染率低，但成活率低于85%；煉苗30 d，污染率高達8%，成活率降至93%。

表4 不同煉苗天數(shù)對紫菀石斛移栽成活的影響

2.5 不同基質(zhì)對紫菀石斛移栽成活的影響

紫菀石斛生根瓶苗在自然光下煉苗20 d 后，葉色轉(zhuǎn)深綠色，葉片厚大、舒展，莖基部轉(zhuǎn)深綠色、粗壯，白色根增多、粗壯。從表5 可以看出，以E3 處理苗的長勢最好，苗床下層鋪厚度4 cm 樹皮屑（大小2～3 cm），上層鋪厚度4 cm 刨花，透氣、瀝水，保濕效果好，移栽成活率達96%，生長抽芽快；E4 處理表現(xiàn)也不錯，樹皮屑間隙大，難以操作，樹皮屑上鋪一層水苔，濕度控制不好，根基部易腐爛，生長抽芽慢；E1 處理腐熟消毒不徹底，透氣、瀝水性較差，移栽后刨花易長霉菌而板結(jié)，水肥吸收困難，成活率低（87%），但刨花成本低廉。

表5 不同基質(zhì)對紫菀石斛移栽成活的影響

3 結(jié)論

通過試驗研究，篩選出最適宜紫菀石斛種子萌發(fā)及原球莖誘導培養(yǎng)基為1/2 MS+蔗糖25 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥5 g/L，萌發(fā)率達95%；增殖分化培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥50 g/L+香蕉泥20 g/L+6-BA 0.2 mg/L，增殖倍數(shù)達10.2 倍；壯苗生根培養(yǎng)基為3/4 MS+蔗糖20 g/L+瓊脂5.0 g/L+馬鈴薯泥30 g/L+香蕉泥70 g/L+NAA 0.5 mg/L，生根率達100%，苗壯、株高、根系多而粗壯，生長好。

不同培養(yǎng)階段添加天然有機物對紫菀石斛種子的種胚萌發(fā)生長有促進作用。種子萌發(fā)時，原球莖在1/2 MS 基本母液中添加馬鈴薯泥5%的培養(yǎng)基中生長好，說明馬鈴薯對原球莖增殖分化有促進作用，該試驗結(jié)果與高燕等［6］的研究結(jié)果相符合。無菌播種獲得的原球莖如不及時轉(zhuǎn)接到增殖分化培養(yǎng)基中，會很快分化成小苗慢慢變黃，影響分化率。在顯微鏡下觀察，紫菀石斛種子的種胚比白芨種子種胚小，積累的營養(yǎng)成分要少，紫菀石斛種子萌發(fā)誘導原球莖再進行增殖分化，這與李守嶺等［7］報道相同。因此，在紫菀石斛組培快繁過程中，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的天然有機物對紫菀石斛種子萌發(fā)、出苗情況也不同，其中以馬鈴薯增殖分化效果最佳，馬鈴薯和香蕉合理組配對壯苗生根效果最佳，這與高燕等［8］報道相同。

不同的煉苗天數(shù)對幼苗移栽成活率影響較大，以煉苗20 d 最適宜，移栽后幼苗葉片厚大、深綠色有光澤，莖生長粗壯呈深綠色，成活率最高（95%）；煉苗＜10 d，葉片綠色，但葉片不夠厚實，移栽成活率較低；煉苗＞30 d，污染率增加，瓶內(nèi)養(yǎng)分降低，黃葉增多，移栽成活率下降。

移栽基質(zhì)以下層透氣、瀝水性好（樹皮屑）與上層腐熟消毒（刨花）的組合最好，下粗上細的保水、透氣性適于叢生芽的抽芽生長，保肥、保水性好，移栽成活率最高（96%）。樹皮屑和水苔雖然瀝水性好，但高溫高濕季節(jié)的濕度若控制不好，易引起根基部腐爛，移栽成活率下降。