合果芋-內(nèi)生菌共生體系修復(fù)低濃度鈾廢水的實(shí)驗(yàn)研究

何 柳,鄧欽文*,周天豪,王 帆,袁巧林

(1.南華大學(xué) 資源環(huán)境與安全工程學(xué)院,湖南 衡陽(yáng) 421001;2.南華大學(xué) 鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽(yáng) 421001;3.南華大學(xué) 衡陽(yáng)市土壤污染控制與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽(yáng) 421001)

0 引 言

鈾礦冶對(duì)我國(guó)的原子能事業(yè)的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)，但其產(chǎn)生的尾礦和含鈾廢水，同樣對(duì)周邊土壤和水環(huán)境造成不可忽視的影響。L.Xiang調(diào)研和評(píng)估了華東地區(qū)某鈾礦廠附近的農(nóng)田，發(fā)現(xiàn)在水稻中存在多種重金屬，且鈾含量較高，單因素指標(biāo)評(píng)估為中度污染，對(duì)人體有致癌等健康危害[1]。

高富集植物是研究的熱點(diǎn)。高富集植物[2-3]有較高的平均生物濃度因子和轉(zhuǎn)移系數(shù)，可用于植物穩(wěn)定化或植物富集提取。但鈾污染環(huán)境對(duì)植物存在毒害作用，嚴(yán)重破壞根的結(jié)構(gòu)，對(duì)植物細(xì)胞的新陳代謝、基因突變、基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)都有影響[4]。鈾的毒害作用會(huì)降低植物修復(fù)的效果，使植物修復(fù)法存在一定局限性。

目前，已有較多研究表明，植物-微生物聯(lián)合修復(fù)，效果要優(yōu)于單一的植物修復(fù)和微生物修復(fù)。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)和根瘤菌等微生物通過(guò)改善土壤環(huán)境、增強(qiáng)植物抗污染脅迫能力、促進(jìn)植物生長(zhǎng)等方式，顯著提高植物修復(fù)鈾污染的效果[5-7]。M.Kalin提出藻類(algae)和微生物構(gòu)建的修復(fù)系統(tǒng)三步修復(fù)法[8]。C.Zou等人研究發(fā)現(xiàn)Aspergillusniger(黑曲霉)能改變鈾的化學(xué)形態(tài)來(lái)降低毒性并限制其在植物體內(nèi)的遷移，從而提高植物在鈾污染環(huán)境中的生長(zhǎng)[9]。在含鈾廢水治理研究中，J.D.He構(gòu)建的合果芋-黑曲霉共生凈化體系亦能有效的去除水體中的鈾，能將0.5、1.0、3 mg/L的鈾降到0.05 mg/L以下[10]。C.Zou等人研究Aspergillusniger(黑曲霉)-合果芋共生體系的凈化機(jī)理，發(fā)現(xiàn)Aspergillusniger(黑曲霉)能改變鈾的化學(xué)形態(tài)來(lái)降低毒性并限制其在合果芋體內(nèi)的遷移，并且提高鈾在合果芋根部細(xì)胞壁的固定和亞細(xì)胞區(qū)域化，降低鈾的毒害作用，提高合果芋對(duì)鈾的富集作用[9]。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)，其抗鈾脅迫性和極端環(huán)境適應(yīng)性更強(qiáng)，適用性更廣，且成本較低，是一種非常安全有效的鈾污染修復(fù)方法，具有廣闊的研究和實(shí)用前景。

合果芋是一種常見(jiàn)的觀賞性植物，可以進(jìn)行土培和水培，環(huán)境適應(yīng)性很強(qiáng)，可用于多種污染物吸附，是一種理想富集植物。Q.W.Deng等人研究了Pseudomonassp.XNN8(銅綠假單胞菌XNN8)與合果芋構(gòu)建的共生凈化系統(tǒng)對(duì)含鈾廢水治理的研究，發(fā)現(xiàn)該共生體系對(duì)低濃度鈾廢水有較理想的治理效果[11]。本次研究以以上為基礎(chǔ)，使用合果芋作為實(shí)驗(yàn)植物，在Pseudomonassp.XNN8的基礎(chǔ)上，新增一種實(shí)驗(yàn)室前期分離出的放線菌XNG3作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)生菌，構(gòu)建不同的共生體系，探討不同內(nèi)生菌定殖合果芋的凈化效果，以及單一菌株、兩種菌株共同定殖合果芋的聯(lián)合共生體系的修復(fù)效果，選出最優(yōu)共生體系，為后期研究和鈾污染修復(fù)實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物選擇合果芋(SyngoniumpodophyllumSchott)，購(gòu)買于衡陽(yáng)市花鳥(niǎo)市場(chǎng)。

微生物選用已分離和保存的優(yōu)勢(shì)菌株：細(xì)菌Pseudomonassp.XNN8和放線菌XNG3[11]。實(shí)驗(yàn)室在某鈾尾礦壩附近水體的香蒲草(TyphaorientalisPresl)中，提取了數(shù)十種微生物，其中具有產(chǎn)鐵載體、ACC脫氨酶、IAA吲哚乙酸的且耐鈾性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌種是XNN8與XNG3，故選用此兩種作為構(gòu)建合果芋-內(nèi)生菌共生體系的菌株。

1.2 微生物提純與擴(kuò)培

使用固體培養(yǎng)基平板劃線法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存菌種進(jìn)行活化提純，使用液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌種擴(kuò)培。其中細(xì)菌XNN8使用牛肉高蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行提純擴(kuò)培，放線菌使用改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行提純擴(kuò)培。

微生物擴(kuò)培實(shí)驗(yàn)如圖1所示。

1.3 植物-內(nèi)生菌聯(lián)合體系的構(gòu)建

擴(kuò)培溶液經(jīng)離心、提取、稀釋后，得實(shí)驗(yàn)用菌液。使用注射、浸根兩種方式將細(xì)菌定殖于合果芋根部。由于放線菌菌體大，無(wú)法使用注射定殖，使用灌根和浸根兩種方式進(jìn)行定殖。實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃。本次實(shí)驗(yàn)在水培條件下，灌根需構(gòu)建特殊的土壤環(huán)境：合果芋上層根部使用土壤包裹固定，置于水面以上，使合果芋處于上層空氣、中層土壤、下層水溶液的環(huán)境中，結(jié)構(gòu)如圖2所示。

首先構(gòu)建四個(gè)實(shí)驗(yàn)組，A與B，C與D分別考察細(xì)菌XNN8和放線菌XNG3的最適定殖方式；使用最佳方式將兩菌種共同定殖于合果芋，構(gòu)建合果芋-雙菌種共生體系E實(shí)驗(yàn)組；使用未定殖的合果芋做空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 水培實(shí)驗(yàn)與鈾濃度測(cè)定

配制鈾濃度為1 mg/L，pH值為7.0的中性低濃度硝酸體系鈾酰溶液，對(duì)A、B、C、D共生體系實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行水培實(shí)驗(yàn)，考察不同定殖方式構(gòu)建的體系對(duì)修復(fù)鈾廢水的影響，各組設(shè)立三個(gè)平行樣，觀測(cè)其溶液鈾濃度變化，在5 d、10 d、15 d、20 d，25 d取樣，鈾濃度的測(cè)定方法采用ICP-MS測(cè)定。

配置鈾濃度為1 mg/L、0.5 mg/L、2 mg/L的pH值為7.0的中性低濃度硝酸體系鈾酰溶液，對(duì)新構(gòu)建的E實(shí)驗(yàn)組、F空白對(duì)照組進(jìn)行水培實(shí)驗(yàn)，研究合果芋-雙內(nèi)生菌共生體系修復(fù)低濃度鈾廢水的效果和可行性。

水培實(shí)驗(yàn)如圖3所示。

1.5 官能團(tuán)分析

使用紅外光譜(IR)分析植物富集鈾過(guò)程中參與反應(yīng)的官能團(tuán)，取植物的根部，進(jìn)行干燥破碎等預(yù)處理后，送至上海薈銘檢測(cè)設(shè)備有限公司測(cè)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌XNN8定殖體系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在細(xì)菌XNN8定殖體系中，浸根組在實(shí)驗(yàn)前期效果要優(yōu)于注射組，后期出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，第25天，XNN8注射定殖體系的鈾溶液濃度從初始1 mg/L降至12.115 μg/L，低于浸根定殖組15.367 μg/L。細(xì)菌XNN8定殖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖4所示。

細(xì)菌XNN8更適用注射法定殖。分析其原因，實(shí)驗(yàn)前期，浸根法讓細(xì)菌更多的定殖到根部各部位，而注射法僅在根部注射部位定殖了細(xì)菌，使得水培實(shí)驗(yàn)前期浸根法效果優(yōu)于注射法，而隨著時(shí)間推移，注射定殖的細(xì)菌逐漸定殖到植物各部位，聯(lián)合體系修復(fù)效果迅速提升，最終超越浸根法，基于鈾污染修復(fù)的長(zhǎng)效性，注射法定殖細(xì)菌XNN8更適用。

2.2 放線菌XNG3定殖體系

在放線菌XNG3定殖體系中，浸根組在實(shí)驗(yàn)前期效果要優(yōu)于灌根組，后期出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，XNG3灌根定殖體系的鈾溶液濃度從初始1 mg/L降至13.940 μg/L，低于浸根定殖組17.422 μg/L。放線菌XNG3定殖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖5所示。

放線菌XNG3更適用灌根法定殖。分析其機(jī)理與細(xì)菌XNN8的定殖類似，灌根法相比浸根法需要更多時(shí)間進(jìn)行放線菌定殖，但最終效果優(yōu)于浸根法，故灌根法更適用放線菌XNG3。放線菌XNG3的測(cè)序鑒定尚待研究。

2.3 雙菌種聯(lián)合定殖體系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用XNN8注射與XNG3灌根聯(lián)合定殖合果芋，構(gòu)建共生體系，與未定殖的空白對(duì)照組進(jìn)行水培實(shí)驗(yàn)對(duì)比。初始鈾濃度1 mg/L的水培實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，共生體系的鈾污染修復(fù)效果始終優(yōu)于未定殖的合果芋。

初始鈾濃度0.5 mg/L和2 mg/L的水培實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7和圖8所示，鈾濃度變化趨勢(shì)和兩體系優(yōu)勢(shì)差異與1 mg/L的水培實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。

初始濃度1 mg/L、0.5 mg/L、2 mg/L鈾溶液水培實(shí)驗(yàn)第25天鈾濃度和鈾富集率如表2所示。不同初始濃度水培實(shí)驗(yàn)中，雙菌種定殖共生體系修復(fù)鈾廢水的效果都明顯優(yōu)于未定殖內(nèi)生菌的空白對(duì)照組，最高富集率98.34%，且共生體系中鈾濃度均降致0.05 mg/L以下，可用于低濃度鈾污染廢水的治理。未定殖內(nèi)生菌的合果芋，在初始濃度2 mg/L鈾溶液中鈾濃度降至61.851 μg/L，未達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)，修復(fù)效果不佳。

表2 第25天鈾濃度和鈾富集率

對(duì)比單菌種定殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1 mg/L條件下，細(xì)菌XNN8定殖體系和放線菌XNG3定殖體系修復(fù)鈾廢水濃度分別降至12.115 μg/L、13.940 μg/L，效果略優(yōu)于雙菌種定殖體系的17.903 μg/L，但雙菌種定殖合果芋共生體系也達(dá)到了修復(fù)效果。兩菌種的協(xié)同機(jī)理以及可能的拮抗作用將是今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。

2.4 IR分析結(jié)果

取定殖雙菌種的合果芋和未定殖的合果芋根部樣品，經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行IR紅外光譜表征。植物組成有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等，含有多糖、酚類、醇類、酯類、羥基、羧基、氨基等多種成分[12]，以此分析紅外光譜中的信息，紅外光譜如圖9所示。

定殖了內(nèi)生菌的合果芋，原3 381.62吸收峰遷移到3 419.23，這是糖類C—OH的—OH伸縮，—OH對(duì)U有絡(luò)合作用[13-18]，說(shuō)明內(nèi)生菌的定殖可能使得聯(lián)合體系比未定殖的合果芋產(chǎn)生更多的糖類和 —OH，或者促進(jìn)植物中—OH對(duì)U的結(jié)合作用。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)研究了合果芋與細(xì)菌XNN8、放線菌XNG3構(gòu)建的共生體系對(duì)低濃度鈾污染廢水修復(fù)效果，探究了微生物的最適定殖方式，以及不同初始鈾濃度、是否定殖內(nèi)生菌對(duì)修復(fù)效果的影響，使用紅外光譜(IR)分析植物富集鈾過(guò)程中參與反應(yīng)的官能團(tuán)，為低濃度鈾污染廢水提供一種可行的修復(fù)方法。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析，本次實(shí)驗(yàn)研究總結(jié)如下：

1)細(xì)菌XNN8更適用注射法定殖合果芋。

2)放線菌XNG3更適用灌根法定殖合果芋。

3)定殖了內(nèi)生菌的合果芋修復(fù)鈾污染廢水效果優(yōu)于未定殖的合果芋。

4)鈾初始濃度0.5 mg/L條件下，合果芋-內(nèi)生菌共生體系最高鈾富集率98.34%，鈾濃度降至16.615 μg/L；1 mg/L、2 mg/L條件下廢水鈾濃度分別降至17.903 μg/L、26.067 μg/L，均達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)，可用于修復(fù)低濃度鈾污染廢水。

5)內(nèi)生菌可能提高了合果芋根部的—OH含量或強(qiáng)化了官能團(tuán)的結(jié)合作用。