積雪草酸葡糖胺鹽凝膠通過調(diào)節(jié)巨噬細胞遷移和極化促進創(chuàng)面愈合及表皮再生

劉冰瀅 王文波 黃佳 高振 武曉莉 劉偉

創(chuàng)面愈合是皮膚組織損傷后的正常過程，涉及炎癥、細胞增殖、基質(zhì)產(chǎn)生、組織重塑和再生等階段[1]。每個階段的順利進行對于確保創(chuàng)面的正常愈合，以及皮膚修復和功能恢復至關重要[2-3]。

炎癥階段在正常的創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮了重要作用，因為炎癥將巨噬細胞和其他炎癥細胞募集到創(chuàng)面處，以清除細胞碎片并產(chǎn)生細胞因子和生長因子[4-5]，進而促進基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積，促進新生組織填補創(chuàng)面缺損[6]。病理情況下，缺乏適當?shù)难装Y細胞，如糖尿病患者的創(chuàng)面，將導致創(chuàng)面難以愈合。

巨噬細胞可分為Ⅰ型(M1)和Ⅱ型(M2)，前者對于創(chuàng)面清創(chuàng)和生長因子、基質(zhì)的產(chǎn)生起了重要作用，后者則促進組織重塑和再生[7-8]。因此，M2表型極化對促進創(chuàng)面愈合和再生具有重要作用[9]。

積雪草酸是一種植物提取物，具有多種功能，例如抗氧化[10]、抗微生物[11]、抗凋亡[12]、抗癌活性[13]等。其在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮雙重功能，即抑制病理性瘢痕中細胞增殖和膠原蛋白的生成，同時還可促進正常的創(chuàng)面愈合和膠原蛋白生成[14-16]。但是，傳統(tǒng)積雪草酸具有較低的生物利用度，水溶性差。因此，本研究采用水溶性的積雪草酸葡萄糖胺鹽(AAGS)作為新的藥物形式[17]，并探索其對促進大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

胎牛血清 FBS(ScienCell，美國)，RPMI1640培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(Hyclone，美國)，青霉素、鏈霉素、兩性霉素B(Gibco，美國)，二甲亞砜(上海滬試化工有限公司)，凝膠敷料(清得佳)(Smith & Nephew，美國)，AMV 逆轉錄試劑盒(Promega，美國)，CD86抗體(ab53004，Abcam，美國)，CD163抗體(GB11340-1，Servicebio，美國)，二抗(GB23303，Servicebio，美國)。

酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo，美國)，PCR儀(Biometra，德國)。

1.2 實驗動物

共14只5周齡雄性SD大鼠，平均體質(zhì)量150 g(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院SPF實驗室)，并在安靜、通風、恒溫的環(huán)境下飼養(yǎng)，相對濕度(50%±10%)，12 h光暗交替。獨籠飼養(yǎng)，自由進水，喂食大鼠專用飼料，定時更換墊料。本研究經(jīng)第九人民醫(yī)院倫理委員會審核、批準。

1.3 建立大鼠背部皮膚創(chuàng)面模型及實驗分組

大鼠麻醉后，背部備皮消毒后，用活檢打孔器(直徑0.8 cm)在大鼠背部兩側制作兩個全層皮膚切除創(chuàng)面(每側脊柱旁1 cm)，采用硅膠圈固定以防創(chuàng)面張開。一側設為實驗組(Exp)，一側設為對照組(Ctrl)。實驗組每天外用AAGS凝膠(30 mg/mL溶于PBS)；對照組每天外用凝膠敷料(清得佳)。分別在第0、3、7、10和14天對創(chuàng)面行大體觀察并拍照，并分別在第3天(n=4)、第7天(n=4)和第14天(n=6)取材。

1.4 小鼠巨噬細胞(RAW 264.7)的復蘇與培養(yǎng)

將裝有RAW264.7細胞的凍存管從液氮中取出，快速復蘇。離心后加入RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至2×106個/孔，種入6孔板中，37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每24小時換液，分別加入0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL AAGS培養(yǎng)48 h。

1.5 檢測指標

1.5.1大鼠創(chuàng)面面積的測定

第0、3、7、10和14天拍攝的創(chuàng)面大體照片使用Image-ProPlus(6.0版，Media Cybernetics，Silver Spring，美國)進行創(chuàng)面面積的測量。

1.5.2表皮厚度和表皮嵴數(shù)的測定

第3、7和14天取材的創(chuàng)面組織，4%多聚甲醛4 ℃固定過夜、石蠟包埋、切片(5 μm)，HE染色，測定表皮厚度和表皮嵴數(shù)量。取第14天的組織切片(每組各6張)，選擇表皮下方中間區(qū)域(40×)，分別從圖像的左側、中部和右側三處測量表皮厚度。此外，將每張圖片(40×)的表皮區(qū)域均勻劃分為5個區(qū)域，6張組織切片共30個區(qū)域，每個區(qū)域有表皮嵴則計數(shù)為1，沒有表皮嵴則計數(shù)為0，30個區(qū)域相加得出各組的表皮嵴總數(shù)。

1.5.3炎癥細胞的半定量分析

取第3天HE染色切片，于每張切片的表皮下方中間及兩側位置分別選擇一張放大的圖片(400×)，每張圖片手工計數(shù)藍色深染的炎性細胞(單個核，圓形細胞)，綜合3張圖片獲得炎性細胞數(shù)的平均值。同樣方法得到第7天(n=4)和第14天(n=6)各組的炎癥細胞數(shù)平均值。

1.5.4免疫組織化學分析

取第14天組織切片(n=6)，采用CD86(1∶200)和CD163(1∶200)抗體4 ℃孵育過夜，PBS洗滌2次，二抗(1∶300)室溫孵育30 min，最后用3,30-二氨基聯(lián)苯胺顯色劑染色輔以少量蘇木精襯染，并采用積分光密度(IOD)/面積值來測定蛋白質(zhì)的表達量。

1.5.5定量RT-PCR 檢測小鼠巨噬細胞M1和M2型的表達

將不同濃度AAGS培養(yǎng)的RAW264.7細胞懸液接種到6孔板上，培養(yǎng)48 h后提取細胞RNA，紫外分光光度計核算純度，A260/A280比值為1.8～2.0。每個標本以1.5 μg總RNA為模板，按AMV逆轉錄試劑盒配制20 μL反應體系：5×Buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，200 ng/μL Oligo dT-Adaptor Primer 1 μL，40 U/μL RNase抑制劑0.5 μL，5 U/μL AMV逆轉錄酶0.5 μL，反應體系加水配平至20 μL。反應條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。

cDNA在qPCR儀中擴增，反應體系：ddH2O 7 μL，MIX 10 μL，cDNA 1 μL，前引物1 μL，后引物1 μL。反應條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s、72 ℃ 10 min為一個循環(huán)，共40個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參照(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer Sequence

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 AAGS對大鼠創(chuàng)面愈合的影響

第0、3、7、10和14天大體觀可見實驗組創(chuàng)面愈合相對較快，定量分析顯示在第10天實驗組創(chuàng)面面積明顯小于對照組(P<0.05)(圖1A、B)。

組織學觀察可見，第3天兩組創(chuàng)面均見明顯的組織缺損；第7天實驗組創(chuàng)面新生肉芽組織明顯多于對照組，上皮化過程明顯加快；第14天兩組創(chuàng)面完全被新生組織填充，并完全上皮化，實驗組創(chuàng)面可見表皮嵴結構，但對照組罕見(圖1C)。

2.2 AAGS對于大鼠創(chuàng)面表皮重塑和再生的影響

組織學觀察：對照組表皮較厚且缺少表皮脊結構，而實驗組表皮較薄，可見明顯表皮脊結構。定量分析：對照組創(chuàng)面表皮厚度為(76.43±21.63)μm，明顯大于實驗組(57.92±14.96)μm，差異顯著(P<0.05)。半定量分析：實驗組30個區(qū)域中有27區(qū)域出現(xiàn)表皮脊結構，而對照組僅有8個區(qū)域出現(xiàn)表皮脊結構，差異顯著(P<0.05)(圖2)。

A：大體觀；B：創(chuàng)面面積(*： P<0.05)；C：組織學觀察(比例尺=500 μm) A: Gross observation; B: Wound area (*: P<0.05); C: Histological observation (scale=500 μm)圖1 各時間點兩組創(chuàng)面大體觀及組織學觀察Fig. 1 Gross and histological observation of the two groups at each time point

A：組織學觀察(比例尺=200 μm)；B：表皮厚度(**： P<0.01)；C：表皮嵴數(shù)(***： P<0.001) A: Histological observation (scale=200 μm); B: Epidermal thickness (**: P<0.01); C: Number of epidermal ridge (***: P<0.001)圖2 兩組表皮厚度和表皮嵴數(shù)的測定Fig. 2 Measurement of epidermal thickness and epidermal ridge number of the two groups

2.3 AAGS對創(chuàng)面炎性細胞的影響

組織學觀察可見，在第3天和第7天，實驗組創(chuàng)面可觀察到更多的炎性細胞(單個核、原型細胞)，但在第14天，兩組炎性細胞數(shù)量相似。半定量分析顯示，實驗組、對照組在第3天的炎癥細胞數(shù)分別為(171.33±14.81)和(118.83±14.25)(P<0.05)，第7天分別為(83.42±13.78)和(57.69±13.42)(P<0.05)，第14天分別為(60.08±15.48)和(53.25±9.35)(P>0.05)(圖3)。

A、B、C：組織學觀察(比例尺=50 μm)；D：炎性細胞數(shù)量(*： P<0.05) A, B, C: Histological observation (scale=50 μm); D: Number of inflammatory cells (*: P<0.05)圖3 各時間點兩組炎癥細胞的半定量分析Fig. 3 Semi-quantitative analysis of inflammatory cells of the two groups at various time points

2.4 AAGS在體內(nèi)對巨噬細胞極化方向的影響

免疫組織化學染色顯示，實驗組創(chuàng)面中的M1細胞(CD68陽性細胞)比對照組略多，而實驗組創(chuàng)面中的M2細胞明顯多于對照組。半定量分析顯示，實驗組創(chuàng)面中的M1和M2細胞數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)(圖4)。

A、B：組織學觀察(比例尺=50 μm)；C：CD86 IOD值(*： P<0.05)；D：CD163 IOD值(***： P<0.001) A, B: Histological observation (scale=50 μm); C: CD86 IOD value (*: P<0.05); D: CD163 IOD value (***: P<0.001)圖4 兩組免疫組織化學分析結果Fig. 4 Immunohistochemical analysis of the two groups

2.5 AAGS在體外對巨噬細胞極化方向的影響

小鼠巨噬細胞體外實驗結果顯示，在高劑量藥物處理后，M1標記物IL-1、IL-6和INOS的基因表達相對增強。但是，M2標記基因(CD206和KLF4)的表達呈現(xiàn)出劑量依賴性誘導效應(P<0.05)，驗證了AAGS可以誘導M2極化(圖5)。

A：M1型分化相關mRNA的表達；B：M2型分化相關mRNA的表達 A: M1-type differentiation-related mRNA expression; B: M2-type differentiation-related mRNA expression 圖5 AAGS對小鼠巨噬細胞相關mRNA表達的影響(*： P<0.05；**： P<0.01；***： P<0.001)Fig. 5 Effect of AAGS on mouse macrophage-related mRNA expression (*: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001)

3 討論

創(chuàng)面愈合是治愈皮膚損傷的正常過程，由內(nèi)源性因素完成該過程，如巨噬細胞[17]、生長因子[18]和細胞因子[19-20]等。特別是當創(chuàng)面內(nèi)伴隨大塊組織缺損時，快速肉芽組織形成和隨后的上皮形成是創(chuàng)面愈合的關鍵步驟[21-22]。

新生毛細血管的生成和炎癥細胞分泌的生長因子是誘導創(chuàng)面愈合過程的關鍵因素，依賴已形成的血塊內(nèi)的血小板和創(chuàng)面炎癥細胞釋放生物活性因子，以促進創(chuàng)面愈合[23]。然而，在難愈性、慢性創(chuàng)面(如糖尿病或老年人)愈合中，經(jīng)?？捎^察到這些創(chuàng)面缺乏適當?shù)难装Y過程和血管生成[24-25]，此時需要藥物和其他手段的干預[26]。

積雪草酸是一種植物提取物，可通過促進成纖維細胞的增殖和膠原蛋白在體外[27]或體內(nèi)的生成[28-30]來促進創(chuàng)面愈合。傳統(tǒng)的積雪草酸具有較低的水溶性， AAGS(積雪草酸葡糖胺鹽)則具有較高的水溶性[17]。更重要的是，AAGS在PBS中經(jīng)過超聲震蕩處理后，以高于30 mg/mL的濃度自發(fā)形成水凝膠，成為創(chuàng)面局部治療的理想形式[17]。

大體和組織學觀察顯示，AAGS處理后創(chuàng)面總體愈合加快。其可能的機制是藥物誘導了早期的炎癥反應，以增加炎癥因子和生長因子的分泌[31]。半定量分析發(fā)現(xiàn)，實驗組早期(第3天和第7天)的炎癥細胞數(shù)量明顯多于對照組。

此外，AAGS可加速愈合組織的重塑和再生。本研究結果顯示，實驗組創(chuàng)面上皮成熟更快(第7天)，且較對照組表皮更薄，差異顯著(P<0.05)。表皮增厚被認為是一種病理性改變，通常可于異常瘢痕(如瘢痕疙瘩)中觀察到[32]。AAGS處理可使得愈合創(chuàng)面表皮變薄，表明AAGS可重塑表皮結構。更為重要的是，經(jīng)AAGS處理的創(chuàng)面中出現(xiàn)了表皮脊結構(皮膚發(fā)育過程中成熟表皮的特征[33])，而對照組罕見(該現(xiàn)象通常在異常瘢痕形成中缺乏[34])，兩組存在顯著差異(P<0.05)。這一結果表明，AAGS可能有助于再生表皮結構，從而更好地恢復表皮功能。

巨噬細胞一項很重要的功能是誘導炎癥和組織再生，前者由M1型巨噬細胞執(zhí)行，而后者由M2型巨噬細胞執(zhí)行[35]。本研究結果顯示，第14天的創(chuàng)面組織中，實驗組的M2細胞明顯多于對照組。相比之下，實驗組創(chuàng)面中僅發(fā)現(xiàn)了少量的M1細胞增加。這些結果提示，AAGS可能在創(chuàng)面早期誘導M1巨噬細胞形成，通過促進炎癥因子和生長因子的分泌而促進成纖維細胞活化、增殖和基質(zhì)分泌，從而形成新生肉芽組織填充創(chuàng)面，然后巨噬細胞轉換為主要的M2表型，從而促進皮膚再生。這一假設也得到體外細胞學實驗結果的支持。

AAGS由于采用了積雪草酸與氨基葡萄糖之間的化學鍵合，大大提高了生物利用度，提高了水溶性，達到一定濃度(>30 mg/mL)后可制成水凝膠，便于臨床局部治療的使用。本研究為積雪草酸葡糖胺鹽的臨床應用提供了良好的實驗研究基礎。