依折麥布聯合羅格列酮對平滑肌源性泡沫細胞小凹蛋白-1 mRNA表達的影響

膽固醇在血管平滑肌細胞的大量蓄積及其引發(fā)的炎癥、凋亡、細胞因子的釋放等是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)產生的重要機制，因此，抑制或減少膽固醇的蓄積可以減少AS的發(fā)生。研究表明，小凹是膽固醇流出的主要通道，平滑肌細胞中膽固醇的流出可減緩平滑肌細胞向泡沫細胞的轉化，從而減慢粥樣斑塊的形成。小凹蛋白為小凹的主要骨架結構，是小凹發(fā)揮作用的靶點，在膽固醇代謝方面發(fā)揮主要作用[1-2]。動物實驗和臨床試驗均已發(fā)現羅格列酮具有明顯的抗炎、抗AS作用[3-4]。依折麥布是一種新型降脂藥物，其機制是選擇性抑制腸膽固醇吸收，從而起到抗AS的作用[5]。但羅格列酮及依折麥布是否通過上調小凹蛋白-1(Caveolin-1)在平滑肌源性泡沫細胞表達促進膽固醇的外流，逆轉動脈粥樣硬化的機制尚不明確。本研究探討羅格列酮、依折麥布及兩者聯合對氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的平滑肌源性泡沫細胞Caveolin-1 mRNA表達的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 原代大鼠胸主動脈平滑肌細胞(VSMCs，齊氏細胞有限公司)，胎牛血清(上海Beyotime生物技術有限公司)，MEM/F12培養(yǎng)液、油紅O染液(武漢博士德生物公司)，ox-LDL(北京協(xié)生生物科技有限公司)，RNA提取試劑盒、RNA逆轉錄試劑盒(Takala公司)，PCR引物及熒光定量PCR試劑盒(上海博士德生物公司)，胰蛋白酶(武漢Boster公司)，依折麥布(默沙東制藥公司饋贈)，瑞舒伐他汀(京新藥業(yè)公司)，37 ℃細胞培養(yǎng)箱型號3141(美國 Thermo Fisher公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，Real-timePCR儀型號Quant Studio7(美國 Applied Biosytems公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 原代大鼠胸主動脈VSMCs中加入含15%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基， 3～5 d傳1代，取VSMCs進行實驗研究。

1.2.2 泡沫細胞模型的建立與鑒定 在平滑肌細胞中加入50 μg/mL的ox-LDL干預48 h后，采用油紅O染色法鑒定。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗細胞3次去除死細胞后，用4%多聚甲醛固定30 min，再用油紅O染液染色后，于顯微鏡下觀察細胞泡沫化的情況。

1.2.3 實驗分組 實驗分為空白對照組不進行干預，僅單獨培養(yǎng)平滑肌細胞48 h；泡沫細胞組用ox-LDL 50 μg/mL誘導平滑肌細胞，單獨培養(yǎng)48 h；依折麥布組先用ox-LDL 50 μg/mL干預平滑肌細胞48 h，建立泡沫細胞模型，后加入依折麥布3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L繼續(xù)培養(yǎng)24 h；羅格列酮組先用ox-LDL 50 μg/mL干預平滑肌細胞48 h，建立泡沫細胞模型，后加入25 μmol/L羅格列酮繼續(xù)培養(yǎng)24 h；聯合組先用ox-LDL 50 μg/mL干預平滑肌細胞48 h，建立泡沫細胞模型，后加入依折麥布30 μmol/L和羅格列酮25 μmol/L繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每組分析3份樣本量。

1.2.4 用RT-PCR檢測各組中的Cavedin-1 mRNA表達水平

1.2.4.1 RNA的提取 細胞用PBS沖洗兩遍，加入1 mL Trizol，經沉淀、洗滌后，溶解于DEPC水20 μL中，利用分光光度儀Nano Drop測定樣品RNA濃度及OD值。

1.2.4.2 逆轉錄為cDNA 采用SYBR預混的實時熒光定量PCR試劑盒，在Ep管中加入逆轉錄反應體系2 μL 、Total RNA 1 μg及RNase Free dH2O使總體系為10 μL，將PCR儀反應所得的cDNA置于-20 ℃下保存。

1.2.4.3 PCR擴增反應 Caveolin-1上游引物：5′-GAGCGAGAAGCAAGTGTACGA-3′，下游引物：5′-ACAGACGGTGTGGAACGTAGAT-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃預變性5 s，60 ℃退火20 s，共40個循環(huán)，各組PCR設3個副孔，以GAPDH為內參，mRNA表達相對量用2-△△CT表示。

2 結 果

2.1 VSMCs形態(tài)學觀察 細胞生長旺盛，有突起、細長，局部區(qū)域重疊多層，呈“峰-谷”樣。

2.2 依折麥布單藥對Caveolin-1 mRNA表達的影響 與空白對照組比較，泡沫細胞組及依折麥布組Caveolin-1 mRNA表達量均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與泡沫細胞組比較，不同濃度依折麥布組Caveolin-1 mRNA表達量顯著增加，且呈一定濃度依賴性(P<0.05)。詳見表1。

表1 不同濃度依折麥布對Caveolin-1 mRNA表達的影響(±s)

與空白對照組比較，①P<0.05；與泡沫細胞組比較， ②P<0.05；與依折麥布3 μmol/L組比較， ③P<0.05；與依折麥布10 μmol/L組比較， ④P<0.05。

2.3 依折麥布聯合羅格列酮對Caveolin-1 mRNA表達的影響 與空白對照組比較，泡沫細胞組Caveolin-1 mRNA表達量下降(P<0.05)；與泡沫細胞組比較，依折麥布30 μmol/L組、羅格列酮組及聯合組Caveolin-1 mRNA表達增加量，且聯合組與依折麥布30 μmol/L組和羅格列酮組比較，Caveolin-1 mRNA表達增加更為明顯。詳見表2。

表2 依折麥布聯合羅格列酮對Caveolin-1 mRNA表達的影響(±s)

與空白對照組比較，①P<0.05；與泡沫細胞組比較， ②P<0.05；與依折麥布30 μmol/L組比較， ③P<0.05；與羅格列酮組比較， ④P<0.05。

3 討 論

膽固醇的流出是指膽固醇從特定的通道由細胞內轉運到細胞外進行代謝，膽固醇的逆轉運可減少泡沫細胞的形成，從而減少脂質斑塊的形成[6-7]。因此，減少細胞內蓄積的膽固醇對臨床疾病治療意義重大。大量研究顯示，Caveolin-1在膽固醇的流出中發(fā)揮轉運中心的關鍵作用。小凹是細胞外膽固醇流出主要通道，Caveolin-1是小凹的主要組成蛋白，對調節(jié)細胞信號傳導、維持細胞內外的膽固醇平衡有重要的作用[1，8]。

羅格列酮是一種噻唑烷二酮類抗糖尿病藥，通過提高胰島素的敏感性而有效地控制血糖，其藥理作用是通過過氧化物酶體增殖激活受體-γ(PPAR-γ)實現的[9-11]。PPAR-γ作為核受體超家族的一員，是一種脂質激活轉錄因子，PPAR-γ可誘導血管內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞中的Caveolin-1表達，以減緩動脈粥樣硬化的進程[12]。本實驗結果顯示，羅格列酮可提高脂化后細胞內小凹蛋白的表達，說明對于動脈粥樣硬化病人，羅格列酮本身具有延緩粥樣斑塊形成的作用。

臨床研究表明，在他汀類藥物治療基礎上進一步服用依折麥布可降低血脂水平[13-14]。依折麥布為一種選擇性的膽固醇吸收抑制劑，可抑制小腸細胞刷狀緣的尼曼-匹克蛋白活性，從而降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，其分子量小，能反復進行肝腸循環(huán)，主要抑制外源性的膽固醇以發(fā)揮降血脂的作用。研究發(fā)現，依折麥布通過激活平滑肌細胞表面的脂質激活轉錄因子，如LXRα、膽固醇調節(jié)元件結合蛋白1(SREBP-1)，上調Caveolin-1的表達，促進膽固醇流出，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[8]。本實驗證明應用依折麥布干預脂化后的細胞可增加小凹蛋白的產生。

目前在臨床上，依折麥布僅用于降低血清膽固醇，雖然副作用較他汀類藥少，但仍不是降血脂的首選藥物，也并沒有作為抗動脈粥樣硬化的常規(guī)用藥；而羅格列酮也只應用于控制血糖。依折麥布及羅格列酮均可使細胞內的膽固醇逆轉運至細胞外，起到抗動脈粥樣硬化的作用，且兩種藥物聯合使用，增強了這種效用。這種作用關鍵點在于提高了細胞內小凹蛋白的表達，也并不排除兩種藥物作用于其他新的信號轉導通路。這兩種藥物及聯合使用后的作用還處于體外實驗階段，在臨床上應用能否達到明顯的抗動脈粥樣硬化結果仍需進一步研究。