氯霉素類檢測前處理方法和殘留現(xiàn)狀探討
——以湖南某市畜禽肉為例

李洪權(quán)，周 熙，宋忠祥，付浩華，陳珉珉，唐小鵬*

(1.株洲市食品藥品檢驗所，湖南株洲 412000;2.湖南唐人神肉制品有限公司，湖南株洲 412002)

由于畜禽易發(fā)生群體細(xì)菌性疾病[1]，因此，為降低發(fā)病率，氯霉素類藥物被不合理使用的頻率也相應(yīng)增加[2-3]。但是由于氯霉素可引發(fā)再生障礙性貧血[4]；氟苯尼考則本身作為獸藥，不用于對人疾病的治療。我國農(nóng)業(yè)部193/235號公告因此而把氯霉素列為畜禽禁用藥物，并限定氟苯尼考最高殘留量[5-6]。目前畜禽肉中氯霉素類殘留檢測方法已報道多種[7]，但被納入國標(biāo)(GB)作為法定方法的僅有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[8-9]，而后者常作為檢測者的首選方式。本實驗組在長期使用后者方法的同時參考多篇文獻(xiàn)[10-15]，整理發(fā)現(xiàn)，這些方法的前處理步驟可歸納為乙腈/堿化乙酸乙酯提取，正己烷去油脂，濃縮液固相萃取小柱凈化三步法。但又有所爭議，主要包含兩點：提取溶劑的選擇，乙腈和堿化乙酸乙酯哪種更好，是否需要經(jīng)過固相萃取柱凈化處理。畜禽群體細(xì)菌性疾病的發(fā)病還有地域[16]、季節(jié)[17-18]等差異，養(yǎng)殖戶也可能存在針對性用藥。這些畜禽肉中氯霉素類藥物殘留是否相對應(yīng)的也存在規(guī)律，值得探討。因此，實驗組擬開展兩大爭議點比較研究，并對不同月份、種類以及區(qū)域的樣品進(jìn)行測定和殘留規(guī)律分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 離心機(jī)(ST16R，賽默飛世爾科技有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000B，上海亞榮生化儀器廠)，電子天平(XSE 205DV，梅特勒托利多儀器有限公司)，三重四級桿質(zhì)譜(QTRAP 4500，上海愛博才思分析儀器有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品和試劑 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%，批號130555-201203)、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%，批號C13665000)、氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%，批號50804AC)均從Dr.Ehrenstorfer公司采購。乙腈、甲醇和正己烷(色譜純，霍尼韋爾有限公司)。

1.3 樣品 畜禽肉均從養(yǎng)殖基地、農(nóng)貿(mào)市場以及大型連鎖超市采集并置于-18 ℃冰箱冷凍儲存，涉及的畜禽種類包括豬、牛、雞、鴨(表1)。

表1 畜禽肉樣品信息Tab 1 The information of livestock and poultry samples

2 方法與結(jié)果[8-9]

2.1 LC-MS/MS方法建立 色譜：Welch Xtimate C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)，流動相：水-乙腈(45∶55)，流速：0.5 mL/min。柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜：電噴霧電離源(ESI)，負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)，離子源溫度：550 ℃，電噴霧電壓：-4500 V，氣簾氣：35.0 psi，離子源氣1：55 psi，離子源氣2：55 psi，碰撞氣：氬氣。其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 氯霉素類化合物質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)Tab 2 The optimized mass parameters of chloramphenicols

2.2 樣品制備方法比較

2.2.1 制備方法一 提?。悍Q取試樣2.5 g(精密稱定)，置于50 mL離心管中，加入2.0 ng氯霉素-D5和5 mL堿化乙酸乙酯，勻漿1 min，渦旋5 min，超聲30 min，離心(7000 r/min)5 min。提取2次，合并上清液至另一50 mL離心管，氮氣吹干，3 mL丙酮-正己烷溶解殘渣。凈化：用3 mL丙酮-正己烷淋洗LC-Si硅膠小柱，棄去淋洗液，將上述殘渣溶解溶液轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱上，棄去流出液，用5 mL丙酮-正己烷洗脫，收集洗脫液于心形瓶中，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮氣吹干，用1 mL水定容，加入1 mL乙腈飽和正己烷，渦旋1 min，離心(7000 r/min)5 min。吸取水層液過0.22 μm濾膜至進(jìn)樣瓶，待測定。

2.2.2 制備方法二 提?。悍Q取試樣2.5 g(精密稱定)，置于50 mL離心管中，加入2.0 ng氯霉素-D5和5 mL乙腈，勻漿1 min，渦旋5 min，超聲30 min，離心(7000 r/min)5 min。提取2次，合并上清液至另一50 mL離心管，加入10 mL乙腈飽和正己烷，渦旋5 min，離心5 min，棄去上層液，下層液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，氮氣吹干，3 mL丙酮-正己烷溶解殘渣。凈化：同2.2.1項中凈化步驟。

2.2.3 制備方法三 省去2.2.2項中固相萃取柱凈化步驟，改為“氮氣吹干，用1 mL水定容，加入1 mL乙腈飽和正己烷，渦旋1 min，離心(7000 r/min)5 min。吸取水層液過0.22 μm濾膜至進(jìn)樣瓶，待測定”。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精密稱取一定質(zhì)量氯霉素和氟苯尼考，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含氯霉素13 μg和氟苯尼考20 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。并逐級稀釋成含氯霉素-D51.0 ng的濃度分別為0.13，0.65，1.30，6.50，13.00，26.00 ng/mL氯霉素和濃度分別為0.20，1.00，2.00，10.00，20.00，40.00 ng/mL氟苯尼考混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：將各個濃度的溶液進(jìn)樣5 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。以氯霉素和氯霉素D5質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)，質(zhì)量峰面積比值為縱坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線，得氯霉素方程為Y=2.77177X+5.11×e-3，R=0.99956，線性范圍為0.13～26.00 ng/mL；同法得氟苯尼考方程為Y=1.27634X+8.4405×e-4，R=0.99968，線性范圍為0.20～40.00 ng/mL。

2.4 方法學(xué)驗證[19]

2.4.1 精密度試驗 取同一對照品溶液，按2.1項色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，重復(fù)5次測定氯霉素和氟苯尼考峰面積，兩者峰面積RSD(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)分別為0.21%、0.27%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取對照品溶液及供試品溶液，于室溫分別放置0，2，4，8，10，16，20，24 h，按2.1項色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行氯霉素和氟苯尼考峰面積測定，對照品中兩者峰面積RSD分別為0.77%、0.90%，供試品兩者峰面積RSD分別為0.66%、0.96%，均小于2%，表明對照品及供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批畜禽肉樣品6份，按2.2項中比較后最佳前處理方法處理并按2.1項方法進(jìn)行氯霉素和氟苯尼考峰面積測定，并分別計算RSD。重復(fù)性試驗：氯霉素和氟苯尼考峰面積RSD分別為1.12%、1.03%，表明本實驗方法重復(fù)性良好。

2.4.4 加標(biāo)回收 分別精密稱取同一批次的畜禽肉末，精密稱取2.5 g，稱取6份，每份精密加入氯霉素和氟苯尼考混標(biāo)溶液(氯霉素：0.13 mg/mL，氟苯尼考：0.20 mg/mL)。按2.2項中比較后最佳前處理方法處理并按2.1項方法進(jìn)行測定計算回收率，并分別計算回收的RSD，結(jié)果如表3所示。

表3 畜禽肉中氯霉素類添加回收試驗結(jié)果(n=6)Tab 3 The recovery of chloramphenicol from livestock and poultry meat(n=6)

2.4.5 檢出限和定量限 根據(jù)限量要求，對畜禽肉加標(biāo)回收試驗，當(dāng)添加氯霉素為某一濃度，定量離子信噪比S/N=3±0.3，此時檢出量為檢出限；當(dāng)添加氯霉素為某一濃度，定量離子信噪比S/N=10±1，此時檢出量為定量限。同法測定氟苯尼考檢出限和定量限。結(jié)果表明，當(dāng)添加氯霉素濃度為0.065 μg/kg時，定量離子信噪比S/N=3.2，當(dāng)添加濃度為0.2 μg/kg時，定量離子信噪比S/N=10.2，得氯霉素的檢出限和定量限分別為0.065 μg/kg和0.2 μg/kg。同法得氟苯尼考檢出限和定量限分別為0.1 μg/kg和0.3 μg/kg。

2.5 殘留量測定和數(shù)據(jù)分析結(jié)果 對照品與供試品溶液各進(jìn)樣5 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析，試驗數(shù)據(jù)采用multiquant軟件按內(nèi)標(biāo)峰面積法計算氯霉素和氟苯尼考的含量，如表4所示。采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，以及SPSS 18.0中Duncan′S對不同分類參數(shù)結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，如表5所示。

表4 樣本中氟苯尼考檢測結(jié)果Tab 4 Test results of florfenicol in samples

續(xù)表

表5 不同品種、不同月份、不同區(qū)域檢出值Duncan，S分析結(jié)果Tab 5 Results of Duncan，S analysis of detected values in different varieties, months and regions

3 討論與結(jié)論

3.1 前處理方法 實驗前期通過比較不同研究者前處理方法差別(表6)，選擇從提取溶劑的選擇和是否需經(jīng)過固相萃取柱凈化這兩個最關(guān)鍵前處理因素入手，以油脂去除能力和回收率為參考指標(biāo)確定了最佳提取方案。

3.1.1 提取溶劑選擇 基于油脂等雜質(zhì)的帶入差異，比較堿化乙酸乙酯和乙腈兩種提取溶劑。經(jīng)2.2項中2.2.1和2.2.2所述前處理步驟中提取處理后，提取液直接用氮氣吹干后對比，相對于乙酸乙酯，乙腈帶入油脂更少，如圖1中a、b所示；經(jīng)2.2項中2.2.1和2.2.2所述前處理步驟處理后，相對于乙酸乙酯，乙腈提取殘留的油脂等雜質(zhì)更少，如圖2中c、e所示；進(jìn)一步比較經(jīng)兩者前處理步驟處理后回收率的差異，乙腈提取回收率高于乙酸乙酯提取(表7)。因此，提取溶劑建議選擇乙腈。

3.1.2 是否需要經(jīng)固相萃取柱凈化處理 結(jié)果顯示，經(jīng)2.2項中2.2.2和2.2.3所述前處理步驟處理后，兩者去油效果相當(dāng)，如圖2中d、e所示。進(jìn)一步比較兩者回收率差異后，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)固相萃取柱凈化處理的樣品回收率相對過柱處理更接近100%(表7)，這也使得檢測值更接近真實值。另外，由于固相萃取技術(shù)操作繁瑣，以及經(jīng)丙酮-正己烷溶液脫液[8-9]，仍然能夠帶入一部分油脂，凈化效果相對于不經(jīng)過固相萃取處理并不明顯。而且，經(jīng)過過柱前三步處理(乙腈提取，氮吹前后的乙腈飽和正己烷萃取)后，去除油脂能力與過柱相當(dāng)。因此，建議可不經(jīng)過柱凈化處理。

綜上所述，最終確定2.2.3制備方法三項為最佳制備方法。

圖1 不同溶劑提取Fig 1 Extraction with different solvents

圖2 不同溶劑凈化方式Figure 2. Cleaning methods with different solvent

表6 畜禽肉前處理報道Tab 6 Report on pretreatment of livestock and poultry meat

表7 不同前處理方式回收率測定(n=10)Tab 7 The recovery rates of different pretreatment methods(n=10)

3.2 檢測結(jié)果

3.2.1 檢出率分析 本實驗對372批次的樣品進(jìn)行檢驗，含氯霉素樣品檢出0批次，含氟苯尼考樣品檢出60批次，檢出率為16.1%，詳見表4。

月份差異。3月采集樣品39批次，檢出14批次；4月采集樣品69批次，檢出18批次； 5月采集樣品66批次，檢出12批次；6月采集樣品60批次，檢出6批次；8月采集樣品17批次，未檢出；9月采集樣品14批次，檢出1批次；10月采集樣品15批次，檢出2批次；11月采集樣品21批次，檢出2批次；12月采集樣品29批次，未檢出。不同月份檢出批次在總372批次、所有檢出的60批次及該月采集批次中占比如圖3所示。由圖3可知，根據(jù)檢出批次在該月中占比的檢出率高低排序為3月>4月>5月>10月>7月>6月>11月>9月>8月=12月。

圖3 不同月份氟苯尼考檢出率Fig 3 The detection rate of florfenicol in different months

品種差異。雞肉采集樣品168批次，檢出26批次；牛肉采集樣品58批次，檢出3批次；豬肉采集樣品62批次，檢出16批次；鴨肉采集樣品84批次，檢出15批次。不同品種的肉在總372批次、檢出60批次及本品種中占比如圖4所示。由圖4可知，檢出批次在該品種中占比的檢出率高低排序為豬肉>鴨肉>雞肉>牛肉。

區(qū)域差異。東區(qū)采集樣品128批次，檢出28批次；南區(qū)采集樣品112批次，檢出15批次；西區(qū)采集樣品72批次，檢出12批次；北區(qū)采集樣品18批次，未檢出；縣區(qū)采集樣品42批次，檢出5批次。檢出批次在總372批次、檢出60批次及本區(qū)域中占比如圖4所示。由圖4可知，檢出批次在該區(qū)域中占比的檢出率高低排序為東區(qū)>西區(qū)>南區(qū)>縣區(qū)>北區(qū)。

圖4 不同品種和地區(qū)氟苯尼考檢出率Fig 4 The detection rate of florfenicol test of different varieties and regional

3.2.2 檢出值分析 氟苯尼考檢測結(jié)果中，含量小于0.1 μg/kg有7批次，占比11.7%；含量為0.1～1.0 μg/kg有38批次，占比63.3%，含量大于1.0 μg/kg有15批次，占比25%，并且有5批次接近或遠(yuǎn)大于10.0 μg/kg，如表4所示。對檢出值的不同品種、不同月份、不同區(qū)域進(jìn)行Duncan′S分析，結(jié)果如表5所示。

結(jié)果顯示，不同品種的檢出量平均值大小依次排序為牛肉>雞肉>豬肉>鴨肉，且品種之間進(jìn)行Duncan′S分析，兩兩比較，無顯著性差異(P>0.05)。另外，不同月份之間為5月>4月>3月>7月>6月，不同區(qū)域間為西區(qū)>東區(qū)>南區(qū)>縣區(qū)，兩兩比較，均無顯著性差異(P>0.05)。

雖然兩兩比較在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異，但是，仍然可以從表4和表5整理的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)部分趨勢。在不同月份比較中，3、4、5月平均值呈遞增趨勢，且5月為7月的8倍，為6月的17倍，顯示出明顯差異。另外，所有檢出值超過1.0 μg/kg的批次中，3月占5批次，4月占4批次，五月占3批次。其他月份中，9月檢出1批次，10月和11月檢出2批次?？傮w而言，5月殘留最為嚴(yán)重。

不同品種中，直接從數(shù)值上看，牛肉檢出值最高，為鴨肉的10倍以上，但是進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，牛肉檢出批次只有3批次，其中有1批次檢出值高達(dá)15.7894 μg/kg，對平均結(jié)果貢獻(xiàn)值過大。其余的品種中，雞肉的平均值為豬肉的2.5倍，為鴨肉的近10倍，顯示出明顯差異。另外，所有檢出值超過1.0 μg/kg的批次中，雞肉占9批次，比另外3個品種總和的6批次還多，說明雞肉的檢出值相對其他品種較高。

不同區(qū)域中，西區(qū)檢出平均值超過東區(qū)的2倍，超過南區(qū)的5倍，超過縣區(qū)的10倍。另外，所有超過1.0 μg/kg的批次中，東區(qū)占10批次，其他區(qū)占5批次，說明東、西兩區(qū)均殘留嚴(yán)重。

綜上所述，對收集的372個批次的樣品進(jìn)行檢測，氯霉素為未檢出。氟苯尼考檢出率中不同月份，明顯3、4、5月份的檢出率高于其他月份；不同采集地區(qū)中，東區(qū)檢出率最高，超20%；不同品種，豬肉檢出率最高，超過20%。檢出值中，63.3%的樣品檢出值位于0.1～1.0 μg/kg之間。進(jìn)一步對不同因素進(jìn)行SPSS-Duncan′S分析，結(jié)果顯示無顯著性差異(P>0.05)。