纖維蛋白膠復合物促進犬骨折愈合的臨床學觀察

賴鑫，陳智華，范希萍，常麗燁，韓鵬，梁倩，史冬雪，年聚盆，亢心

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)被認為是最有效的骨誘導分化因子，可以誘導骨髓間充質干細胞特異性的分化為骨和軟骨細胞[1-2]。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)被證實具有促進成纖維細胞分裂的作用[3-4]。有研究表明，妥布霉素應用于骨折局部不僅可以預防感染還可以促進骨折修復[5]。如果將rhBMP-2、bFGF和妥布霉素聯(lián)合應用于骨折愈合理論上能起到比單獨應用更好的效果。但目前尚未見到相關的文獻報道。另外，rhBMP-2、bFGF和妥布霉素如果直接應用于骨折部，很快就會被組織吸收，若長期注射抗生素，會加大抗生素的毒副作用也會使細菌產(chǎn)生耐藥性。故需要一種緩釋載體來承載這些藥物，以達到在骨折部位緩慢而持久的釋放高濃度藥物的目的。膠原纖維蛋白(FG)是一種已經(jīng)被成熟應用的骨組織工程支架。有低抗原性、優(yōu)秀的生物相容性等特點，其三維網(wǎng)狀結構可以有助于新生細胞的附著還可以減緩藥物釋放的速度。因此，本研究將rhBMP-2、bFGF和妥布霉素聯(lián)合應用，以FG為緩釋載體應用在骨折部，觀察它對骨折愈合過程的影響，探索新的犬的骨折治療思路。

1 材 料

1.1 動物及分組 市場采購成年已進行過免疫及驅蟲、體況良好的小型犬12只，雌雄不限。所有犬均建立脛骨骨折模型，右側肢脛骨骨折模型作為對照組，骨折處不用任何藥物；左側肢脛骨骨折模型作為實驗組，骨折處應用FG/rhBMP-2/bFGF/妥布霉素復合物。

2.2 儀器及藥品 常規(guī)軟組織器械包；骨科器械包；動物麻醉呼吸機(型號：Model3000)：美國MATRX公司；數(shù)字化醫(yī)用X射線攝影系統(tǒng)(型號：Ange11-DR-A-H)：深圳市安健科技有限公司；獸用監(jiān)護儀(型號：ipm12 Vet)：深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；手術無影燈(型號：ZF700)：山東銘泰醫(yī)療器械有限公司；注射用氨芐西林鈉：河北遠征藥業(yè)有限公司，獸藥字(2013)030011304；多咪靜：碩騰動物保健用品有限公司，外獸藥證字52號；異氟烷：魯南貝特制藥有限公司，國藥準字：H20020267；豬纖維蛋白原(純度>85%)：甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院外科教研組實驗室提取；矛頭蝮蛇凝血酶：深圳市康初源有限公司；氯化鈣：連云港樂天化工有限公司；堿性成纖維細胞生長因子：賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司；重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；硫酸妥布霉素注射液：上海禾豐制藥有限公司，國藥準字H31022032

2 方 法

2.1 FG/rhBMP-2/bFGF/妥布霉素復合物的配制 手術開始前15 min，在嚴格無菌的的條件下制備纖維蛋白膠A液和B液。A液的配置：37℃水浴加熱條件下將100 mg纖維蛋白原和0.8 mL妥布霉素注射液混合，輕搖震蕩使兩種藥均勻混合；B液：將800 mg人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、3.5 mg氯化鈣、3 mg凝血酶原和0.016 mg堿性成纖維細胞生長因子溶解于0.8 mL妥布霉素注射液，混合后輕搖使其完全溶解。放置于雙聯(lián)注射器支架內，待用。

2.2 犬脛骨骨折模型的構建

2.2.1 術前準備、用藥與麻醉 術前禁食禁水12 h，術前15 min肌肉注射阿托品(0.05 mg/kg)、尖吻蝮蛇凝血酶(10 UI/kg)。肌肉注射多咪靜(500 μg/kg)進行誘導麻醉，動物進入麻醉狀態(tài)后，插入氣管插管并連接動物麻醉呼吸機使用異氟烷進行呼吸麻醉。連接監(jiān)護儀隨時監(jiān)測動物生命體征。備皮、仰臥保定、后肢懸吊、隔離、消毒。

2.2.2 手術過程 做切口，近端于脛骨內側髁開始，向前弧形至脛骨干中線，并沿其中線繼續(xù)向下切開，然后再弧形終止至脛骨內髁。依皮膚切口線切開皮下組織。切開筋膜顯露脛骨，再分離筋膜顯露諸肌肉。手術設計為先在脛骨上固定一塊長度為脛骨3/2寬度與脛骨體相當?shù)墓前逶黉彅嗝劰堑姆椒▉斫⒚劰枪钦勰Ｐ?。為使接骨板與脛骨體緊密結合，用骨板彎折器給接骨板塑性，用導孔復位鉗固定脛骨體和接骨板方便打孔，通過接骨板導孔在預定鋸斷脛骨位置的遠端和近端各打兩個直徑1.5 mm的孔，并植入骨螺釘，用電動平擺鋸在接骨板橋接部位中心點垂直于脛骨將脛骨鋸斷(鋸片寬7 mm、厚0.7 mm)，由助手持雙聯(lián)注射器將藥物緩慢填滿骨折處，對照組則不使用任何藥物。逐層縫合骨膜、肌肉、皮膚。手術全程在嚴格無菌條件下進行。

2.2.3 術后護理 安靜飼養(yǎng)，使用氨芐西林鈉(15 mg/kg)靜脈滴注連用三天，做輔助全身抗感染治療。因為犬兩后肢均不能運動，故制作改良托馬斯支架輔助支撐，同時每天人為輔助運動后肢，防止肌肉萎縮。

2.3 術后骨折部周圍軟組織充血水腫消失時間測定 每日拆開托馬斯支架采用觸診和視診的方法，測定術后骨折部周圍軟組織充血水腫消失時間。

2.4 X射線影像學觀察 術后借助X射線觀察骨折部的變化。參考唐琳麗[6]對X射線閱片評價標準(見表1)，以此為標準對術后骨折部骨愈合程度進行評分。

2.5 骨密度(BMD)及骨密度比率測定 根據(jù)Kenae[7]的研究可知，密度為130 mg/cm2的骨礦物質等同于厚度為1 mm的鋁。故將一塊標準的梯形鋁楔(高16.0 mm、上底1.0 mm、下底18.0 mm)與骨折部放置于同一X射線曝光位置下進行拍攝。取與骨折部位灰度相同的鋁楔的厚度，即可測出該部位的骨密度(BMD)。骨密度比率=新生骨骨密度/健康骨骨密度。

2.6 骨痂體積測定 術后第4周和第8周，隨機抽取兩只實驗犬，手術暴露骨折部位，測量骨痂長度(L)骨痂半徑(R2)和脛骨半徑(R1)。參考Perkins[7]骨痂體積計算公式：2πR1(R2-R1)L,計算出骨痂體積。

2.7 骨生物力學強度測定 術后第16周采用丙泊酚靜脈注射麻醉后靜脈注射氯化鉀的方法將動物安樂死，截取兩側脛骨，除去骨板及覆蓋在脛骨表面的軟組織。使用微機控制電子萬能(拉力)實驗機，對脛骨進行三點彎曲破壞實驗?？缇?6 mm對脛骨的載荷為2.00 mm/min，直到脛骨折斷，記錄脛骨折斷時脛骨彎曲的位移和脛骨承受的拉力。

2.8 統(tǒng)計學方法 本研究所有統(tǒng)計學分析均由統(tǒng)計軟件SPSS22.0完成。數(shù)據(jù)之間的比較采用獨立樣本t檢驗。

3 結果與分析

3.1 術后骨折部周圍軟組織充血水腫消失時間

表2 術后骨折部周圍軟組織充血水腫消失時間Tab 2 Time of disappearance of congestion and edema of soft tissue around fracture after operation

*表示組內比較，#表示與對照組比較，*/#P<0.05,**/##P<0.01

由表2可知，術后術部軟組織紅，腫，熱消失時間實驗組明顯短于對照組。

3.2 X光影像學綜合評分結果 由表3可知，術后實驗組第2周、4周、8周、12周影像學評分結果均顯著高于對照組(p>0.01)。第16周影像學評分實驗組高于對照組但差異不顯著(P>0.05)。實驗組術后16周與術后12周相比，差異不顯著(P>0.05)，說明術后12周骨骼已基本愈合。

表3 X光影像學評分結果Tab 3 X-ray imaging score results

*表示組內比較，#表示與對照組比較，*/#P<0.05,**/##P<0.01

圖1 術后第2周Fig 1 2ndweek after operation

圖2 術后第4周Fig 2 4ndweek after operation

圖3 術后第6周Fig 3 6ndweek after operation

圖4 術后第8周Fig 4 8ndweek after operation

圖5 術后第12周Fig 5 12ndweek after operation

3.3 BMD及BMD比率測定結果 由表4可知，術后實驗組第2周、4周、8周、12周影像學評分結果均顯著高于對照組(p>0.01)。第16W影像學評分實驗組高于對照組但差異不顯著(P>0.05)。

3.4 骨痂體積 由表5可知，術后4周和術后8周實驗組骨痂體積均大于對照組。

3.5 骨生物力學強度測定結果 由表6可知，術后16周，實驗組脛骨可以承受的最大位移和最大載荷均顯著高于對照組(P<0.05)。

表4 術后各時間點BMD及BMD比率Tab 4 BMD and BMD ratio at different time points after operation

*表示組內比較，#表示與對照組比較，*/#P<0.05,**/##P<0.01

表5 術后各時間點骨痂體積測量結果Tab 5 Measurement results of mineralization volume at different time points after operation

*表示組內比較，#表示與對照組比較，*/#P<0.05,**/##P<0.01

表6 術后16周脛骨生物力學測定結果Tab 6 Measurement test results of tibia at 16th weeks after operation

*表示組內比較，#表示與對照組比較，*/#P<0.05,**/##P<0.01

4 討論與結論

4.1 FG聯(lián)合rhBMP-2、bFGF與妥布霉素對X射線評分的影響 骨折愈合最初兩周，是內外骨痂和橋梁骨痂形成、以及相互融合后形成原始骨痂的過程。觀察術后第2周X光片發(fā)現(xiàn)，實驗組骨折斷端較清晰，骨折線開始模糊，可見少量骨痂但邊緣不整齊X射線評分為10.00分，對照組骨折斷端清晰，邊緣模糊，幾乎看不見骨痂生長X射線評分為6.00分。因為內骨痂、橋梁骨痂由于骨皮質的重疊及骨化慢所以X光片上不易顯影[8]。在X光片上可見密度比骨皮質低的梭形骨痂陰影(外骨痂)。因此，實驗組犬脛骨較對照組更早開始骨折的修復。

BMP作為骨折修復中骨生成的啟動因子，在骨折愈合前期起主要作用。BMP-2可以誘導間充質細胞分化為骨細胞，同時有研究表明[9]，BMP-2同時也可以誘導成纖維細胞等向骨細胞分化[10]。bFGF有促進由間質細胞分化而來的骨細胞增殖的作用[11]。也可促進骨折愈合過程中建立良好的血運[12-13]，而有的研究認為[14]，在一些骨不連接的組織中的成骨細胞其實和正常成骨細胞在功能上是一致的。因此，在術后第4周和第8周實驗組X光影像評分都顯著高于對照組，且從X光片上可得知，實驗組在第8周骨皮質連接骨折線就已基本消，而對照組一直到第12周才達到相同的效果。實驗組能夠比對照組更快的使骨折愈合，是因為FG聯(lián)合rhBMP-2、bFGF與妥布霉素形成的網(wǎng)狀立體結構，可使rhBMP-2、bFGF緩慢的作用于骨折部位，加快骨細胞分化，促進新血管生成。

4.3 FG聯(lián)合rhBMP-2、bFGF與妥布霉素對骨痂體積的影響 骨痂體積可以作為骨折愈合程度的輔助方法之一，骨痂生成的多證明骨折愈合速度較快，骨痂生成的少證明骨折愈合的速度較慢[15]。本研究表明，術后第4周和第8周測量骨痂體積實驗組比對照組大。因為FG聯(lián)合rhBMP-2、bFGF與妥布霉素應用于骨折部位，包裹住受傷組織可以減小血腫擴大，所以骨折能盡快以膜內成骨的方式達到愈合。妥布霉素作為一種抗生素可以有效抑制感染。bFGF可以促進血管生成，細胞遷移及增殖。巨噬細胞具有吞噬運輸壞死物質的功能，在骨折愈合初期有重要的作用，而FG可以促進巨噬細胞向骨折部位遷移[16]。FG聯(lián)合妥布霉素、rhBMP-2與bFGF在骨愈合時期促進骨折部位周圍組織建立了更好的血液供應系統(tǒng)，促進了纖維性骨痂中膠原纖維的生成。當在X光片上看不到骨痂間隙，骨痂與骨皮質界限分不清楚時，骨折已達到骨性愈合，這時骨痂中的破骨細胞開始清除不需要的骨組織，同時在骨痂不足的部位成骨細胞產(chǎn)生新骨[17]。無論是實驗組還是對照組在術后8周的骨痂體積都小于第4周，說明骨折在第8周已經(jīng)進入骨痂重塑期。

4.4 FG聯(lián)合rhBMP-2、bFGF與妥布霉素對BMD和骨生物力學強度的影響 骨折后形成的原始骨痂非常脆弱，只能起到暫時固定的作用，要形成堅固的成熟骨形態(tài)，需要通過骨改建的過程，術后第16周測定不論是骨生物力學強度還是BMD實驗組都明顯高于對照組。說明實驗組骨折部更堅固。新生成的骨鈣化是一個重要的過程，良好的血運可以運輸充足的Ca+和血P+到達骨折部。bFGF可以促進血管生成建立良好的血液供應[18]。骨膠原纖維與膠原纖維都是由Ⅰ型膠原蛋白組成的，但是骨膠原蛋白的化學鍵不同，骨膠原蛋白有更好的穩(wěn)定性，是沉積鈣鹽的重要結構[19]。bFGF同時還能促進APL(堿性磷酸酶)的釋放，APL是骨骼愈合中非常重要的一種酶可以使骨折部無機磷的濃度升高，對新生成骨礦物質沉積有促進作用[20]。所以FG聯(lián)合妥布霉素、rhBMP-2與bFGF促進建立良好的血液循環(huán)網(wǎng)絡、促進間質細胞分化、促進成骨細胞增殖、促進ALP釋放是術后實驗組BMD高于對照組的原因[21-22]。

4.5 結論 FG聯(lián)合rhBMP-2、bFGF與妥布霉素，可加快骨折愈合的速度，縮短骨折愈合的時間，可促使骨折愈合過程中骨痂的形成，促使骨折愈合過程中骨礦物質的沉積和骨折愈合后生物力學強度的恢復，對骨折術部軟組織愈合也具有一定的促進作用。四種材料相輔相成，參與骨折愈合的全過程，具有良好的促進骨折愈合效果，為犬骨折臨床治療提供了一個新方案。