水貂犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))臨床安全性和免疫效力評價

馮二凱，易立，陳立志,，張淼，羅國良，郭利， 王振軍，程世鵬，任飛，程悅寧*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130112；2. 吉林特研生物技術(shù)有限責任公司， 長春 130122)

水貂犬瘟熱是由副黏病毒科、麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CDV)感染水貂引起的一種急性、高度接觸性、高死亡率的傳染病[1-2]，Rudolf在1928年首次報道了該病，我國首例水貂犬瘟熱發(fā)生于1968年[3]，以后逐漸蔓延至全國，給我國乃至全世界的水貂養(yǎng)殖者或農(nóng)場主造成了嚴重經(jīng)濟損失。

水貂犬瘟熱沒有有效治療藥物，疫苗免疫是預(yù)防和控制該病的最有效手段。中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所先后研制了水貂犬瘟熱雞胚成纖維細胞活疫苗和水貂犬瘟熱Vero細胞活疫苗，為預(yù)防和控制我國毛皮動物犬瘟熱的爆發(fā)和流行，減少廣大毛皮動物養(yǎng)殖戶經(jīng)濟損失等方面奠定了堅實基礎(chǔ)[4-5]。

然而，目前常見的水貂犬瘟熱疫苗都是基于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)，需要添加高濃度血清，具有生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量有限、生產(chǎn)周期長等缺點，無法滿足不斷擴大的毛皮動物病毒類疫苗的市場需求；其次，在病毒類疫苗市場競爭越來越激烈的背景下，越來越多的企業(yè)開始注重自身疫苗懸浮培養(yǎng)平臺的建立，提升疫苗質(zhì)量、降低疫苗生產(chǎn)成本，提升本企業(yè)疫苗的市場競爭力[6-8]。此外，根據(jù)《新獸藥研制管理辦法》2005版中關(guān)于新獸藥研制的要求，疫苗需要開展臨床研究，以驗證疫苗在臨床應(yīng)用中的安全性和有效性。

因此，本研究在前期水貂犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))凍干制劑的安全檢驗、性狀檢驗、無菌檢驗、效力檢驗等均合格的基礎(chǔ)上[9-10]，分別在吉林、遼寧兩省進行了犬瘟熱Vero活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))凍干制劑的臨床安全性和免疫效力評價。

1 材料與方法

1.1 試用疫苗 3批犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))凍干制劑，批號：201701、201702、201703，由吉林特研生物技術(shù)有限責任公司試制。

1.2 試驗試劑 Vero細胞(CCL-81)，購自美國國家菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)；新生牛血清(批號：20160405)，由內(nèi)蒙古金源康生物提供；DMEM(批號：1693945), 由美國Gibco公司提供；CDV強毒株(LNM株)，由中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所分離鑒定、保存；犬瘟熱病毒陽性血清，血清中和抗體(Serum neutralizing antibody，SN)≥1∶256，中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所制備和保存。

1.3 實驗場所及動物 選擇飼養(yǎng)規(guī)模相近的3個毛皮獸養(yǎng)殖場(吉林省2個，遼寧省1個)作為疫苗試用場所：選擇美國短毛黑水貂，2～4月齡，未接種任何疫苗，經(jīng)犬瘟熱病毒抗體檢測，其血清中和抗體SN≤1∶4，作為疫苗接種對象；接種方式為后肢內(nèi)側(cè)肌肉注射；各試驗場使用實驗動物數(shù)量、性別統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 疫苗臨床試用毛皮獸場及實驗動物情況一覽表Tab 1 The list of fur farms and animals that used to evaluate the vaccine

1.4 疫苗安全性試驗 將3批疫苗分別接種2～4月齡育成水貂，10頭份/只，分4點注射；每個試驗點100只水貂，接種后每天觀察水貂的精神、食欲、糞便的變化，連續(xù)觀察14 d，記錄結(jié)果。

1.5 疫苗效力試驗 將3批疫苗分別接種2～4月齡育成水貂，1 頭份/只；免疫21 d后每組隨機選擇水貂20只，采血、分離血清、測定抗體，記錄結(jié)果；免疫180 d后，從每個實驗組隨機選水貂20只，采血分離血清測定血清抗體；用100個ID50的CDV強毒(CDV-LNM株)對3批疫苗免疫組(5只/批)和對照組水貂(3只)進行攻毒，觀察動物是否出現(xiàn)典型犬瘟熱臨床癥狀，統(tǒng)計動物死亡和存活數(shù)，持續(xù)15 d，記錄結(jié)果。

1.6 疫苗抗體監(jiān)測 3批疫苗分別接種2～4月齡育成水貂，1 mL/只；分別在接種7 d、14 d、21 d、60 d、120 d、180 d分別隨機選水貂各10只進行采血，分離血清，測定血清中和抗體，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))試制和性狀檢驗結(jié)果 基于前期建立的犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))制備工藝，試制3批疫苗，疫苗試制數(shù)量、疫苗性狀檢測結(jié)果見表2。

表2 犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))中間試制及檢驗結(jié)果Tab 2 Pilot scale production and inspection of the mink canine distemper attenuated live Vaccine

2.2 疫苗安全性試驗結(jié)果 3批疫苗在3個毛皮獸場分別超劑量皮下接種(后肢內(nèi)側(cè)肌肉)2～4月齡育成水貂，觀察14 d，接種水貂食欲、精神狀態(tài)正常，接種局部無腫脹和炎癥，未出現(xiàn)局部和全身反應(yīng)，說明疫苗對水貂具有較好的安全性。結(jié)果見表3。

表3 犬瘟熱活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))安全性試驗結(jié)果Tab 3 The security test recor of the mink canine distemper modified live vaccine (CDV3-CL strain, Suspension)

2.3 犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))效力試驗結(jié)果 由表4及表5可知，犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))接種水貂21 d后，血清中SN抗體效價均在1∶64以上，對照組SN抗體在1∶4以下；疫苗接種水貂180 d，免疫水貂血清SN抗體均在1∶81以上；用100個ID50的CDV強毒(CDV-LNM株)攻擊，免疫組水貂獲得100%保護，對照組均發(fā)病。

表4 犬瘟熱活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))免疫水貂21d效力試驗結(jié)果Tab 4 The 21-d immune efficacy result of mink canine distemper modified live vaccine CDV3-CL strain, Suspension)

表5 犬瘟熱活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))免疫水貂180 d效力試驗結(jié)果Tab 5 The 180-d immune efficacy result of mink canine distemper modified live vaccine (CDV3-CL strain, Suspension)

2.4 不同批次疫苗免疫水貂抗體監(jiān)測結(jié)果 由表6可知，犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮)接種水貂，7 d抗體開始產(chǎn)生，部分水貂14 d即可達到免疫保護水平；21d 水貂的中和抗體均在免疫保護水平之上；疫苗免疫180 d，仍保持較高的抗體滴度。

表6 犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))免疫水貂SN抗體持續(xù)時間測定結(jié)果Tab 6 The duration period of serum neutralizing antibody of different batch of mink canine distemper acttenuated lived vaccine(CDV3-CL strain, Suspension)

3 討論與結(jié)論

根據(jù)《新獸藥研制管理辦法》2005版中關(guān)于新獸藥研制的要求，本研究按照水貂犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))制造與檢驗試行規(guī)程(草案)中試生產(chǎn)了3批疫苗，并選擇吉林省、遼寧省3個飼養(yǎng)規(guī)模相近的毛皮獸場開展疫苗臨床試用，評價疫苗的臨床試用效果。

生物制品的安全性是養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的前提條件。本研究通過后肢內(nèi)側(cè)肌肉注射途徑，將超劑量疫苗接種試驗場水貂，接種后水貂在觀察期(14 d)內(nèi)無全身和局部異常反應(yīng)，且無死亡和發(fā)病病例出現(xiàn)，說明疫苗具有較好的安全性；此外，接種水貂的食欲和精神均正常，且對動物的生產(chǎn)性能無影響，進一步說明疫苗的安全性，可以用于臨床疾病防治。

疫苗的效力，尤其是疫苗的臨床效力，是養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵。本研究通過將試制的3批水貂犬瘟熱Vero細胞活疫苗接種生產(chǎn)中的水貂，考察疫苗的臨床免疫效果。疫苗免疫后7 d即可檢測抗體；14 d時，部分動物的抗體水平即可達到免疫保護水平；21 d即可獲得堅強的免疫力，且犬瘟熱病毒中和抗體水平均在臨界保護值1∶64以上；免疫180 d血清中的犬瘟熱病毒中和抗體仍然在臨界值之上。動物攻毒實驗也證實，免疫水貂能夠抵抗100 ID50CDV強毒的攻擊，獲得100%保護。

本研究制備的犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))在免疫接種水貂21d后，可以產(chǎn)生具有免疫保護水平的抗體，且可持續(xù)180 d以上，可用于水貂犬瘟熱的臨床預(yù)防使用。