益腎化濕顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

盧秋梅，黎 倩，黃艷霞，栗建明

（1. 廣州市藥品檢驗(yàn)所·國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510160；2. 廣州康臣藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510635）

益腎化濕顆粒為廣州康臣藥業(yè)有限公司獨(dú)家品種，處方源自《脾胃論》中的升陽益胃湯，由人參、黃芪、黃連等16 味中藥組方[1]，功效為升陽補(bǔ)脾、益腎化濕、利水消腫，用于脾虛濕盛證所致蛋白尿，兼見水腫、疲倦乏力、畏寒肢冷、納少等證[2]。該方傳統(tǒng)劑型為湯劑，不易貯存及攜帶，顆粒劑克服了湯劑的不足，具有穩(wěn)定、易攜帶的特點(diǎn)[3]。目前，該藥僅有局頒標(biāo)準(zhǔn)(國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ04482009)。在此基礎(chǔ)上，本研究中新增了人參的薄層色譜（TLC）鑒別和黃芪中黃芪甲苷的高效液相色譜（HPLC）法含量測定，修訂了人參的HPLC 含量測定方法（增加人參皂苷Rg1和Re 指標(biāo)），完善了黃芪、獨(dú)活、甘草、白芍、黃連和陳皮的TLC 鑒別方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

P300H 型超聲波清洗器（德國Elma 公司，功率為300 W，頻率為37 kHz）；TLC 板加熱器，TLC Visualizer薄層成像系統(tǒng)(瑞士Camag 公司)；XP26 型電子天平(精度為0.1 mg)；MS204S 型電子天平(精度為0.001 mg），均購自瑞士Mettler Toledo 公司；ST16 型高速離心機(jī)（美國賽默飛公司）；TW12 型恒溫水浴鍋(德國Julabo 公司)；硅膠G60 薄層板（德國Merck 公司）；1260Ⅱ型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司)，包括Alltech 6000 蒸發(fā)光散射檢測器，Openlab CDS 2.2 色譜工作站。

1.2 試藥

益腎化濕顆粒（批號(hào)分別為20180608，20180609，20180701，規(guī)格為每袋10 g）及所有陰性樣品均購自廣州康臣藥業(yè)有限公司；對(duì)照藥材黃芪（批號(hào)為120974 －201612）、人參（批號(hào)為120917 －201712）、獨(dú)活（批號(hào)為120940 －201612）、甘草（批號(hào)為120904 －201620）、白芍（批號(hào)為120905 －201610）、黃連（批號(hào)為120913 －201611）、陳皮（批號(hào)為120969 －201510），以及對(duì)照品人參皂苷Rg1（批號(hào)為110703 －201832）、人參皂苷Re（批號(hào)為110754 －201827）、人參皂苷Rb1（批號(hào)分別為110704 －201726，110704 －201827）、黃芪甲苷（批號(hào)為110781 －201717）、芍藥苷（批號(hào)為110736 －201842）、鹽酸小檗堿（批號(hào)為110713 －201814）、橙皮苷（批號(hào)為110721 －201818）、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯（批號(hào)為111583 －201304），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

人參、黃芪：取本品4 g，加水40 mL 溶解，離心，取上清液，用乙醚萃取3 次，每次30 mL，合并乙醚液（備用），分取水溶液（溶液1）10 mL，用水飽和正丁醇振搖提取3 次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨試液提取3 次，每次30 mL，棄去氨試液，正丁醇蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。取人參對(duì)照藥材0.5 g，黃芪對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。分別取缺人參、黃芪的陰性樣品適量，同法制得缺人參、黃芪陰性對(duì)照品溶液。取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述溶液1 ～2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇－乙酸乙酯－稀氨液（5→50，4 ∶1 ∶5，V／ V／ V）的上層溶液為展開劑，另槽加入10 mL 濃氨試液，預(yù)平衡15 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光及紫外光（365 nm）下檢視。色譜圖見圖1。可見，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上分別顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

圖1 人參、黃芪薄層色譜圖

圖2 甘草、黃連、陳皮薄層色譜圖

甘草：取水溶液1，用水飽和正丁醇振搖提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，正丁醇蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取甘草對(duì)照藥材0.5 g，加水40 mL，煎煮30 min，濾過，取濾液同法制成對(duì)照藥材溶液。取缺甘草陰性樣品適量，同法制得缺甘草陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上使成條帶狀，以乙酸乙酯－冰醋酸－甲酸－水（15 ∶1 ∶1 ∶2，V／ V／ V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。色譜圖見圖2 A?？梢?，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

黃連：取本品4 g，加95%乙醇15 mL，超聲30 min，過濾，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液（溶液2）。取黃連對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取缺黃連陰性樣品適量，同法制得缺黃連陰性對(duì)照品溶液。取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性樣品溶液各4 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上使呈條帶狀，以甲苯－乙酸乙酯－甲醇－異丙醇－水（6 ∶3 ∶2 ∶1.5 ∶0.3，V／ V／ V／ V／ V）為展開劑，另槽加入10 mL 濃氨試液，預(yù)平衡15 min，展開，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視。色譜圖見圖2 B。可見，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

陳皮：取陳皮對(duì)照藥材0.3 g，加95%乙醇15 mL，超聲30 min，過濾，濾液蒸干，定容至5 mL，作為對(duì)照藥材溶液。取缺陳皮陰性樣品適量，同法制得缺陳皮陰性對(duì)照品溶液。取橙皮苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含0.4 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取溶液2、對(duì)照藥材溶液及缺陳皮陰性對(duì)照品溶液各4 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上（條狀點(diǎn)樣），以三氯甲烷－甲醇－水（28 ∶10 ∶1，V／ V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，在105 ℃加熱數(shù)分鐘，置紫外光（365 nm）下檢視。色譜圖見圖2 C。可見，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters X select HSS T3 十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－水（B），梯度洗脫程序見表1；蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度：105 ℃，載氣流速：3.0 L／min。在此色譜條件下，各成分分離度良好，陰性對(duì)照無干擾，理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。色譜圖見圖3。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）

圖5 含量測定高效液相色譜圖

2.2.2 溶液制備

取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含人參皂苷Rg10.08 mg、人參皂苷Re 0.13 mg、人參皂苷Rb10.20 mg 和黃芪甲苷0.07 mg 的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。取本品約4 g，混勻，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50 mL，超聲處理（功率為300 W，頻率為37 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心10 min，取上清液25 mL，加乙醚振搖提取3 次，每次30 mL，棄去乙醚液，水液再用水飽和正丁醇提取5 次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液充分洗滌2 次，每次40 mL，合并氨試液，用水飽和正丁醇提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別取缺人參陰性樣品、缺黃芪陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺人參和缺黃芪陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：配制線性關(guān)系考察樣品溶液6 份，進(jìn)樣10 μL，以質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)（X，mg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積的對(duì)數(shù)（Y）為縱坐標(biāo)繪制校正曲線。結(jié)果見表2。

表2 各成分線性關(guān)系考察結(jié)果

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為180608）6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結(jié)果人參皂苷Rg1，Re，Rb1及黃芪甲苷含量的RSD 分別為1.75%，3.33%，2.88%，3.07%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為180608）4 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，16，20，24，28 h 時(shí)按擬訂色譜條件測定。結(jié)果人參皂苷Rg1，Re，Rb1及黃芪甲苷含量的RSD 分別為3.71% ，2.40% ，1.81%，1.73%（n ＝8），表明供試品溶液28 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為180608）6 份，每份2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度分別為0.414 55，1.007 46，1.504 21，0.538 47 mg／mL 的人參皂苷Rg1，Re，Rb1和黃芪甲苷）1 mL，揮干，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

2.2.4 樣品含量測定

為確保含量數(shù)據(jù)更具有代表性，廣州康臣藥業(yè)有限公司增加樣品15 批，共18 批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算含量。結(jié)果見表4。按人參皂苷總量、黃芪甲苷含量平均值的80%設(shè)限，結(jié)果分別為1.08，0.26 mg ／g。擬規(guī)定樣品中每1 g 含人參以人參皂苷Rg1（C42H72O14）、人參皂苷Re（（C54H92O23）和人參皂苷Rb1（C54H92O23）的總量計(jì)，不得少于1.08 mg；每1g 含黃芪以黃芪甲苷（C41H68O14）計(jì)，不得少于0.26mg。

表3 各成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）

表4 18 批樣品各成分含量測定結(jié)果（mg ／g，n ＝18）

3 討論

3.1 TLC 條件篩選

人參、黃芪：人參為新增項(xiàng)，黃芪為修訂項(xiàng)。原標(biāo)準(zhǔn)黃芪鑒別采用萃取、洗滌后還需上大孔樹脂柱多溶劑洗脫，操作煩瑣，檢驗(yàn)周期太長，故對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行優(yōu)化。人參、黃芪、三七等的皂苷鑒別常使用三氯甲烷－甲醇－水（13 ∶7 ∶2，V／ V／ V）及三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水（15 ∶40 ∶22 ∶10，V／ V／ V／ V）展開，難以將人參皂苷與黃芪甲苷較好地分離，且色譜條件受環(huán)境影響較大，需嚴(yán)格控制溫度和濕度，重復(fù)性相對(duì)較差[4]。根據(jù)相關(guān)經(jīng)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[5]，選擇展開條件。

甘草：原標(biāo)準(zhǔn)以甘草酸銨對(duì)照品為對(duì)照，甘草陰性對(duì)照無干擾，但斑點(diǎn)信息較少，試驗(yàn)中曾噴以10%硫酸乙醇加熱顯色后再觀察[6]，發(fā)現(xiàn)甘草陰性對(duì)照有干擾，故參考文獻(xiàn)[7]制訂展開條件。

黃連：原標(biāo)準(zhǔn)中需要二次展開，操作較復(fù)雜，且加入黃連對(duì)照藥材后，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照有干擾，故參考文獻(xiàn)[7]選擇展開條件。

陳皮：修訂時(shí)增加了陳皮對(duì)照藥材，但在驗(yàn)證原標(biāo)準(zhǔn)方法時(shí)發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照有干擾。參考2015 年版《中國藥典(一部)》女金丸項(xiàng)下的展開條件[8]521－522，修訂后的方法操作簡便，陳皮陰性對(duì)照無干擾，專屬性強(qiáng)。

獨(dú)活、白芍 獨(dú)活：TLC 原標(biāo)準(zhǔn)的提取方式耗時(shí)長，且斑點(diǎn)不清晰，常需加大點(diǎn)樣量，而采用2.1 項(xiàng)下乙醚液揮干后作為供試品溶液，既節(jié)省溶劑，減少樣品用量，且斑點(diǎn)又清晰，陰性對(duì)照無干擾，方法專屬性強(qiáng)。白芍在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上增加了白芍對(duì)照藥材，陰性對(duì)照無干擾，方法專屬性強(qiáng)。

3.2 TLC 條件考察

各TLC 鑒別均考察了青島海洋化工硅膠G 和Merck 硅膠G60 預(yù)制板2 種不同薄層板的層析效果，各成分的Rf值存在一定差異，但與相鄰成分分離度均良好，表明2 種薄層板均能滿足鑒別的要求。另固定薄層板，比較在不同溫濕度條件下展開的薄層效果，結(jié)果表明，溫度和相對(duì)濕度對(duì)薄層色譜效果無明顯影響。

3.3 HPLC 成分及色譜條件篩選

人參的主要有效成分為總皂苷，5 種人參皂苷（Rb1，Rb2，Rg1，Rc，Re）占總皂苷含量的80%，具有延緩疲勞產(chǎn)生的作用，主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改善機(jī)體功能、消除疲勞等方面[9]。黃芪的主要有效成分為黃芪甲苷，黃芪甲苷治療腎性高血壓大鼠時(shí)，不僅降壓效果顯著，還可抑制腎氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解腎病理損傷[10]。人參、黃芪是益腎化濕顆粒的君藥，其現(xiàn)代藥理作用均與益腎化濕顆粒的功能主治密切相關(guān)。因此，對(duì)人參皂苷Rg1，Re，Rb1和黃芪甲苷進(jìn)行定量及定性分析，可更好地控制該制劑的質(zhì)量。

2015 年版《中國藥典（一部）》中人參含量測定項(xiàng)下人參皂苷的測定波長為203 nm[8]8－9；黃芪含量測定項(xiàng)下黃芪甲苷含量測定采用蒸發(fā)光散射檢測器法檢測[8]302－303。最初采用紫外光與蒸發(fā)光串聯(lián)同步測定，在研究過程中，發(fā)現(xiàn)樣品在203 nm 波長處人參分離度較差、陰性對(duì)照有干擾，且人參皂苷Rg1，Re，Rb1在蒸發(fā)光下響應(yīng)值也較高，而原標(biāo)準(zhǔn)中在測定人參中的人參皂苷Rb1時(shí)也采用蒸發(fā)光散射檢測器法，最終確定文中的色譜條件。