祛風消癜合劑質(zhì)量標準研究

焦紅軍，董風其，陶明暉，王皖軍，黃上林，馬超亞，唐進法

（1. 鄭州大學第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450014； 2. 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

臨床實踐證實，中醫(yī)藥辨證治療過敏性紫癜具有特色和優(yōu)勢[1－2]。過敏性紫癜的中醫(yī)證候以風熱傷絡(luò)證(占29.5%)為主，僅次于血熱妄行證(占68.9%)，為較常見證型[3]。祛風消癜合劑源自河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科臨床治療過敏性紫癜風熱傷絡(luò)證的多年經(jīng)驗方，由忍冬藤、荊芥、防風、徐長卿、茜草、海風藤、丹參、炙甘草8 味藥材組方，具有祛風消癜、清熱止癢、化瘀通絡(luò)的功效，用于過敏性紫癜、色素性紫癜、蕁麻疹等疾病，辨證屬風熱傷絡(luò)者。經(jīng)臨床應(yīng)用，該方療效顯著，不良反應(yīng)少，為治療過敏性紫癜風熱傷絡(luò)證的良方。為更好地促進該方院內(nèi)制劑的開發(fā)和研制，推廣臨床應(yīng)用，亟需對其質(zhì)量標準進行研究。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對制劑中忍冬藤、防風、炙甘草進行定性鑒別，采用超高效液相色譜（UPLC）法對制劑中的原兒茶醛、馬錢苷和5 － O －甲基維斯阿米醇苷進行含量測定，以建立祛風消癜合劑的質(zhì)量標準。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC H－Class 型超高效液相色譜儀，包括PDA 檢測器、Empower2 色譜工作站（美國Waters公司）；XS105 型電子天平（梅特勒－托利多集團，精度為十萬分之一）；KQ －100DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為100 W，頻率為40 kHz）；TLC VISUALIZER2 型薄層成像儀（瑞士卡瑪公司）。

1.2 試藥

祛風消癜合劑（河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院自制，批號分別為181127，181130，181201，規(guī)格為每瓶100 mL）；馬錢苷對照品（批 號為R23D7F27552），5 －O －甲基維斯阿米醇苷對照品（批號為P05M8F35478），原兒茶醛對照品（批號為P05M7F14533），均購自上海源葉生物有限公司； 甘草苷對照品（ 批號為PRF8110742，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）；甲醇、乙腈和磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

忍冬藤[4－5]：取本品10 mL，水浴蒸干至2 ～3 mL，加甲醇3 mL，超聲處理（功率為100 W，頻率為40 kHz）10 min，離心5 min（3 500 r／min），取上清液，蒸干至2 mL，加硅膠粉5 g，混勻，置水浴鍋蒸干，加于裝有2 g 硅膠的G 柱（15 g，內(nèi)徑為1.5 ～2.0 cm），取三氯甲烷－甲醇－水（65 ∶35 ∶10，V／ V／ V）10 ℃放置的下層溶液50 mL作為流動相洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加2 mL 50%甲醇溶解，作為供試品溶液；按處方制備缺忍冬藤的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液；另取馬錢苷對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。照2015 年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB 中TLC 法試驗，分別吸取供試品、陰性對照品溶液各10 μL，對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（65 ∶35 ∶10，V／ V／ V）10 ℃放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置可見光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，詳見圖1 A。

防風[4，6]：取本品20 mL，加丙酮40 mL，混勻，過濾，濾液水浴蒸至2 mL，加入5 g 硅膠G，混勻，置水浴鍋蒸干，加于裝有2 g 硅膠G 的硅膠G 柱（15 g，內(nèi)徑為1.5 ～2 cm）上，取三氯甲烷－甲醇（4 ∶1，V／ V）混合溶液50 mL 作為流動相洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘渣加乙醇2 mL 使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝制備缺忍冬藤的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液；取5 － O－甲基維斯阿米醇苷對照品適量，加乙醇制成每1 mL 含1 mg 的對照品溶液。照2015年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB 中TLC 法試驗，吸取上述3 種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷－甲醇（4 ∶1，V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，詳見圖1 B。炙甘草[4]：取本品10 mL，加水飽和正丁醇溶液20 mL，萃取2 次，合并正丁醇溶液，水浴蒸干，殘渣加2 mL乙醇溶解，作為供試品溶液；按處方工藝制備缺炙甘草的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液；另取甘草苷對照品，加乙醇制成每1 mL 含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照2015 年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB 中TLC 法試驗，分別吸取上述3 種溶液各2 μL，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水（15 ∶1 ∶1 ∶2，V／ V／ V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，詳見圖1 C。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1mm，1.7 μm）；流動相：乙腈(A) －0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫，0 ～3 min 時10% A，3 ～8 min 時10% ～20%A，8 ～15 min 時 20% ～25%A， 15 ～18 min 時 25% ～100%A；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL ／ min；檢測波長：232 nm；進樣量：1 μL。

2.2.2 溶液制備

圖1 薄層色譜圖

圖2 超高效液相色譜圖

取原兒茶醛、馬錢苷和5－ O－甲基維斯阿米醇苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含原兒茶醛14.28 μg／mL、馬 錢 苷61.6 μg ／ mL、5 － O － 甲 基 維 斯 阿 米 醇 苷22.2 μg／mL 的混合對照品溶液。精密量取樣品2 mL，置10mL 容量瓶中，加甲醇定容，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。按處方工藝分別制備缺丹參、缺忍冬藤和缺防風的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2 項下3 種溶液各1 μL，分別注入超高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進行測定，結(jié)果原兒茶醛、馬錢苷和5 － O－甲基維斯阿米醇苷的色譜峰與其他色譜峰分離良好，且陰性對照無干擾峰，色譜圖見圖2。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取混合對照品溶液0.2，0.5，0.8，1.1，1.4，1.7，2.0 μL 注入超高效液相色譜儀中，測定峰面積，以進樣量（X，μg）為橫縱坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得原兒茶醛、馬錢苷和5 － O －甲基維斯阿米醇苷的回歸方程分別為Y原＝18 496 X原－8 729（r ＝0.999 9），Y馬＝5 507 X馬－9 011（r ＝0.999 9）和Y甲＝9 022 X甲－5 258（r ＝0.999 9）。結(jié)果原兒茶醛、馬錢苷和5 － O －甲基維斯阿米醇苷進樣量分別在2.86 ～28.56 μg，12.32 ～123.20 μg，4.44 ～44.40 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r ＝0.999 9）。

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液1 μL，依法測定，重復(fù)進樣6 次。結(jié)果原兒茶醛、馬錢苷和5 － O－甲基維斯阿米醇苷對照品峰面積的 RSD 分別為1.33%，1.69%，1.66%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12h時進樣1 μL，依法測定。結(jié)果原兒茶醛、馬錢苷和5－ O－甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD 分別為1.19%，1.19%，1.50%（n ＝7），表明供試品溶液在12h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密吸取同一批（批號為181127）樣品6 份，依法制備供試品溶液，平行測定。結(jié)果原兒茶醛、馬錢苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD 分別為2.96%，3.41%，2.87%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密吸取已知含量的樣品（批號為181127）6 份，每份1 mL，分別精密加入原兒茶醛、馬錢苷和5－ O－甲基維斯阿米醇苷對照品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n ＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取祛風消癜合劑3 批，依法制備供試品溶液，每批樣品平行制備2 份，再按擬訂色譜條件測定含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg ／mL，n ＝2）

3 討論

3.1 薄層鑒別樣品制備方法優(yōu)化

祛風消癜合劑方中藥味多，成分復(fù)雜。在進行忍冬藤的薄層鑒別時，參考文獻[7]，分別采用水飽和正丁醇萃取、藥液蒸干50%甲醇水溶解及乙酸乙酯萃取3 種制備方法，結(jié)果各斑點分離效果均不理想，雜質(zhì)干擾嚴重，最終采用以三氯甲烷－甲醇－水（65 ∶35 ∶10，V／V／ V）10 ℃放置的下層溶液為流動相，過硅膠G 柱洗脫的制備方法去除雜質(zhì)，結(jié)果色譜峰分離度較好，且陰性對照無干擾。在進行防風的薄層鑒別時[8－9]，分別采用丙酮除雜法、水飽和正丁醇萃取法和乙酸乙酯萃取法制備供試品溶液，結(jié)果以上方法均不能有效除雜，經(jīng)進一步試驗，最終先采用丙酮除去部分雜質(zhì)，再用三氯甲烷－甲醇（4 ∶1，V／ V）混合溶液50 mL 為流動相，過硅膠G柱洗脫進一步除雜，制備的供試品溶液薄層色譜分離度良好，且陰性對照無干擾。

3.2 供試品提取方法和色譜條件考察

考察了50%甲醇、70%甲醇、甲醇及超聲處理15，30，45 min 的提取效果[10－11]，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲處理30 min最好。采用210 ～400 nm 波長范圍內(nèi)紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長原兒茶醛在230 nm，馬錢苷在237 nm，5 － O －甲基維斯阿米醇苷在232 nm，綜合考慮，最終確定檢測波長為232 nm。查閱文獻[12－15]，考察了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－0.1%磷酸水溶液和乙腈－0.2%磷酸水溶液多種流動相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，以乙腈－0.2%磷酸水溶液為流動相時色譜峰峰形對稱良好，樣品峰與雜質(zhì)峰能達到基線分離，故選擇其為流動相。

3.3 指標成分確定

祛風消癜合劑處方中君藥忍冬藤有清熱解毒、疏風通絡(luò)功效，以及抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用[16]，其主要活性成分為馬錢苷，具有增強機體免疫功能及抗炎等作用；臣藥防風具有祛風解表、勝濕止痛、止痙的功效，色原酮是其主要的活性成分，現(xiàn)代藥理學研究表明，5 －O －甲基維斯阿米醇苷具有良好的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎及抗血小板凝聚作用[17]；佐藥丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消痛功效，其主要藥效成分是脂溶性二萜類和酚酸類成分，酚酸類具有心腦血管活性、抗腫瘤活性、抗氧化活性等多種藥理活性[18]，因樣品中未檢測到丹參酮ⅡA成分，且丹酚酸B 有陰性干擾，故選擇原兒茶醛為含量檢測指標。綜合考慮，最終確定對祛風消癜合劑中的馬錢苷、5 － O －甲基維斯阿米醇苷和原兒茶醛進行含量測定。

3.4 方法評價

本試驗中建立了祛風消癜合劑的TLC 法和原兒茶醛、馬錢苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷的含量測定方法，該方法準確可靠、重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。