響應(yīng)面法優(yōu)化杠板歸總黃酮微波提取工藝

黃道明，黃 平，沈麗霞

（1. 江西省上饒市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 上饒 334000； 2. 江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，江西 上饒 334000；3. 中國(guó)人民解放軍第971 醫(yī)院，山東 青島 266072）

杠板歸又稱貫葉蓼、犁頭藤等，是蓼科植物杠板歸Polygonum perfoliatum L. 的干燥地上部分，夏季開花時(shí)采收，曬干而成，在全國(guó)各地均有分布。杠板歸具有清熱解毒、利水消腫、止咳的功效，主治咽喉腫痛、肺熱咳嗽、小兒頓咳、水腫尿少、濕熱瀉痢、濕疹、癤腫、蛇蟲咬傷等[1－2]。黃酮類化合物是杠板歸的有效成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗心律失常等作用[3－5]。目前，杠板歸中總黃酮的提取工藝主要通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，尚未見通過響應(yīng)面法優(yōu)化的研究報(bào)道。響應(yīng)面法是應(yīng)用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，可通過回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法[6－7]。本研究中采用響應(yīng)面法對(duì)微波提取杠板歸總黃酮的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為杠板歸藥材的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV － 2100 型分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；CW － 2008 型微波提取儀器（上海松野儀器有限公司）；SB － 2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞龍儀器有限公司）；101AB － 2 型真空泵（上海神光儀器有限公司）。

1.2 試藥

杠板歸干燥藥材，購自江西新東港中藥飲片有限公司，經(jīng)江西上饒市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室付彩群中藥師鑒定為正品，干燥，粉碎，過60 目篩，備用；蘆丁對(duì)照品（純度為98.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；其余試劑均為分析純；試驗(yàn)用水均為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 杠板歸總黃酮提取工藝流程

取干燥后的杠板歸粉末樣品10 g，精密稱定，在100 mL 圓底燒瓶中加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，在擬訂試驗(yàn)條件下（提取時(shí)間、提取功率、液料比和乙醇濃度等），采用間歇微波輔助提取法（30 s，放置1 min）提取杠板歸中總黃酮。樣品在一定微波功率下提取設(shè)定的時(shí)間后，經(jīng)過濾分離，低速離心10 min，取上清液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃減壓濃縮，再定容于10 mL 容量瓶，經(jīng)

0.45 μm 微孔濾膜濾過，備用。精密吸取各供試品溶液10μL，按上述擬訂條件測(cè)定峰面積，以回歸方程計(jì)算含量。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作與黃酮得率計(jì)算

取經(jīng)干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.0 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加入乙醇溶液定容，即得蘆丁對(duì)照品溶液。分別精密吸取1，2，3，4，5，6，7 mL，置25 mL容量瓶中，各加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min后分別加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min 后分別加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，最后用65%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min；以空白試劑為參比液，在500 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，mg／mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝7.9561X＋0.0068，r ＝0.9995(n ＝7)。根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮濃度，并計(jì)算總黃酮得率。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素考察：通過單因素法，對(duì)不同提取時(shí)間（10，15，20，25，30 min），不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（40% ，50% ，60% ，70%，80%），不同提取溫度（40，50，60，70，80 ℃），不同液料比（40 ∶1，45 ∶1，50 ∶1，55 ∶1，60 ∶1）進(jìn)行考察。結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取時(shí)間、溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)杠板歸總黃酮得率的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法，以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）和液料比（D）4 個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素取3 個(gè)水平，以杠板歸總黃酮得率為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)分析。因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表

數(shù)據(jù)分析：采用統(tǒng)計(jì)軟件Design－Expert 對(duì)表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得總黃酮得率對(duì)編碼自變量A，B，C，D 的回歸方程：Y ＝5.65 ＋0.31 A－8.333 E －003 B － 0.048 C ＋0.060 D － 0.013 AB ＋0.065 AC －0.045 AD －0.042 BC －0.030 BD ＋0.03 CD－0.52 A2－0.30B2－0.25C2－0.32 D2。該模型回歸顯著（P ＜0.000 1），模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)（r）＝0.998 2，表明該回歸方程回歸效果較好，試驗(yàn)誤差較小。模型的校正決定系數(shù)（R2adj）＝0.995 3，表明該模型可信度較高。失擬項(xiàng)P ＞0.05，表明該模型失擬不顯著，說明該回歸方程能較好地?cái)M合真實(shí)的效應(yīng)面，證實(shí)應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化杠板歸總黃酮提取率可行。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

響應(yīng)面分析：通過多元回歸方程作響應(yīng)面圖（見圖2 至圖7），可較直觀地反映各因素間的交互作用。

最佳提取條件確定：通過軟件Design－Expert 分析得出杠板歸總黃酮最佳提取工藝為提取溫度62.91 ℃，提取時(shí)間18.96 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)59.49%和液料比50.36?？紤]到實(shí)際操作因素，將測(cè)定條件修正為提取溫度60 ℃，提取時(shí)間20 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%和液料比50 ∶1。

驗(yàn)證試驗(yàn)：為檢驗(yàn)效應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述修正條件進(jìn)行杠板歸總黃酮的微波提取試驗(yàn)，得到杠板歸總黃酮平均得率為5.69%（n ＝3），與理論預(yù)測(cè)值5.67%非常接近。因此，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化杠板歸總黃酮的提取工藝參數(shù)真實(shí)、可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 討論

3.1 提取方法選擇

杠板歸的主要有效成分為黃酮類化合物，傳統(tǒng)回流提取法存在溶劑消耗量大、提取效率低、提取時(shí)間長(zhǎng)及污染環(huán)境等缺點(diǎn)，本研究中選擇微波提取法提取杠板歸總黃酮，并對(duì)提取工藝進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，以更大程度地利用該藥材[8]。

圖2 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)提取物中總黃酮得率的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖3 提取溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取物中總黃酮得率的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖4 提取溫度與液料比對(duì)提取物中總黃酮得率的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間對(duì)提取物中總黃酮得率的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖6 提取時(shí)間與液料比對(duì)提取物中總黃酮得率的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比對(duì)提取物中總黃酮得率的響應(yīng)曲面及等高線圖

3.2 考察因素選擇

通過正交試驗(yàn)法對(duì)不同提取工藝進(jìn)行比較，結(jié)果表明，提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度等因素對(duì)杠板歸總黃酮的提取均有影響，且乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間影響最顯著。故本研究中選擇提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度4 個(gè)因素為考察因素[9]。

3.3 優(yōu)化方法選擇

當(dāng)前，藥材有效成分的提取工藝研究多為正交試驗(yàn)，其結(jié)果直觀易分析，但得到的優(yōu)選值只是試驗(yàn)所用水平的某一種組合，具有局限性。與其相比，響應(yīng)面法能更好地解釋多因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，特別是因素之間存在的交互作用。響應(yīng)面法是將一系列的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用多項(xiàng)式進(jìn)行擬合，得出回歸方程，然后將函數(shù)以圖形的方式表現(xiàn)出來，更能直觀地分析出各個(gè)因素與響應(yīng)面之間的關(guān)系及因素之間的交互關(guān)系。故本試驗(yàn)中選擇響應(yīng)面法優(yōu)化杠板歸總黃酮的提取工藝[10－11]。

3.4 方法評(píng)價(jià)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，本研究中首次采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，對(duì)微波提取杠板歸總黃酮的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了回歸模型。此模型極顯著，模型的r ＝0.998 2，R2adj＝0.995 3，失擬項(xiàng)不顯著，可用于杠板歸總黃酮提取工藝分析和預(yù)測(cè)。優(yōu)化后確定的杠板歸總黃酮最佳提取工藝條件為提取溫度60 ℃，提取時(shí)間20 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%和液料比50 ∶1。該方法工藝簡(jiǎn)單，提取率較高，且省時(shí)、節(jié)能、提取效率高，可為杠板歸資源的綜合利用奠定基礎(chǔ)。