高效液相色譜法測定飲料及發(fā)酵酒中紐甜含量

田衛(wèi)政

摘 要：本文建立了準確、快速檢測飲料及發(fā)酵酒中紐甜含量的高效液相色譜方法。選用有代表性的果汁（漿）類飲料、發(fā)酵酒、風味飲料、含乳飲料及植物蛋白飲料共5種基質(zhì)，用混合提取液提取，定容后過濾上機測試，蛋白含量較高的樣品在提取后中加入蛋白沉淀劑凈化后定容過濾待上機測試。選用Shimadzu VP-ODS（4.6 mm×150 mm，4.6 μm）色譜柱，218 nm檢測波長，進樣量20 μL，離子對試劑和乙腈為混合流動相，用優(yōu)化后的色譜梯度條件進行洗脫。結(jié)果顯示，紐甜在0.206～103.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。精密度實驗相對標準偏差為0.38%。在1.03～103 mg·L-1加標水平下，回收率在98.7%～108.1%，相對標準偏差為1.7%～4.5%。方法定量限為0.3 mg·kg-1。試驗結(jié)果顯示優(yōu)化后的方法能夠準確定量飲料類樣品及發(fā)酵酒中紐甜含量。

關鍵詞：紐甜;飲料;發(fā)酵酒;快速檢測

Abstract：In order to detect neotame content in different types of beverages and fermentation wine by HPLC rapidly and accurately， the optimized testing method was built in this paper. Fruit juice， fermentation wine， flavor drink， young drink and vegetable protein drink were chosen as experiment materials. After being extracted by solution and filtrated， the sample solutions were ready for testing by HPLC. Samples with high protein content were added with protein precipitator and the other processing steps were same as the previous item. Shimadzu VP-ODS （4.6 mm×150 mm， 4.6 μm） was selected as chromatographic column， acetonitrile and ion pair solution were selected as moving phase to test sample solutionsaccording to the optimizedelution procedureat 218 nm wave length. And the injection volume was 20μL. Results showed that the linearity of neotame between 0.206 μg·mL-1 and 103.0 μg·mL-1 accorded with the standard code. RSD of accuracy was 0.38%. Recovery rate was between 98.7% and 108.1% within the scope of 1.03～103 mg·L-1 while RSD of recovery rate was between 1.7% and 4.5%. Limit of quantitation was 0.3 mg·kg-1. The evaluation indexes showed the optimized testing method meet the detection requirements.

Key words：Neotame; Beverage; Fermentation wine; Rapid detection

食品添加劑是現(xiàn)代食品工業(yè)發(fā)展的產(chǎn)物。食品添加劑的發(fā)展對拓展食品種類、保持食品品質(zhì)、延長貨架期有重要影響。食品的風味由色、香、味、形（質(zhì)構）等構成。甜味是各類食品風味的基礎，具有協(xié)調(diào)調(diào)整平衡風味、掩蔽異味、增強口感的重要作用[1]。因此甜味劑是食品添加劑中的重要的分支。根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》規(guī)定管理的甜味劑，分為天然甜味劑和人工合成的甜味劑[2]。其中天然甜味劑包括蔗糖、葡萄糖、糖醇為主的糖的衍生物和非糖類天然甜味劑。人工合成甜味劑是指采用化學合成及改性等方法得到的各類人工甜味劑。如糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜等[3]。

紐甜學名為N-[N-（3，3-二甲基丁基）]-L-α-天門冬氨-L-苯丙氨酸1-甲酯，是一種功能性甜味劑。甜度為蔗糖的8 000倍，甜蜜素的300倍，阿斯巴甜的40倍。能量值幾乎為零。甜味純正和諧，沒有苦味及其他后味。紐甜在體內(nèi)代謝后形成脫酯化的紐甜和微量甲醇，其代謝物在血液中存留時間較短，最后從糞便和尿液排出體外。穩(wěn)定的性狀和安全性使得紐甜在食品加工行業(yè)應用越來越廣泛，尤其以飲料中應用較為普遍。紐甜的國家標準檢測方法是樣品提取后經(jīng)固相萃取等前處理對樣品進行凈化，過程較為復雜繁瑣，不利于批量檢測[4]。目前紐甜含量的測定主要是應用高效液相色譜法，通過特征吸收波長下的吸光度計算濃度[5-9]。本研究對樣品前處理以及液相梯度洗脫程序進行優(yōu)化，旨在獲取一套應用于飲料類產(chǎn)品及發(fā)酵酒產(chǎn)品簡單易操作的紐甜檢測方法，為紐甜批量化樣品的快速檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑及儀器

1.1.1 材料及主要試劑

A：果汁類、B：發(fā)酵酒、C：風味飲料、D：含乳飲料、F：植物蛋白飲料，共5種（均為市售）;紐甜標準品C20H30N2O5，CAS號：165450-17-9、純度100.0%（上海安譜實驗科技股份有限公司）;辛烷磺酸鈉（色譜純）。

1.1.2 儀器

分析天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司];離心機（賽默飛世爾科技有限公司）;渦旋振蕩器（賽默飛世爾科技有限公司）;超聲機（上?？茖С晝x器有限公司）;配有二級管陣列檢測器的高效液相色譜儀（島津儀器設備有限公司）

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

（1）混合提取液。分別吸取0.8 mL、2.5 mL三乙胺，用水定容至1 000 mL，pH約為4.5。

（2）離子對試劑緩沖液。稱取2.00 g辛烷磺酸鈉，用500 mL超純水溶解，加入1.0mL磷酸，加水定容至1 000 mL。

（3）亞鐵氰化鉀（92 g·L-1）。稱取10.6 g亞鐵氰化鉀[K4Fe（CN）6·3H2O]，加入適量水溶解，用水定容至100 mL。

（4）乙酸鋅溶液（183 g·L-1）。稱取22 g乙酸鋅[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加入3 mL冰乙酸，用水定容至100 mL。

1.2.2 標準曲線配制

（1）紐甜標準儲備液配制。稱取紐甜標準品100.30 mg（純度為100.0%）至10 mL容量瓶中，用混合提取液定容，紐甜含量為10.30 mg·mL-1。

（2）紐甜標準曲線配制。吸取1 mL紐甜標準儲備液至10 mL容量瓶中，用混合提取液定容，得紐甜含量為1.030 mg·mL-1的標準中間液。吸取標準中間液2、50、100、500 μL和1 000 μL，用上述混合提取液定容至10 mL，配制成濃度為0.206、5.15、10.30、51.5 μg·mL-1和103.0 μg·mL-1的系列工作溶液。

1.2.3 樣品提取及凈化

（1）果汁（漿）類飲料及風味飲料。吸取試樣10 mL于50 mL具塞塑料離心管中，加入20 mL混合提取液，渦旋振蕩10 min，水浴超聲30 min，4 000 r·min-1離心8 min后上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用混合提取液定容?；靹蚝筮^0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

（2）發(fā)酵酒。將樣品超聲20min除去氣泡。吸取試樣10 mL于50 mL具塞塑料離心管中，加入20 mL混合提取液，渦旋振蕩10 min，水浴超聲30 min，4 000 r·min-1離心8 min后上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用混合提取液定容。混勻后過0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

（3）含乳飲料及植物蛋白飲料。吸取試樣10 mL于50 mL具塞塑料離心管中，加入20 mL混合提取液，渦旋振蕩10 min，水浴超聲30 min，加入蛋白沉淀劑亞鐵氰化鉀溶液（92 g·L-1）2 mL和乙酸鋅溶液（183 g·L-1）2 mL，混勻，將樣品在4 000 r·min-1離心8 min，取上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，于固體殘渣中加入提取液20 mL，渦旋振蕩后超聲10 min，于4 000 r·min-1離心8 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，并用混合提取液定容至刻度，混勻后過0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

1.2.4 色譜條件選擇

色譜柱：Shimadzu VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，4.6 μm）;二極管陣列檢測器檢測波長218 nm;進樣量20 μL;流速1.5 mL·min-1。

流動相：A相為乙腈;B相為離子對緩沖溶液。通過調(diào)整兩項洗脫條件，獲取良好的峰形和基線分離，見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 紐甜檢測波長

利用二極管陣列檢測器（PDA）對紐甜標準品溶液在波長190～300 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，在190～205 nm范圍內(nèi)，隨著波長增加，紐甜含量下降迅速，在205～300 nm波長范圍內(nèi)，以218 nm檢測波長下，響應最高見圖1。由于200 nm以下的光可以被溶劑（如水，有機溶劑等）強烈吸收，測試結(jié)果誤差很大，不能應用于檢測。因此，選定218 nm作為紐甜的檢測波長。

2.2 校準曲線

紐甜校準曲線如圖2。紐甜標準品的回歸方程為Y=4 090.16X+5 076.00，結(jié)果表明紐甜在0.206～103.0 μg·mL-1線性關系良好，相關系數(shù)r為0.999 95。

為果汁（漿）類、風味飲料、含乳飲料、植物蛋白飲料等飲料類及發(fā)酵酒樣品準確定量提供依據(jù)。

2.3 精密度試驗

取濃度為5.15 μg·mL-1的紐甜標準溶液，重復進樣6次。通過計算目標峰峰面積RSD評定方法精密度。紐甜標準品色譜圖如圖3，精密度結(jié)果如表2。由圖3知，目標化合物紐甜在6.75 min出峰，峰形對稱，接近高斯分布。由表2知，該方法峰面積相對偏差RSD為0.38%，該方法精密度符合檢測標準要求。標準品平均濃度為5.09 μg·mL-1，擬合度為98.8%，得出該方法有較高準確度。

2.4 方法定量限

根據(jù)儀器噪音的10倍確定定量限。對儀器信號值平行測定20次的信號強度，紐甜的定量限為0.3 mg·kg-1。

2.5 樣品測定

取上述5類飲料樣品，分別編號A：果汁、B：發(fā)酵酒、C：風味飲料、D：含乳飲料、E：植物蛋白飲料，每種樣品按照本文優(yōu)化的方法進行提取純化處理后上機測試，結(jié)果如表3。

2.6 回收率試驗

準確量取10.0 mL試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入濃度為103.0 μg·mL-1的紐甜標準品工作液100 μL作為J-1組加標樣品;加入濃度為1.030 mg·mL-1的紐甜標準中間液100 μL作為J-2組加標樣品;加入濃度為10.30 mg·mL-1標準儲備液100 μL作為即J-3組加標樣品，按照優(yōu)化過的樣品處理方法每個加標濃度平行處理6份上機測試。

2.6.1 果汁及風味飲料3水平加標結(jié)果

果汁加標色譜圖見圖4，風味飲料加標色譜圖見圖5;果汁及風味飲料回收率見表4。由圖4看出，果汁基質(zhì)中的紐甜峰形對稱，基線分離度高。由圖5看出，風味飲料基質(zhì)中的紐甜峰形對稱，基線分離度高。由表4看出，果汁基質(zhì)加標回收率在100.2%～103.7%;回收率相對偏差RSD在1.7%～3.3%范圍;風味飲料基質(zhì)加標回收率在98.7%～104.9%，回收率相對偏差RSD在1.9%～2.2%?；厥章屎拖鄬藴势罹螱B/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》[10]。優(yōu)化后的方法能夠準確定量果汁基質(zhì)和風味飲料基質(zhì)中紐甜含量。

2.6.2 發(fā)酵酒3水平加標結(jié)果

發(fā)酵酒3水平加標結(jié)果，發(fā)酵酒加標樣品色譜圖見圖6，回收率見表5。由圖6知，發(fā)酵酒基質(zhì)中的紐甜峰形對稱，基線分離度高。由表5知，發(fā)酵酒基質(zhì)加標回收率在99.9%～105.8%;回收率相對偏差RSD=2.8%～3.4%。回收率和相對標準偏差均符合GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》。優(yōu)化后的方法能夠準確定量發(fā)酵酒基質(zhì)中紐甜含量。

2.6.3 含乳飲料及植物蛋白飲料3水平加標結(jié)果

含乳飲料加標色譜圖見圖7，植物蛋白飲料加標色譜圖見圖8。含乳飲料及植物蛋白飲料回收率見表6。由圖7知，含乳飲料基質(zhì)中的紐甜峰形對稱，基線分離度高。由圖8知，植物蛋白飲料基質(zhì)中的紐甜峰形對稱，基線分離度高。由表6知，含乳飲料基質(zhì)加標回收率在100.3%～104.4%;回收率相對偏差RSD=2.6%～3.7%。植物蛋白飲料基質(zhì)加標回收在98.8%～108.1%;回收率相對偏差在2.5%～4.5%。含乳飲料和植物蛋白飲料回收率和相對標準偏差均符合GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》。優(yōu)化后的方法能夠準確定量含乳飲料基質(zhì)和植物蛋白飲料基質(zhì)中紐甜含量。

3 結(jié)論

紐甜在飲料基質(zhì)中穩(wěn)定性良好，且由于其甜度高、安全性好、不會造成齲齒等優(yōu)異特性，使其在飲料中的應用越來越廣泛[11]。為增強檢測結(jié)果準確性、提高檢測效率及降低檢測成本，本實驗通過對4種有代表性的飲料類樣品和發(fā)酵酒類樣品進行方法學驗證，此方法在0.206～103.0μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。精密度實驗相對標準偏差RSD=0.38%。通過對試驗樣品基質(zhì)進行3水平6平行的加標回收實驗得出，其在1.03 mg·L-1水平加標回收率在101%～104.9%，相對標準偏差在2.1%～3.8%;10.3 mg·L-1水平加標回收率在102.1%～108.1%，相對標準偏差在1.9%～4.5%;103 mg·L-1水平（飲料類限量）加標回收率在98.7%～100.3%，相對標準偏差在1.7%～2.9%。優(yōu)化后的樣品前處理及液相梯度洗脫條件能夠?qū)崿F(xiàn)對飲料類樣品和發(fā)酵酒類樣品的準確定量。

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