9種唇形科芳香植物揮發(fā)性萜類成分的比較分析

朱小潔 周翔宇 范 航 高喜鳳 楊 蕾*

(1.上海辰山植物園，中國科學院上海辰山植物科學研究中心，上海市資源植物功能基因組學重點實驗室，上海 201602； 2.上海師范大學生命科學學院，上海 200234； 3.中國科學院上海生命科學研究院，中國科學院上海植物逆境生物學研究中心，上海 201602)

圖1 9種唇形科芳香植物 A.百里香；B.鳳梨鼠尾草；C.藿香；D.美國薄荷；E.迷迭香；F.南歐丹參；G.牛至；H.香蜂花；I.藥用鼠尾草Fig.1 Nine species of aromatic plants of Lamiaceae A.T.mongolicus Ronn.; B.S.elegans Vahl.; C.A.rugosa(Fisch.et Mey.) O.Kuntze.; D.M.didyma L.; E.R.officinalis L.; F.S.sclarea L.; G.O.vulgare L.; H.M.officinalis L.; I.S.officinalis L.

揮發(fā)性萜類普遍存在于植物防御反應中，因其具有抗氧化和抗菌的功能，可保護植物免受病菌的侵害，同時揮發(fā)性萜類也可通過吸引害蟲的天敵實現(xiàn)間接防御反應[1]。此外，揮發(fā)性萜類還可以通過增強花和果實的香味吸引動物促進植物的授粉和種子傳播。芳香植物，含有大量的揮發(fā)性萜類成分，因此被廣泛用于食品、化妝品、醫(yī)藥、保健及風景園林等各個行業(yè)[2～5]。

目前全世界已報道的芳香植物約有3 600余種，但其中僅有300種被開發(fā)[6]，因此，如何更好地開發(fā)和利用芳香植物是一項具有重大經(jīng)濟效益的研究內(nèi)容。唇形科是芳香植物聚集的一個大科[7]，許多常見的芳香植物，如百里香(ThymusmongolicusRonn.)、鳳梨鼠尾草(SalviaelegansVahl.)、藿香(Agastacherugosa(Fisch. et Mey.) O.Kuntze.)、美國薄荷(MonardadidymaL.)、迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)、南歐丹參(SalviasclareaL.)、牛至(OriganumvulgareL.)、香蜂花(MelissaofficinalisL.)和藥用鼠尾草(SalviaofficinalisL.)均屬于唇形科(見圖1)。芳香植物除了被廣泛用作食品調(diào)料外，在臨床上也可用于治療多種疾病，如百里香具有抗菌、鎮(zhèn)咳和祛痰的功效[8]；牛至常用于解表、理氣和化濕[9～10]；藿香被用于治療消化不良、皮膚真菌感染等疾病[11～12]；迷迭香在降低心臟和大腦的脂質(zhì)過氧化[13]、預防和治療癌癥[14]、抑郁[15]等均有應用。

揮發(fā)性萜類是芳香植物重要的次生代謝產(chǎn)物，來源于兩條相對獨立的生物合成途徑，這兩條途徑分別是定位于質(zhì)體的甲基赤蘚醇-4-磷酸(MEP)途徑和定位于胞質(zhì)的甲羥戊酸(MVA)途徑，其中單萜類化合物主要來源于MEP途徑，倍半萜類化合物主要來源于MVA途徑[16]。以往對芳香植物的研究多集中在精油成分的鑒定、抑菌、抗氧化等活性方面，以及揮發(fā)性萜類成分的分類比較研究，而對物種間代謝合成的比較研究較少。本研究以9種唇形科芳香植物葉片為材料，采用GC-MS的方法測定各植物葉片揮發(fā)性萜類成分，通過對揮發(fā)性萜類的多角度比較分析，不僅為芳香植物的高效利用、合理開發(fā)提供參考，還為植物萜類的代謝研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

百里香(ThymusmongolicusRonn)、鳳梨鼠尾草(SalviaelegansVahl)、藿香(Agastacherugosa(Fisch.et Mey.) O.Ktze.)、美國薄荷(MonardadidymaL.)、迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)、南歐丹參(SalviasclareaL.)、牛至(OriganumvulgareL.)、香蜂花(MelissaofficinalisL.)和藥用鼠尾草(SalviaofficinalisL.)等植物材料培養(yǎng)于上海辰山植物園園藝苗圃，植物長勢良好、無病蟲害。GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀(7890A-5975C，美國安捷倫公司)；HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，安捷倫科技公司)；BSA 224S型分析天平，賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司。實驗所用正己烷和乙酸壬酯購于Sigma-Aldrich公司，C7～C40正構(gòu)烷購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 9種芳香植物揮發(fā)性萜類的提取

分別取9種芳香植物的新鮮葉片，切成小塊后，在液氮中研磨成粉末，精確稱取0.3 g于2 mL離心管中，加入1 mL正己烷(含有10 ng·μL-1的乙酸壬酯)，將樣品粉末過夜浸提，每種植物設(shè)置3個生物學重復。提取后的樣品以12 000 r·min-1離心10 min，過濾收集上清液用于GC-MS檢測。

1.3 9種芳香植物揮發(fā)性萜類的GC-MS分析

采用安捷倫7890A氣相色譜儀和安捷倫5973A聯(lián)用質(zhì)譜儀。在毛細管柱HP-5MS上分離，升溫程序：起始溫度60℃保留2 min，以10℃·min-1升溫到260℃，保留10 min。載氣為高純氦氣(99.99%)，流速為1 mL·min-1，無分流進樣。電離方式EI，設(shè)定離子源溫度為230℃，四級桿溫度為150℃，電子能量70 eV，掃描范圍(m/z)50～550。

1.4 保留指數(shù)RI值的測定

取正構(gòu)烷烴混合對照品，按照1.3實驗條件分析，記錄每個正構(gòu)烷烴的出峰時間，采用保留指數(shù)的線性升溫公式計算各組分的RI值，計算公式為：

RI=100Z+100[RT(x)-RT(z)]/[RT(z+1)-RT(z)]

(1)

式中：RT(x)，RT(z)，RT(z+1)分別代表組分及碳數(shù)為z，z+1正構(gòu)烷的保留時間，且RT(z)

1.5 統(tǒng)計與分析

本實驗采用3個生物學重復，結(jié)果以平均值±標準差呈現(xiàn)，P<0.05被認為是具有顯著性差異，數(shù)據(jù)分析在SPSS 19.0軟件上進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 9種芳香植物葉片揮發(fā)性萜類成分的分析

9種芳香植物葉片共檢測到77種揮發(fā)性萜類物質(zhì)(見表1)，使用NIST(National Institute of Standards and Technology)數(shù)據(jù)庫，依據(jù)質(zhì)譜特征和保留指數(shù)并結(jié)合相關(guān)文獻，對9種植物各揮發(fā)性萜類成分進行定性分析[17]，以乙酸壬酯作為對照品，對揮發(fā)性萜類成分進行定量分析。將揮發(fā)性萜類根據(jù)含有的異戊二烯單元的數(shù)目及是否含氧分為4大類：單萜化合物17種、單萜氧化物28種、倍半萜化合物22種，以及倍半萜氧化物10種。其中藿香含有的種類最多(46種)，其次是迷迭香(35種)、百里香(33種)、藥用鼠尾草(33種)和美國薄荷(31種)；牛至(29種)中也含有豐富的種類；鳳梨鼠尾草(18種)、香蜂花(13種)和南歐丹參(9種)中種類相對較少。

我們共檢測到24種萜類物質(zhì)是特異存在于單一植物中(見表1)。其中藿香和迷迭香中特異性萜類種數(shù)最多，都為7種，而南歐丹參和牛至中沒有其物種特異的萜類。百里香中特異存在反式-α-香柑油烯，在部分文獻中沒有檢測到該物質(zhì)[18～19]；鳳梨鼠尾草中特異存在別香橙烯和Bicyclogermacrene，但含量較低；藿香中特異存在檸檬烯、順式氧化檸檬烯、(-)-(E)-氧化檸檬烯、(+)-二氫香芹酮、葛縷醇、反式氧化香芹酮和優(yōu)葛縷酮，其中檸檬烯在不同產(chǎn)地藿香中均有報道[20～22]，而其他成分未見報道；反式-橙花叔醇特異存在于美國薄荷中，但在部分文獻中未見報道[23～24]；迷迭香中有7種特異存在的化合物，分別是3-蒈烯、龍腦烯醛、異胡薄荷醇、馬鞭草烯酮、香茅醇、β-姜黃烯和α-紅沒藥醇，其中異胡薄荷醇、香茅醇在滇產(chǎn)迷迭香中有報道[25]，3-蒈烯、馬鞭草烯酮、α-紅沒藥醇也被檢測到[26]，而龍腦烯醛、β-姜黃烯并未見報道；trans-Chrysanthemal、橙花醇和檸檬醛特異存在于香蜂花，其中檸檬醛在香蜂花中普遍存在且含量極高[27～28]，因此可以作為鑒定香蜂花品質(zhì)的標志化合物；側(cè)柏酮、喇叭菜萜醇、葎草烯環(huán)氧化物Ⅱ特異存在于藥用鼠尾草中，與目前已報道的藥用鼠尾草的檢測成分一致，但并不是所有報道的藥用鼠尾草均顯示同時存在這3種成分，大部分的藥用鼠尾草均含有側(cè)柏酮，部分藥用鼠尾草檢測到喇叭菜萜醇或葎草烯環(huán)氧化物Ⅱ[29]。

表1 9種芳香植物揮發(fā)性萜類成分

續(xù)表1 Continued table 1

化學成分Component分子式Formula分子量Molecule保留指數(shù)Relentin index百里香T.mongolicus鳳梨鼠尾草S.elegans藿香A.rugosa美國薄荷M.didyma迷迭香R.officinalis南歐丹參S.sclarea牛至O.vulgare香蜂花M.officinalis藥用鼠尾草S.officinalis(+)-二氫香芹酮 DihydrocarvoneC10H16O1521199--+*------馬鞭草烯酮VerbenoneC10H14O1501215----+*----反式—葛縷醇trans-CarveolC10H16O1521220--+++---+香茅醇CitronellolC10H20O1561225----+*----橙花醇NerolC10H18O1541227-------+*-葛縷醇CarveolC10H16O1521232--+*-----+右旋香芹酮D-CarvoneC10H14O1501248--+-+---+香葉醇GeraniolC10H18O1541252----+--+-百里醌ThymoquinoneC10H12O21641254+--+-----反式氧化香芹酮 trans-Carvone oxideC10H14O21661268--+*------檸檬醛CitralC10H16O1521276-------+*-百里香酚ThymolC10H14O1501300+---+-+--優(yōu)葛縷酮EucarvoneC10H14O1501346--+*------丁子香酚EugenolC10H12O21641359++++-++++合計Total921681614613倍半萜化合物Sesquiterpeneγ-欖香烯 γ-ElemeneC15H242041342-++--++--α-古巴烯 α-CopaeneC15H242041382--++-++-+β-波旁烯 (-)-beta-BourboneneC15H242041393--++--+--(-)-β-欖香烯 (-)-β-ElemeneC15H242041396--++--+--(-)-α-古蕓烯 (-)-α-GurjuneneC15H242041418-++------β-依蘭烯 β-ylangeneC15H242041427+-++-++--石竹烯CaryophylleneC15H242041429+++++++++bata-古巴西烯 β-copaeneC15H242041438++++-++++γ-依蘭油烯 γ-MuuroleneC15H242041453++++--+--蛇麻烯 HumuleneC15H242041463+++++++++別香橙烯 AlloaromadendreneC15H242041471-+*-------(+)-表二環(huán)倍半水芹烯(+)-epi-BicyclosesquiphellandreneC15H242041472+-++--+-+右旋大根香葉烯Germacrene DC15H242041490+-++-++--BicyclogermacreneC15H242041504-+*-------α-金合歡烯 α-FarneseneC15H242041505+-----+--β-沒藥烯 β-BisaboleneC15H242041510+---+----β-姜黃烯 β-CurcumeneC15H242041512----+*----異喇叭烯 IsoledeneC15H242041521-++---+-+cis-β-金合歡烯 cis-β-FarneseneC15H242041526+---+----d-杜松烯 d-CadineneC15H242041529-+++--+--反式-α-香柑油烯 trans-α-BergamoteneC15H242041543+*--------α-依蘭油烯 α-MuuroleneC15H242041545-++------合計 Total11111511571436倍半萜氧化物Sesquiterpene oxide反式—橙花叔醇 trans-Nerolidol 2C15H26O2221562---+*-----表藍桉醇EpiglobulolC15H26O2221585+-++--++-(-)-桉油烯醇 (-)-SpathulenolC15H26O2221588-++---+-+丁香烯氧化物 Caryophyllene oxideC15H24O2201596-+----+++喇叭菜萜醇LedolC15H26O2221605--------+*葎草烯環(huán)氧化物ⅡHumulene epoxide ⅡC15H24O2201623--------+*CubedolC15H24O2201626--+---+--杜松醇α-CadinolC15H26O2221666--+---+--α-紅沒藥醇 α-BisabololC15H26O2221691----+*----喇叭烯氧化物 Ledene oxide-(Ⅱ)C15H24O2201700--+---+--合計Total125210624總計 Total33184631359291333

注：“+”代表這種物質(zhì)在該植物中有檢測到；“-”代表這種物質(zhì)在該植物中未檢測到；*表示該化合物在這一植物種特異存在

Note:“+” indicates that this compound was detected in the plant; “-” indicates that this compound was not detected in the plant;*indicates that the compound was specific to this plant species

圖2 9種芳香植物揮發(fā)性萜類總量 不同小寫字母表示9種芳香植物揮發(fā)性萜類含量存在顯著差異(P<0.05)Fig.2 Total volatile terpenes of nine aromatic plantsDifferent lowercase letters indicate that there are significant differences in volatile terpenes of nine aromatic plants(P<0.05)

利用SPSS軟件進行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，9種芳香植物間揮發(fā)性萜類總含量存在顯著差異。結(jié)果如圖2所示，迷迭香和藥用鼠尾草含量較高，均高于2 000 μg·g-1FW；藿香、美國薄荷、百里香和香蜂花揮發(fā)性萜類總含量在900～2 000 μg·g-1FW，且百里香與美國薄荷含量無顯著差異；牛至和鳳梨鼠尾草揮發(fā)性萜類總含量較低且無顯著差異；南歐丹參含量最低，僅為迷迭香總量的1%。依據(jù)本次檢測結(jié)果，我們認為牛至、鳳梨鼠尾草和南歐丹參因其揮發(fā)性萜類總量較低，不適宜作為提取揮發(fā)性萜類的材料。

2.2 9種芳香植物共有揮發(fā)性成分的比較

石竹烯和蛇麻烯是9種芳香植物的共有揮發(fā)性萜類(見圖3)。石竹烯也叫β-石竹烯，蛇麻烯也叫ɑ-石竹烯，石竹烯和蛇麻烯是同分異構(gòu)體，石竹烯含量除在鳳梨鼠尾草(34.96%)和香蜂花(17.42%)中比例較高外，其余7種芳香植物中其比例均小于3%。蛇麻烯在9種植物中相對含量普遍較低，均小于6%，在藥用鼠尾草中絕對含量明顯高于其他幾種植物。

圖3 9種植物的共有揮發(fā)性萜類成分的含量Fig.3 The content of common volatile terpenoids in nine plants

2.3 9種芳香植物的主要揮發(fā)性萜類成分的比較

9種芳香植物的主要揮發(fā)性萜類成分見表2，百里香中含量最高的化合物是γ-松油烯，為410.99±38.72 μg·g-1，占揮發(fā)性萜類總量的28.04%，其次是2-蒈烯、α-蒎烯、β-沒藥烯和百里醌。這些主要成分與馬莉等[18]報道的百里香精油中主要揮發(fā)性成分差異較大，可能是不同的提取方式和不同的提取時間導致的差異。

鳳梨鼠尾草的主要揮發(fā)性萜類成分是石竹烯、羅勒烯和芳樟醇。石竹烯已被證實對金黃色葡萄球菌有抑制作用，廣泛存在于多種芳香植物中[30]。迷迭香和藥用鼠尾草中含量最高的萜類均為桉樹醇，同時含有較多的α-蒎烯和莰烯。樟腦是藥用鼠尾草中含量第二高的成分，具有通竅、除濕、殺蟲止痛等功能[31]；α-蒎烯有抗腫瘤抗真菌等多種活性[32]；莰烯又稱樟腦萜，是合成樟腦和龍腦的原料，也可以用于合成殺蟲劑和防腐劑[33]。

牛至和南歐丹參中含量最高的化合物均為右旋大根香葉烯，除此之外牛至中還含有較多的反式—羅勒烯和別羅勒烯。右旋大根香葉烯被報道對蚊子、扁虱和蚜蟲等具有毒性[34]。

藿香中含量最高的化合物是D-檸檬烯，為(915.2±66.2) μg·g-1，占揮發(fā)性萜類成分的47.63%，其次是β-蒎烯和右旋香芹酮。3種萜類成分占總揮發(fā)性萜類的60%以上。D-檸檬烯在預防和治療癌癥方面具有明顯的活性[35]，因此近年引起了人們的廣泛關(guān)注。

美國薄荷中含量最高的化合物為2-蒈烯，其次是α-蒎烯和β-月桂烯。2-蒈烯、α-蒎烯和β-月桂烯均有較高的抗菌作用，因此也被廣泛利用。

香蜂花中含量最高的化合物是檸檬醛，為(665.65±5.02) μg·g-1，占揮發(fā)性萜類成分的69.80%，其次是石竹烯和香葉醇，3種成分占總揮發(fā)性萜類的93.05%。檸檬醛又名香葉醛，特異存在于香蜂花中，具有抗菌活性[36]和檸檬香味，作為食品香料廣泛用于需要檸檬香氣的各個方面。

表2 9種芳香植物的主要揮發(fā)性萜類成分

2.4 9種芳香植物的不同類型萜類組分的比較

9種芳香植物不同類型的揮發(fā)性萜類組分比例及含量有所不同。如圖4所示，所有測定的芳香植物中，倍半萜氧化物含量所占比例普遍較低。每種植物都具有優(yōu)勢成分，其中百里香、藿香、美國薄荷和迷迭香等4種植物的優(yōu)勢萜類組分是單萜化合物，鳳梨鼠尾草和南歐丹的優(yōu)勢萜類組分是倍半萜化合物，香蜂花和藥用鼠尾草的優(yōu)勢萜類組分是單萜氧化物。牛至中含有的單萜化合物和倍半萜化合物含量相近，單萜氧化物和倍半萜氧化物所占比例較低。

從絕對含量上看，如圖5所示，測定的芳香植物中揮發(fā)性萜類多集中在單萜化合物及氧化物，倍半萜氧化物含量最少?？傮w來看，除鳳梨鼠尾草、南歐丹參和香蜂花外，其他6種植物單萜類的含量明顯高于倍半萜類的含量。

3 討論

本實驗結(jié)果得出迷迭香、藥用鼠尾草、藿香、百里香和美國薄荷在萜類種類和含量上都相對較高，因此較適宜作為提取揮發(fā)性萜類的材料，而牛至、鳳梨鼠尾草和南歐丹參中揮發(fā)性萜類種類較少、含量較低，因此不適宜作為提取揮發(fā)性萜類的材料。雖然檢測到24種萜類成分特異存在于單一植物中，但是通過文獻比較并不是所有化合物都能在已報道的文獻中找到或同時找到，揮發(fā)性萜類化合物，作為次生代謝產(chǎn)物，其生物合成及代謝受外界環(huán)境的影響而變化，所以在不同生境下的同種植物很可能合成不同的次生代謝產(chǎn)物。因此，導致我們研究結(jié)果中部分物種的特異化合物與文獻報道有所差異，原因可能是由不同采集時間、不同采集地點以及對揮發(fā)性成分的不同提取方式等多種因素所導致的[37]。

圖4 9種芳香植物萜類組分比較Fig.4 Comparison of terpenoids in nine aromatic plants

9種植物的共有萜類成分是石竹烯和蛇麻烯，石竹烯和蛇麻烯常常同時出現(xiàn)在植物中，比如有報道在雪松松針和杜鵑葉中同時檢測到了石竹烯和蛇麻烯[37～38]。而9種芳香植物的主要成分存在明顯差異，相較而言迷迭香和藥用鼠尾草的主要成分相近，都含有桉樹醇，α-蒎烯，兩種植物的主要揮發(fā)性氣味相近，這與實際兩種植物在氣味上相近一致。

將9種芳香植物揮發(fā)性萜類成分，按照單萜類和倍半萜類分組后，我們發(fā)現(xiàn)，百里香、藿香、美國薄荷、迷迭香、香蜂花和藥用鼠尾草等6種植物的單萜類成分明顯高于倍半萜類。一般認為，植物萜類代謝途徑中單萜類成分是通過定位于質(zhì)體中的MEP途徑合成，倍半萜類成分是通過定位于胞質(zhì)的甲羥戊酸MVA途徑合成[39]。MEP途徑中提供牻牛兒基二磷酸GPP(C10)，被單萜合酶催化生成單萜類化合物；MVA途徑中提供法尼基二磷酸FPP(C15)，在倍半萜合成酶催化下生成倍半萜類化合物[16]。萜類合酶的數(shù)量、單個萜類合酶產(chǎn)生多種萜類化合物的能力以及萜類合酶對底物的親和力等都是造成植物揮發(fā)性萜類成分種類繁多豐富的原因[40]，因此上述芳香植物在正常環(huán)境中生成單萜類化合物的能力高于生成倍半萜類化合物的能力，可能與其含有的萜類合酶有關(guān)，我們的研究結(jié)果為芳香植物萜類生物合成途徑的解析，以及萜類合酶功能的鑒定提供了重要參考。

揮發(fā)性萜類物質(zhì)是芳香植物的主要活性物質(zhì)，也是重要的次生代謝產(chǎn)物。不同的芳香植物在萜類種類、含量及組分上存在一定的差異，通過對9種芳香植物萜類組分的分類比較和分析，不僅為芳香植物的合理開發(fā)和高效利用提供參考，同時也為植物萜類次生代謝研究提供依據(jù)。