白樺BpJMJ18基因啟動(dòng)子克隆及表達(dá)分析

王萬奇 齊婉竹 趙秋爽 曾 棟 劉 軼 付鵬躍 曲冠證 趙曦陽*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四平 136000； 3.北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 132013)

JMJ類蛋白是通過組蛋白的去甲基化以及與其他染色質(zhì)修飾互作等方式，參與許多基因表達(dá)和染色質(zhì)活動(dòng)的調(diào)控，進(jìn)一步影響生物生長發(fā)育、代謝和環(huán)境響應(yīng)等生物學(xué)過程[1]。JMJ類蛋白成員數(shù)目眾多，按照J(rèn)mjC結(jié)構(gòu)域的序列分析，可以將其分為7大類[2]：JARID類，具有H3K4去甲基化活性[3]；JMJD2亞家族，是H3K9和H3K36的去甲基化酶[4]；JHDM2類，能夠去除H3K9me2[5]；JMJD6類，只含有JmjC結(jié)構(gòu)域，能夠去除精氨酸甲基化[6]；UTX/JMJD3和JHDM1是動(dòng)物所特有的兩類蛋白[7]；而植物所特有的一類蛋白中，JMJ14成員是H3K4去甲基化酶基因，該基因在調(diào)控?cái)M南芥開花中扮演重要的角色，能夠與兩個(gè)NAC家族轉(zhuǎn)錄因子互作來影響植株的生長發(fā)育[8]。此外，JmjC結(jié)構(gòu)域?qū)儆贑upin超家族。JmjC結(jié)構(gòu)域蛋白可能是催化組蛋白修飾的蛋白質(zhì)羥化酶。同時(shí)，通過對(duì)本研究的JMJ18蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列除含有FRY、FYRC、JmjC、JmjN結(jié)構(gòu)域外，也含有C5HC2類的鋅指結(jié)構(gòu)域，而該結(jié)構(gòu)域極有可能與特定序列的DNA結(jié)合，發(fā)揮類似轉(zhuǎn)錄因子的作用。

JMJ蛋白功能最初是在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的，它能影響小鼠(Mus musculus)的大腦和心臟發(fā)育[9～10]，而植物中的JMJ蛋白雖然沒有動(dòng)物當(dāng)中研究的那么廣泛且深入，但就前人已有的研究發(fā)現(xiàn)JMJ蛋白能夠參與植物器官發(fā)育、生殖過程、激素應(yīng)答及DNA甲基化等多個(gè)生物學(xué)過程[11]。植物中最早發(fā)現(xiàn)的具有組蛋白去甲基化酶活性的是IBM1(即JMJ25)，它能影響植株的許多表型[12]；且到目前為止，JMJ蛋白的研究多數(shù)集中在擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)等草本植物中，例如：JHDM家族的JMJ12基因與擬南芥的花期有密切的關(guān)系[13]；水稻中的組蛋白去甲基化酶JMJ705可以通過提高抗性基因的表達(dá)來去除H3K27的甲基化，進(jìn)而提高水稻對(duì)白葉枯病的抗性[14]；JMJ706基因突變后能夠引起水稻花器官發(fā)育異常，進(jìn)而影響花器官的形態(tài)建成[2]；OsJMJ718基因在水稻的生殖發(fā)育階段也能夠呈現(xiàn)不同的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式[15]；JMJ703突變后能夠影響植物細(xì)胞分裂，從而使莖干和幼穗發(fā)育受到影響[16]。綜上所述，不同植物中JMJ基因功能不盡相同，但均表明該基因與植物生長發(fā)育密切相關(guān)。

白樺(Betulaplatyphylla)是樺木科(Betulaceace)樹種落葉喬木，是我國東北地區(qū)重要的闊葉落葉林及針葉闊葉混交林中常見樹種，其具有生長快、木材細(xì)膩、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是東北地區(qū)木材生產(chǎn)的重要材料，具有極高的研究和利用價(jià)值[17]。由于白樺全基因組已被測定[18]，很多基因功能的開發(fā)與驗(yàn)證均以白樺為基礎(chǔ)材料，例如：楊洋以白樺為實(shí)驗(yàn)材料來研究BpTCP基因在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮的作用，進(jìn)而揭示BpTCP基因的生物學(xué)功能[19]；李蕾蕾等[20]為了解GT14基因在生長發(fā)育過程中的功能及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，選取白樺為材料，對(duì)該基因的啟動(dòng)子進(jìn)行了相關(guān)的研究；同時(shí)，王宇航[21]也以白樺的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)檠芯繉?duì)象,對(duì)基因的表達(dá)和功能進(jìn)行了初步研究，但到目前為止對(duì)JMJ類基因在木本植物中的功能研究較少。本研究以白樺為研究對(duì)象，對(duì)BpJMJ18基因的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆，通過構(gòu)建植物表達(dá)載體，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法及原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，研究其BpJMJ18基因的組織表達(dá)模式以及BpJMJ18蛋白定位區(qū)域，為后續(xù)進(jìn)一步研究JMJ18基因在植物生長發(fā)育方面的功能奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2016年4月在東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種白樺強(qiáng)化育種基地，采集4年生的白樺優(yōu)樹嫩葉建立組培體系，并獲得白樺組培苗。本研究選取生長1個(gè)月左右的組培苗進(jìn)行白樺GUS組織化學(xué)染色，同時(shí)依次選取組培苗經(jīng)盆栽生長2個(gè)月植株的頂芽、幼葉、成熟葉、初生莖、過渡莖、成熟莖及根進(jìn)行不同組織部位的特異性表達(dá)分析。

1.2 主要試劑及菌株

TransStart?FastPfu Fly DNA Polymerase購自全式金；同源重組酶Mut Express? Ⅱ Fast Mutagenesis Kit V2購自諾唯贊公司；Plasmid mini Kit Ⅰ、Gel extraction kit購自杭州博日科技(Bioer)有限公司；DNA Marker DL5000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ、DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ等均購自TaKaRa公司(大連)；大腸桿菌感受態(tài)(Trans1-T1)購自TransGen Biotech公司；農(nóng)桿菌感受態(tài)(GV3101)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；pBI101-35S::GUS載體質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室提供，其他實(shí)驗(yàn)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白樺BpJMJ18基因組織特異性表達(dá)分析

利用CTAB法[22]分別提取盆栽生長2個(gè)月白樺頂芽、幼葉、成熟葉、初生莖、過渡莖、成熟莖及根的RNA，利用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10倍作為定量PCR的模板，選用18S基因作為內(nèi)參，其在NCBI網(wǎng)站的登錄號(hào)為：MK388236.1，來檢測目的基因在不同組織部位的表達(dá)情況。定量PCR使用的相關(guān)引物如下表1所示，反應(yīng)體系為：20 μL；其中2×SYBR Green 10 μL，ROX Dye Ⅱ 0.4 μL，正向引物(JMJ18-RT-F)和反向引物(JMJ18-RT-R)各0.8 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 35 s；40cycle；95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，并通過2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

Table 1 Primer sequence of the quantitative real-time PCR

編號(hào)No.引物名稱Name引物序列Sequence1JMJ18-RT-FJMJ18-RT-RCCGAGGCAGTTAATGTAGCTCAATCCCATCCTTTCCACAGAC218S-RT-F18S-RT-RATCTTGGGTTGGGCAGATCGCATTACTCCGATCCCGAAGG

1.3.2 白樺BpJMJ18基因啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)已知的BpJMJ18基因在擬南芥中的序列，其在擬南芥Tair網(wǎng)站的命名為At1g30810，與白樺基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，克隆了白樺BpJMJ18基因上游1 932 bp的啟動(dòng)子區(qū)域，并設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。上、下游引物序列分別為BpJMJ18-promoter-F：5′-FATCAAGCTTAGTCAAAGCATCCTATGAAAACCCAGC-3′(下劃線處為HindⅢ酶切位點(diǎn))；BpJMJ18-promoter-R：5′-ATCAAGCTTAGTCAAAGCATCCTATGAAAACCCAGC-3′(下劃線處為HindⅢ酶切位點(diǎn))；以白樺組培苗葉片基因組DNA為模板擴(kuò)增全長啟動(dòng)子序列，PCR反應(yīng)體系為50 μL，含10 μL 5×pfu Buffer、4 μL 2.5 mmol·L-1High pure dNTPs、1.0 μL上游引物(BpJMJ18-promoter-F)、1.0 μL下游引物(BpJMJ18-promoter-R)、2.0 μL模板、1.0 μL pfu酶、31 μL ddH2O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)完成后將產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 白樺BpJMJ18基因啟動(dòng)子序列分析

利用PLACE數(shù)據(jù)庫(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE)和Plant CARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.Be/webtools/plantcare/html)在線分析軟件，對(duì)BpJMJ18基因進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析。

1.3.4 pBI101-BpJMJ18pro::GUS載體構(gòu)建及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

通過1.3.1中引物擴(kuò)增目的片段，連接pEASY-Blunt載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1，隨機(jī)挑取6個(gè)單克隆，進(jìn)行PCR檢測并送至擎科生物公司測序保存。將測序結(jié)果正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ對(duì)pEASY-Blunt-BpJMJ18-promoter和pBI101-35S::GUS質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，分別回收目的片段，利用TaKaRa公司的SolutionⅠ進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測，將獲得的陽性轉(zhuǎn)化子菌液送公司測序，保存測序正確的重組質(zhì)粒，命名為：pBI101-BpJMJ18pro::GUS。最后采用液氮凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，挑取單克隆經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。

參考李萌[23]等瞬時(shí)轉(zhuǎn)化白樺的方法，并修改如下：將pBI101-BpJMJ18pro::GUS菌種接種到7 mL含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，28℃ 180 r·min-1震蕩過夜進(jìn)行活化培養(yǎng)；第二天接種活化好的菌液于100 mL含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，28℃ 180 r·min-1震蕩培養(yǎng)至OD600=0.5，收集菌體，用1/2MS液體培養(yǎng)基將菌體進(jìn)行重懸，使其OD600=0.8，取長勢良好的白樺組培苗放入制備好的菌液中，25℃ 120 r·min-1培養(yǎng)2 d，每間隔16 h更換1次1/2MS液體培養(yǎng)基。

1.3.5 GUS組織化學(xué)染色分析

將瞬時(shí)侵染后的白樺苗放置于GUS染液中(配方如下：100 mL 50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，0.372 g 10 mmol·L-1EDTA·2 Na溶液，100 μL 0.1% Triton X-100，0.016 5 mg 0.5 mmol·L-1亞鐵氰化鉀，0.021 1 mg 0.5 mmol·L-1鐵氰化鉀，500 μL 1 mg·L-1X-Gluc)，進(jìn)行GUS染色，37℃條件下避光溫浴過夜培養(yǎng)，將植株置于脫色液中脫色6～8 h(脫色液∶無水乙醇∶冰乙酸=3∶1)，期間及時(shí)更換脫色液。待脫色完全后，通過顯微鏡觀察BpJMJ18基因啟動(dòng)子的表達(dá)情況并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺BpJMJ18基因組織特異性表達(dá)分析

為了研究白樺BpJMJ18基因在各個(gè)組織部位的表達(dá)情況，提取白樺頂芽、幼葉、成熟葉、初生莖、過渡莖、成熟莖及根的total RNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果如圖1所示。表明BpJMJ18基因在各個(gè)組織部位中均有所表達(dá)，且BpJMJ18基因的表達(dá)模式在根和幼葉中的表達(dá)水平高于其他組織部位，在成熟莖的表達(dá)量相對(duì)較低，上述結(jié)果說明BpJMJ18基因在植株的根和葉中表達(dá)更為廣泛。

圖1 BpJMJ18基因在白樺不同組織表達(dá)分析Fig.1 Expression analysis of BpJMJ18 gene in different tissues of B.platyphylla

2.2 白樺BpJMJ18基因啟動(dòng)子的克隆

通過上述組織特異性表達(dá)分析結(jié)果，利用PCR技術(shù)從白樺葉片中擴(kuò)增出長度為1 932 bp的目的片段(見圖2A)，膠回收目的片段后連接pEASY-Blunt載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)，隨機(jī)挑取6個(gè)單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(見圖2B)。將菌液檢測成功的轉(zhuǎn)化子送公司進(jìn)行測序，結(jié)果表明插入目的片段未發(fā)生堿基突變，成功克隆BpJMJ18基因啟動(dòng)子。

2.3 白樺BpJMJ18基因啟動(dòng)子的序列分析及元件預(yù)測

利用PLACE和Plant CARE數(shù)據(jù)庫對(duì)1 932 bp啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件預(yù)測分析，結(jié)果如圖3所示，該序列中除含有TATA-box和CAAT-box等基本順式作用元件外，還具有光響應(yīng)元件如G-Box、Box4、GT1-motif、TCT-motif；參與脫落酸反應(yīng)的元件ABRE；MEJA反應(yīng)的調(diào)節(jié)元件CGTCA-motif；厭氧誘導(dǎo)所必須的調(diào)節(jié)元件ARE；赤霉素和生長素響應(yīng)元件P-box、TGA-element；除上述相關(guān)的響應(yīng)元件外，BpJMJ18啟動(dòng)子還具有分生組織表達(dá)相關(guān)作用元件CAT-box(見表2)。由此可以推測BpJMJ18啟動(dòng)子可能在空間表達(dá)過程中受到光周期的調(diào)控、參與多種植物激素的響應(yīng)，具有多種生物學(xué)功能，在植物生長發(fā)育過程中扮演不同角色。

2.4 pBI101-BpJMJ18pro::GUS載體構(gòu)建

將測序正確的pEASY-Blunt-BpJMJ18pro菌液提取質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ對(duì)pEASY-Blunt-BpJMJ18pro和pBI101-GUS進(jìn)行單酶切(見圖4A)，回收目的片段，利用TaKaRa公司的SolutionⅠ進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Trans1-T1)，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(見圖4B)，檢測正確的轉(zhuǎn)化子送擎科公司進(jìn)行測序，結(jié)果表明插入的BpJMJ18啟動(dòng)子序列未發(fā)生堿基突變，至此植物表達(dá)載體構(gòu)建完成，構(gòu)建示意圖如圖4所示，并命名為pBI101-BpJMJ18pro::GUS。然后將pBI101-BpJMJ18pro::GUS質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中，隨機(jī)挑選單克隆進(jìn)行PCR檢測(見圖4C)。

圖2 白樺BpJMJ18基因啟動(dòng)子的克隆及鑒定 A. BpJMJ18啟動(dòng)子的克隆(M. DNA marker DL5000；1.JMJ18啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)；B.pEASY-BpJMJ18pro載體在大腸桿菌菌液中的PCR檢測(M. DNA marker DL5000；1～6.pEASY-BpJMJ18pro轉(zhuǎn)化子的菌液PCR檢測；7.陰性對(duì)照)Fig.2 The clone and verification of BpJMJ18 gene promoter from B.platyphylla A. The cloning of BpJMJ18 promoter(M. DNA marker DL5000; 1. PCR amplification product of JMJ18 promoter); B. PCR detection of pEASY-BpJMJ18pro vector in E.coli(M. DNA marker DL5000; 1-6. PCR detection of pEASY-BpJMJ18pro transformants; 7.Negative control)

圖3 BpJMJ18啟動(dòng)子作用元件示意圖Fig.3 BpJMJ18 promoter action element diagram

2.5 白樺BpJMJ18基因啟動(dòng)子瞬時(shí)轉(zhuǎn)化及活性分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證BpJMJ18啟動(dòng)子在白樺中的表達(dá)活性，我們將用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法侵染白樺組培苗，進(jìn)行了3次重復(fù)試驗(yàn)并通過GUS染色觀察其表達(dá)特征。結(jié)果如圖5A所示，發(fā)現(xiàn)BpJMJ18啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在白樺的主根、側(cè)根、根尖、葉片的維管束和嫩莖中均檢測到表達(dá)，在老莖中表達(dá)水平較低，而未經(jīng)過侵染的野生型白樺未檢測到GUS活性(見圖5:B～E)，這與前人在擬南芥中進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式。說明BpJMJ18啟動(dòng)子具有驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)活性的能力，并在白樺植株的各個(gè)組織部位中發(fā)揮作用進(jìn)而影響植株的生長發(fā)育。

表2 BpJMJ18啟動(dòng)子中順式作用元件

圖4 植物表達(dá)載體pBI101-BpJMJ18pro::GUS的構(gòu)建及驗(yàn)證 A.限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物的結(jié)果(M. DNA marker DL5000；1.pEASY-Blunt-BpJMJ18pro單酶切條帶；2.質(zhì)粒pBI101-GUS的單酶切條帶)；B.植物表達(dá)載體pBI101-BpJMJ18pro::GUS的菌液PCR檢測(M. DNA marker DL5000；1～7.pBI101-BpJMJ18pro::GUS菌液的PCR產(chǎn)物；8.陰性對(duì)照)；C. GV3101-pBI101-BpJMJ18pro::GUS的菌液PCR檢測(M. DNA marker DL5000；1～9.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的菌液PCR檢測；10.陰性對(duì)照)Fig.4 The construction and verification of plant expression vector pBI101-BpJMJ18pro::GUS A.Electrophoretogram of restriction enzymes digestion(M. DNA marker DL5000; 1.Digestion of pEASY-Blunt-BpJMJ18pro with HindⅢ; 2.Digestion of pBI101-GUS vector with HindⅢ); B.PCR detection of plant expression vector pBI101-BpJMJ18pro::GUS(M. DNA marker DL5000; 1-7.PCR products of pBI101-BpJMJ18pro::GUS vector; 8.Negative control); C.PCR detection of GV3101-pBI101-BpJMJ18pro::GUS(M. DNA marker DL5000; 1-9.PCR products of transformants in Agrobacterium; 10.Negative control)

圖5 BpJMJ18在白樺中的活性分析 A.白樺組培苗；B.頂芽；C.莖；D.第三葉片；E.根Fig.5 BpJMJ18 promoter action element diagram A.Birch tissue culture seed; B.Apical bud; C.Stemt; D.Stem; D.Leaf; E.Root

4 討論

JMJ類家族蛋白含有JmjC保守結(jié)構(gòu)域，編碼JmjC結(jié)構(gòu)域蛋白的基因在許多生物體中代表了一個(gè)大的基因家族，如：人類中有30個(gè)基因，小鼠中有30個(gè)基因，酵母中有12個(gè)基因[24]。在植物中，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，21個(gè)擬南芥基因和20個(gè)水稻基因編碼JmjC結(jié)構(gòu)域蛋白[25～26]。通過上述大量基因研究表明JMJ家族蛋白在不同的生物學(xué)過程中可能扮演一個(gè)重要的作用。因此，本研究從白樺基因組中鑒定出了一個(gè)編碼JmjC結(jié)構(gòu)域的基因BpJMJ18，并分析了該基因的組織特異性表達(dá)模式，結(jié)果表明它在各個(gè)組織部位中均有所表達(dá)，且在根和幼葉中的表達(dá)水平高于其他組織部位，上述結(jié)果說明BpJMJ18基因可能參與了植物的生長發(fā)育過程。由于啟動(dòng)子中的順式作用元件對(duì)于基因的時(shí)空表達(dá)及表達(dá)量都具有重要的調(diào)控作用[27～28]，我們克隆了JMJ18基因的啟動(dòng)子序列，通過在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，該序列具有多個(gè)TATA-box和CAAT-box核心啟動(dòng)元件，說明其具有典型啟動(dòng)子的特征。

啟動(dòng)子除具有典型的核心啟動(dòng)元件外，還有眾多與基因功能相關(guān)的調(diào)節(jié)元件。因此，在相近基因的啟動(dòng)子序列中，應(yīng)該存在很多一致的順式作用元件。張俊飛等[1]克隆分析玉米JMJ15基因啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)，在啟動(dòng)子序列內(nèi)含有多個(gè)光響應(yīng)、激素響應(yīng)和逆境響應(yīng)等相關(guān)元件。湯小鳳[29]克隆的楊樹PtrJMJ25基因啟動(dòng)子中對(duì)光處理有很強(qiáng)的響應(yīng)，存在光響應(yīng)元件。本研究也得到了類似的結(jié)果，在BpJMJ18基因啟動(dòng)子序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)多個(gè)光響應(yīng)元件(G-Box、Box4)和激素(P-box、TGA-element)、逆境響應(yīng)(ABRE、CGTCA-motif)相關(guān)的元件。其中，ABRE和CGTCA-motif分別是與植物生長相關(guān)、逆境響應(yīng)相關(guān)的元件，這些結(jié)果預(yù)示著BpJMJ18基因?qū)τ谥参锏纳L發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。此外，研究BpJMJ18啟動(dòng)子序列相關(guān)的順式作用元件為揭示BpJMJ18基因功能具有重要的參考價(jià)值。因此本文主要圍繞BpJMJ18基因啟動(dòng)子是否具有啟動(dòng)活性功能展開。

目前，能夠準(zhǔn)確分析啟動(dòng)子活性和組織表達(dá)特異性的方法是穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化法，例如：Eun-HyeHong[26]等人通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法將JMJC家族中AtJMJ3、AtJMJ4、AtJMJ6、AtJMJ7、AtJMJ8、AtJMJ9、AtJMJ10、AtJMJ11等基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)該家族基因均在擬南芥的種子、花、葉片、莖的分生組織和根中有所表達(dá)。同時(shí)觀察GUS組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)不同基因在相同組織表達(dá)部位也有所差異。Hongchun Yang[30]等人將AtJMJ18基因的啟動(dòng)子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到擬南芥中，GUS染色發(fā)現(xiàn)該基因在擬南芥的根韌皮部、莖、子葉、幼葉、成熟葉和花中均有表達(dá)，在根和葉片中表達(dá)更廣泛。但是此方法操作復(fù)雜、周期較長且必須獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系才能進(jìn)行下一步的相關(guān)研究。相對(duì)于此方法而言，本文所使用的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法能夠在短時(shí)間內(nèi)就可以分析哪些啟動(dòng)子序列是調(diào)節(jié)基因表達(dá)所必需的；它簡單、方便，并且能夠快速鑒定啟動(dòng)子的活性及相應(yīng)的表達(dá)部位。本研究采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法將含有BpJMJ18啟動(dòng)子序列的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到白樺中，并對(duì)瞬時(shí)侵染后的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS染色分析。結(jié)果表明，BpJMJ18基因能夠驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在主根、側(cè)根、根尖、葉片的維管束和嫩莖中均檢測到特異表達(dá)并且在成熟莖中有較弱的表達(dá)，這和Hongchun Yang[31]等發(fā)現(xiàn)的擬南芥根的韌皮部、莖、子葉、幼葉、成熟葉和花中均有所表達(dá)的研究結(jié)果類似。綜上研究結(jié)果說明白樺BpJMJ18基因的啟動(dòng)子序列具有典型的高等植物啟動(dòng)子特征，能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的白樺中特異定位表達(dá)，表明該基因的啟動(dòng)子具有啟動(dòng)活性，并且存在組織特異性。

綜上所述，本研究利用PCR技術(shù)克隆白樺BpJMJ18基因啟動(dòng)子，通過順式作用元件預(yù)測分析及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)對(duì)BpJMJ18探其功能提供了新思路，為進(jìn)一步的研究BpJMJ18基因?qū)Π讟迳L發(fā)育方面的影響奠定理論基礎(chǔ)。對(duì)于BpJMJ18基因啟動(dòng)子的研究發(fā)現(xiàn)它在植物生長發(fā)育過程中可能參與了不同的生物學(xué)過程，具體的功能還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。