切應(yīng)力對腦血管內(nèi)皮細胞Notch通路表達的影響

古冬金,蘇小康,王 帥,鄭賢美,李黎明

(東北大學生命科學與健康學院生物技術(shù)研究所,沈陽 110819;*通訊作者,E-mail:liming-li2000@163.com)

腦動靜脈畸形(brain arteriovenous malformation,BAVM)是一種動脈與靜脈之間不經(jīng)過毛細血管而直接相連產(chǎn)生的血管畸形[1]。其臨床癥狀為疼痛、出血、靜脈高壓或缺血,但也可能沒有臨床表現(xiàn)[2]。流體切應(yīng)力是通過血液流動在血管壁上產(chǎn)生的摩擦力,對血管的發(fā)育有著重要的作用。管腔內(nèi)的循環(huán)血液和管壁內(nèi)層的內(nèi)皮細胞單層不斷受到由血液流動引起的切應(yīng)力[3]。這種機械刺激引起各種細胞反應(yīng),包括決定細胞活性的基因表達變化和蛋白質(zhì)改變[4]。BAVM病灶的不斷發(fā)展與其畸形血管中異常的血流動力學環(huán)境有關(guān)[5]。Notch信號通路包括Notch受體(Notch1-4)、Notch配體(Delta-like 1, 3, 4和Jagged1, 2)以及下游基因(Hes和Hey)。Notch信號通路表達異常可導(dǎo)致BAVM發(fā)生,有研究表明在人BAVM病變組織中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達明顯升高,并且抑制VEGF傳導(dǎo)可以延緩BAVM形成。此外,也有研究表明切應(yīng)力的作用可以激活內(nèi)皮細胞Notch通路,切應(yīng)力通過調(diào)控Notch通路來調(diào)節(jié)動靜脈分化過程[6]。因此,我們推測血管微環(huán)境的變化可以影響血管的新生發(fā)育,切應(yīng)力可以激活VEGF,進而上調(diào)Notch信號通路。

本研究選取腦血管內(nèi)皮細胞(brain microvascular endothelial cells,MECs)為研究對象,利用平行平板流動腔,通過改變切應(yīng)力作用大小和作用時間,探究切應(yīng)力對Notch 通路的影響,進而分析切應(yīng)力與Notch 信號通路在BAVM的發(fā)展過程中所起的作用,為BAVM 致病機制及治療手段的進一步研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

本實驗采用的MEC細胞系,購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司;平行平板流動腔,購自上海泉眾機電科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司),胎牛血清(美國Invitrogen公司),胰蛋白酶(美國Gibco公司),Notch1 抗體(Abcam公司,美國),Hes1抗體(Abclonal公司,美國),VEGF抗體(Abclonal公司,美國),Dll4抗體(Abclonal公司,美國),GAPDH抗體(Abclonal公司,美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)

血管MEC細胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)、添加10%標準胎牛血清、1%的青鏈霉素,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 流體切應(yīng)力加載

平行平板流動腔系統(tǒng)用于流體切應(yīng)力加載。該系統(tǒng)包括蠕動泵、儲液瓶、管道及流室。流室流道高度0.03 cm、細胞沿中軸方向種植于7.5 cm×2.4 cm×0.01 cm(長×寬×高)、經(jīng)過0.1 g/L多聚賴氨酸包被的玻璃載玻片上。通過此裝置,細胞可接受到穩(wěn)定的層切應(yīng)力刺激。采用τ=6μQ/WH2計算切應(yīng)力強度。其中μ為培養(yǎng)基表觀黏度,Q為流量,W為流槽寬度,H為流槽高度。本實驗通過調(diào)節(jié)恒流泵轉(zhuǎn)速改變Q值,達到實驗所需切應(yīng)力大小。

1.4 實驗分組

本實驗切應(yīng)力大小為5,10,15 dyn/cm2層流切應(yīng)力,加載時間為3,6,12 h。實驗分靜止對照組(0 dyn/cm2組)和切應(yīng)力5 dyn/cm2組、10 dyn/cm2組和15 dyn/cm2組,各組分別在作用3,6,12 h后檢測蛋白表達。

1.5 Western blot檢測VEGF、Notch1、Dll4和Hes1的表達

將蠕動泵中載玻片置于干凈培養(yǎng)皿中,提取蛋白,采用BCA 法測定蛋白濃度。樣品中加入上樣緩沖液煮沸10 min,然后行SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜90 min,于室溫下5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂牛奶中封閉1 h,將膜置入一抗(VEGF 1 ∶1 000,Notch1 1 ∶1 000, Dll4 1 ∶1 000,Hes1 1 ∶1 000,GAPDH 1 ∶1 000),于4 ℃孵育過夜,經(jīng)PBST 清洗3 次,于室溫下HRP標記的二抗中孵育1 h,經(jīng)PBST 清洗3次后,加入ECL化學發(fā)光液顯色,于化學發(fā)光系統(tǒng)檢測。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 切應(yīng)力作用3 h對Notch通路的影響

對MEC施加5,10,15 dyn/cm2層流切應(yīng)力處理3 h后提取細胞蛋白,通過Western blot檢測Notch 通路相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果顯示VEGF、Notch1、Dll4 和Hes1蛋白表達量在切應(yīng)力大小為10 dyn/cm2時最高(P<0.05,見圖1)。

2.2 切應(yīng)力作用6 h對Notch通路的影響

對MEC經(jīng)5,10,15 dyn/cm2切應(yīng)力處理6 h后,通過Western blot檢測VEGF和Notch通路相關(guān)蛋白的表達,結(jié)果顯示VEGF、Notch1、Dll4 和Hes1在切應(yīng)力強度為15 dyn/cm2時表達量最高(P<0.05,見圖2)。

2.3 切應(yīng)力作用12 h對Notch通路的影響

在MEC 經(jīng)5,10,15 dyn/cm2切應(yīng)力處理12 h后提取細胞蛋白,通過Western blot檢測Notch通路相關(guān)蛋白的表達,結(jié)果顯示VEGF、Notch1、Dll4 和Hes1的表達量最高時為切應(yīng)力大小為15 dyn/cm2時(P<0.05,見圖3)。

與靜止對照組(0 dyn/cm2)比較,*P<0.05圖1 切應(yīng)力作用3 h后對Notch通路相關(guān)蛋白表達的影響Figure 1 Effect of shear stress on the expression of Notch signaling pathway-related proteins after MECs being cultured for 3 h

與靜止對照組(0 dyn/cm2)比較,*P<0.05圖2 切應(yīng)力作用6 h后對Notch通路相關(guān)蛋白表達的影響Figure 2 Effect of shear stress on the expression of Notch signaling pathway-related proteins after MECs being cultured for 6 h

與靜止對照組(0 dyn/cm2)比較,*P<0.05圖3 切應(yīng)力作用12 h后對Notch通路相關(guān)蛋白表達的影響Figure 3 Effect of shear stress on the expression of Notch signaling pathway-related proteins after MECs being cultured for 12 h

3 討論

近年來有關(guān)生物組織應(yīng)力-生長關(guān)系研究表明,從器官、組織到細胞、亞細胞等各個層次上的生命運動都需要一定力學環(huán)境作為基礎(chǔ)。細胞與組織的結(jié)構(gòu)、活動及其功能與其所處的力學環(huán)境密切相關(guān)。腦血管內(nèi)皮細胞與血流直接接觸,血流對血管內(nèi)皮細胞的作用除了供應(yīng)營養(yǎng)外,其作為流體對血管內(nèi)皮細胞也有著多種機械力作用,而在這其中,作為血管內(nèi)皮細胞所處力學環(huán)境的一個重要組成部分,切應(yīng)力的作用至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)切應(yīng)力作用可激活血管內(nèi)皮細胞Notch信號通路,在切應(yīng)力環(huán)境中培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞30 min后即可在其細胞核檢測到NICD段[7],表明切應(yīng)力作用下細胞Notch 通路被激活。

在BAVM的畸形血管中常存在異常升高的血流切應(yīng)力作用。我們通過改變切應(yīng)力的作用大小和作用時間,觀察切應(yīng)力對Notch通路相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果表明,切應(yīng)力可以顯著上調(diào) Notch通路相關(guān)蛋白的表達。本次實驗中,在切應(yīng)力作用下,VEGF的表達上升,且在切應(yīng)力作用時間相對較短(≤3 h),切應(yīng)力大小為10 dyn/cm2時達到最大,而后隨著作用時間(≥6 h)的延長,VEGF的表達量隨著作用力強度的增加而增加。有研究發(fā)現(xiàn)相較于血流正常的低切應(yīng)力血管,在高血流切應(yīng)力血管中,血管內(nèi)皮細胞VEGF表達量顯著增高[8]。這與本實驗的研究結(jié)果相一致,隨著切應(yīng)力作用時間的延長,在10 dyn/cm2和15 dyn/cm2作用強度下,VEGF表達量顯著增高。同樣,隨著切應(yīng)力作用時間的延長(≥6 h),作用強度的增加(≥10 dyn/cm2),Notch1蛋白的表達量較對照組也顯著增高。實驗結(jié)果表明,10 dyn/cm2以上切應(yīng)力的作用會導(dǎo)致細胞中Notch1 蛋白表達量顯著增加,且這種作用是呈切應(yīng)力劑量依賴性。這說明切應(yīng)力作用對腦血管內(nèi)皮細胞Notch1 蛋白表達有促進作用,在長時間的高切應(yīng)力作用下,腦血管內(nèi)皮細胞Notch1蛋白表達量增加,血管內(nèi)皮Notch 通路變得更易被活化,這可能是造成BAVM畸形血管中靜脈發(fā)生動脈化的原因之一。

Dll4是Notch蛋白的配體,有研究發(fā)現(xiàn)在BAVM畸形血管內(nèi)皮細胞中Notch 配體表達量顯著高于正常組織[9]。本次實驗中,Notch蛋白的配體Dll4蛋白隨著切應(yīng)力強度和作用時間的增加而表達量增加,說明高切應(yīng)力作用可能會通過提高血管內(nèi)皮細胞表面Notch配體數(shù)量,來激活其Notch信號通路。Notch蛋白發(fā)生剪切后,Notch胞內(nèi)段(Notch intracellular domain,NICD)轉(zhuǎn)運進入細胞核后組裝形成轉(zhuǎn)錄激活物,進而激活Hes1的轉(zhuǎn)錄,起始Notch通路下游基因的表達[10]。而此次實驗中Hes1蛋白的表達水平隨著切應(yīng)力和作用時間的增加而增高,一定程度上也反映了Notch通路的激活情況。

總之,BAVM由于動靜脈短路而產(chǎn)生高血流切應(yīng)力,同時,短路動靜脈畸形中高血流帶來高靜脈壓,其中靜脈部分不斷擴張并發(fā)生纖維化,一方面增加血管破裂風險,另一方面又進一步降低了血管中的阻力,形成負反饋過程不斷加重畸形血管中的高血流狀態(tài)。而切應(yīng)力作用后Notch1蛋白被激活。同時,細胞在切應(yīng)力作用下培養(yǎng)一段時間后,其Notch1、Dll4以及Hes1蛋白的表達量均相對于靜止培養(yǎng)時(對照組)的表達量明顯上調(diào)。血管內(nèi)皮細胞受到持續(xù)高切應(yīng)力刺激上調(diào)VEGF,誘導(dǎo)Notch1與Dll4表達上調(diào),Dll4激活相鄰細胞的Notch通路,導(dǎo)致BAVM不斷發(fā)展并產(chǎn)生畸形的動脈化靜脈血管。因此,我們的研究結(jié)果為預(yù)防和治療腦動靜脈畸形提供了新的目標和思路。